Westernblot所需溶液的配制

Western blot 实验所需试剂配制方法

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WB 所需溶液的配制

1 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (Running buffer) 5× Tris base 15.14g

Glycine(甘氨酸) 72.0g

SDS 5.0g

蒸馏水 溶解至1000ml

5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris 碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS ，双蒸水定容至1L ，pH 值为8.3。使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml 。

2 转膜缓冲液 （Sending buffer ）（现用现配） 1000 ml 1500 ml

Glycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g

1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml

10% SDS 1 ml 1.5 ml

甲醇 (methanol) 200 ml 300 ml

蒸馏水 溶解至1000 ml 溶解至1500 ml

必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS 。

3 10% SDS 配置

电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS （Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C 12H 25O 4NaS ）溶液: 10g SDS ，100ml 去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH 到7.2，室温保存。

4 Tris.HCl 的配置

1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml 水中

浓盐酸调pH 到8.8

1.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml 水中

浓盐酸调pH 到8.8

1.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml 水中

浓盐酸调pH 到6.8

1.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml 水中 浓盐酸调pH 到8.3，

需要大约8毫升。

Western blot 实验所需试剂配制方法

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注：Tris 的分子量是121.4. 4度储存。

5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置

称取1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml ，分装到1.5ml 微量离心管中，负30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。

6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置

加HCl 调pH 到7.6，室温储存。

7 TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置

8 上样缓冲液（loading buffer ）的配置

SDS-PAGE 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液8ml ，甘油6.4ml ，10%SDS 12.8ml

，巯基乙醇3.2ml ，0.05%溴酚蓝1.6ml ，H2O 32ml 混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min 混匀后再上样，一般为20-25ul ，总蛋白量100μg 。

9 stacking gel buffer (4×)

10 5×Sample buffer (10ml)

Western blot 实验所需试剂配制方法

页脚内容 室温储存

11 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST 配制牛奶

5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA

0.01% antifoam A (Sigma)

0.01%(v/v) sodium azide

12 丽春红溶液：

100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。

1）4%多聚甲醛（PFA ）的配制 （1000毫升）

40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS ，加水定容到1000毫升。调pH 到7.2-7.4。通风橱过滤，4度保存。

13 组织裂解液

10mM Tris- HCl (pH 7.4) 48.44mg 粉末或1M Tris- HCl 0.4ml 150mM NaCl 350.6 mg 1% TritonX-100 0.4 ml 100% 1% 去氧胆酸钠（Sodium dexycholate ） 400 mg 5mM EDTA 74.4 mg 或0.25M EDTA 3.2 ml 1% SDS 10% SDS 0.4 ml PMSF (难溶解) 7 mg 蛋白酶抑制剂 1片/10ml 步骤：

首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH 使溶解，再调pH 至 7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴口罩。

14. PBS 的配制（1000毫升） （PH 7.2~7.4）

NaCL

8.00g KCL

0.20g Na 2HPO 4.12H 2O

（或 Na 2HPO 4.H 2O)

3.455g 或 （1.56 g ） KH 2 PO 4 0.20g

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3xeq.html