聚合酶链式反应技术(PCR)

聚合酶链式反应技术

关键词：核酸标记

通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。主要有以下几种方法：

1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northern blot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。

2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。

3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。

核酸扩增检测技术的研究进展

(作者 傅占江 来源 摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》)

聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。这些方法的区别见表1。

表1 不同核酸扩增技术的特性

fig2058

BDNA：枝状DNA,LCR：连接酶链式反应；NASBA：依赖性核酸序列的扩增；PCR：聚合酶链式反应；RCA：滚环扩增：RT-PCR：逆转录PCR; SDA: 链替代扩增；SNP：单核苷酸多态性：TMA：转录依赖的扩增；Invader:侵染检测技术

1 反应（PCR）

在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。美国食品与与药品管理局（FDA）已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒（Roche）,如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。研究报道这些试剂盒的应用结果优于bDNA、NASBA扩增技术。

最近，PCR技术的最大突破就是对单管PCR产物进行实时荧光定量检测，该方法提高了灵敏度与特异性，并且易于操作。如TaqMan就是采用这种技术，两端分标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其淬灭基团被具有5´-3´外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。

TaqMan技术另一种应用就是分子灯标（molecular beacon）。分子灯标为一茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子灯标的茎部，两末端分别标记荧光基团与淬灭基团。没有靶核酸存在时，分子标保持茎环结构，荧光工团与淬灭基因距离较近，产生的荧光能量根据荧光共振能量转移原理转移到淬灭基团，并以热能的形式散发出去，从而检测不到或仅有微弱荧光本底。当靶核酸存在时，茎部结构由于环状部分结合靶序列而被打开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光产生。此技术已经应用于结核及大肠肝菌O：157的检测。

Amplifluor是分子灯标的另一种形式，以引物的形式用于PCR，其5´端为茎环状结构并标记有荧

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光基团与淬灭基团，当Amplifluor被掺入到扩增产物中后，其茎环状结构被打开，产生荧光。Jordens等人将其应用于HPV的分型检测。同TaqMan中的分子灯标相比，Amplifluor技术不足之处是不能区分特异性与非特异性的PCR产物。Scorpion为一修饰的Amplifluor，可以降低本底而优于TaqMan和分子灯。三种形式的分子灯标在应用方面的不足之处就制备较困难，成本较高。

2 连接酶链式反应（LCR）

在LCR中，一对寡核苷酸探针杂交到靶DNA的相邻序列上，之间形成的缺口被连接酶所连接，再由连接产物的引物进行温度循环扩增。此方法的最大优点就是可用检测基因突变。FDA已批准该类试剂盒 用于检测沙眼衣原体，具有与PCR一致的检测灵敏度。

LCR最近也被应用于微阵列芯片。靶核酸被杂交捕获后，等位基因特异性的探针被连接到一荧光标记的探针，等位基因特异的探针在5´端有一段外加序列用来捕获DNA微阵列上的LCR产物，从而对带有荧光的产物进行测定。这种技术结合了液相LCR的特异性与通用型阵列的多重性，进一步拓宽了LCR的应用。

3 链替代扩增反应（SDA）

little M等人结合SDA与实时荧光发了新一代DNA探针系统，即BDProbeTecET。采用标记两种不同荧光基团的探针，在SDA过程中，该探针被掺入到双链扩增产物中，由限制内切酶的酶沏使淬灭基团与荧光基团分开，从而释放荧光。此系统用于病原体的检测，最低可检测到10-15个脑膜炎双球菌或沙眼衣原体。

Westin L等人将SDA扩增技术应用于微电子芯片中，在一个电场中，生物素标记的引物被固定到微阵列上，另一电场中，靶核酸被杂交捕获，并在原位进行SDA反应，产物在电场作用下被定引物捕获。尽管扩增与杂交捕获过程中有信号丧失，但还是可以达到一定的灵敏度（104拷贝）。

4 依赖核酸序列的扩增（NASBA）

NASBA主要用来检测HIV的病毒载量，最近不同实验小组将其与其它检测方法比较得出了不同的结果，看来对该方法有待进一步的评价。

5 转录介导的扩增（TMA）

TMA是一种利用RNA聚合酶和逆转录酶等温反应条件下来扩增RNA或DNA的系统。主要产品为Gen-Probe,其检测沙眼衣原体与结核分枝杆菌的试剂盒已得到FDA批准上市。最近研究表明，该方法用于HIV的定量检测，灵敏度高于RT-PCR和bDNA方法。

6 枝链核酸信号放大系统(bDNA)

该系统是目前本实验室的在研课题，其信号放大是通过碱性磷酸酶（AP）标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。在条件稳定的情况下，其检测灵敏度主要取决于信号的显示体系。Chiron公司采用AP的发光底物1，2-二恶二酮（dioxetane），用发光检测仪来测量其发光强度，灵敏度大大提高。

尽管RT-PCR是唯一FDA批准用来定量分析血清HIV的技术，但bDNA方法在临床实验室也是经常利用的，并且最近的研究报道Bdna3.0在线性范围上（100-500000拷贝/毫升）优于RT-PCR。BDNA技术应用的最大限制就是灵敏度不够高（与PCR相比）。为了解决这个问题，Capaldi等人将DNA枝状体作为一个反应平台，结合到技状体上的寡核苷酸在DNA聚合酶作用下延伸和外切，产生大量的无机焦磷酸（ppi）,在酶促作用下ppi可转变为ATP，ATP可通过荧光素酶酶促产生荧光信号来定量。此方法灵敏度可达到5zmol(10-21mol),接近于PCR。

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7 杂交捕获

Digene公司建立起来的这种方法的原理是将DNA-RNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合，由标记AP的抗体介导产生化学发光信号。被FDA批准的该类型试剂盒有淋球菌、沙眼衣原体和巨细胞病毒，并且是唯一被批准用来检测人类乳头瘤病毒DNA（HPV-DNA）的试剂盒。

8 DNA裂解信号放大

在环状探针技术中（cycling probe technology, CPT）,探针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体，两端分别标记生物素与荧光蛋白，结合到靶核酸上后，RNA部分被RNA酶（H）降解，两端DNA部分脱落下来，同时靶核酸可继续用来结合探针。反应后的体系在包被有链亲合素与蛋白G抗体的高流速硝酸纤维素膜上层析，如果没有靶核酸存在，完整的探针结合上胶体金-抗荧光蛋白接头，被包埋的链亲合素捕获后产生一条检测线，反之则没有。最近该技术有用于耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌与耐万古霉素的肠道微球菌的检测。

侵染探针（Invader）技术为另一种DNA信号放大分析。它是依据AFEN1酶的酶切特性来设计上、下游引物，上游引物的全部序列与下游引物（信号探针）的3´部分序列可与靶核酸的一段连续序列杂交结合，这样下游引物的5´端就如同在上游引物的侵入下而呈翼状探出，进而被FEN1酶切下，分析酶切片段可确定有无靶核酸的存在。Hall等人使酶切下来大片段与按同样原理设计的分子灯标结合，后者经FEN1酶切后荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。其检测灵敏度可达1000拷贝（靶核酸）以下。

该技术还可应用于单核苷酸多态性分析（single nucleotide polymorphism,SNP）,因为碱基错配可抑制FEN1的酶切。用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致。

9 滚环扩增（RCA）

RCA既可进行靶核酸扩增，也可进行信号放大扩增。有线性与指数两种形式的RCA。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸。产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。

Schwetizetr等人建立了免疫RCA，引物的5´端标记有抗体，抗原抗体反应后，加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA，然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，最后对荧光信号进行检测，该方法的灵敏度可达0.1pg/ml。

指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。Thomas等人证实其灵敏度可达到10拷贝，在1h内产物达107倍。

指数RCA可用于非环状DNA的扩增，设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶作用下，引物被连接成环状。

此环状引物可作为RCA的模板，进行指数扩增。此方法特异性很高，可用于突变与SNP的检测，若与荧光实时检测系统结合起来，其应用前景将是很广的。

10 纳米颗粒（nanoparticles）

纳米材料是具有纳米介观尺度（0.1-100nm）的均匀的有机或无机分子。按一定方法合成的均匀的胶体金颗粒在该领域一直是倍受青睐的，此纳米粒子在免疫标记领域已占有一席之地，并发挥着巨大的作用。

胶体金颗粒可与生物大分子表面的还原性的疏基结合。人工合成的寡核苷酸探针经疏基修饰后就可被胶体金颗粒标记上，可用于固相核酸杂交的信号显示。液相杂交中，通过胶体金标记的寡核苷酸探针与靶核酸的结合，使得胶体金颗粒聚集在一起而呈现颜色反应，根据颜色变化可判断靶核酸的存

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在与否。

直径介于纳米水平的胶体金颗粒和半导体材料都具有一定的光学、电子学和材料学特性，这些特性使得其在化学传感器、分光光度、量子斑点、缩微图象以及纳米结构构建等领域的应用非常广泛。胶体金纳米颗粒用于核酸杂交检测也是本实验室在研课题之一，相信它将会同其它纳米材料一样在纳米科技领域发挥重要作用。

Southern blot 是一种常用的 DNA 定量的分子生物学方法。其原理是将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。 Southern 法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。另外，由于 Southern 法检测不经过靶片段的扩增（ PCR ），一般每个电泳通道需要 10-30 μ g 的 DNA ，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取 DNA ，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失， Southern 法也无法检测到。这些因素都制约了 Southern 法在 T 0 代转基因植物中检测外源基因拷贝数的应用。

实时荧光定量 PCR 技术是一种较新的 DNA 定量方法。其定量的基本原理是在 PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如： SYBR GREEN I ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数： CT 值（ Cycle Threshold ）；通过将已知浓度标准品的 CT 值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。荧光定量 PCR 技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段 DNA ，对每克样品中 20pg-10ng 的转基因成分进行有效检测。同时，与 Southern 法相比，荧光定量 PCR 技术可对 T-DNA 的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测（ Giovanna 2002 ）。

流式细胞仪检测细胞凋亡

2005-4-14 23:55:00 来源：生命经纬

细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。

下面是一幅凋亡过程图。在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。

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（图1）

在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检测方法：

1、线粒体功能

2、DNA Cycle

3、Caspases

4、Annexin V Assay

5、DNA Fragmentation Assays

（可以参阅/content/20050411/10141.htm）

基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。

线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。

Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin－V标记之外，还会加一种DNA染料，常用

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的有PI和7－AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。

下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果，横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。

在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

（图2）

DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。G2－M期DNA含量是G0－G1的两倍，而S期介于两者之间。

但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0－G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0－G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0－G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。

下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。

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（图3）

晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂，因而可以出现DNA ladder，从而也就有了经典的检测方法TUNEl。流式也能进行Tunel检测，其检测原理与经典Tunel原理基本一致。以BD公司的为例，其利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。但是由于在细胞内标记，细胞需要进行固定处理，操作类似免疫组织化学法，容易造成假阳性。建议采用原装大厂的试剂盒，并且严格的设立对照。经过预实验方法稳定后再进行大规模实验。标本处理后，均可以用荧光纤维镜进行观察，拍照。流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。

（图4）

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流式细胞仪的工作原理

2005-6-3 15:14:06 来源：仪器分析网

（1）参数测量原理：流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0。角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90。角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的

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激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

（2）样品分选原理：流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

（3）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。

①数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图（histogram）、二维点图（dot plot）、二维等高图（contour ）、假三维图（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。

直方图是一维数据用昨最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横座标可以是线性标度或对数标度，用“道数”（Channel No .）来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵座标一般表示的是细胞的相对数。

二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横座标和纵座标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应座标植的细胞存在（图10-3）。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维座标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。

二维等高图类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数愈多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。

假三维图是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节 ，这无疑是有助于对数据进行分析的。

②数据分析：数据分析的方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是一个方程或方程组，方程的

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参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠精子的DNA含量时，可以获取细胞频数的尖锐波形分布。如果采用正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用最小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做任何假设，即采用无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了解数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示最终结果等。事实上，不经过先对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这一点来看，非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不必要的误差和错误解释。顺便指出，进行比较时对曲线的总细胞数进行归一化处理，甚至对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的

PCR技术的原理与方法（1）

2007-5-1 17:23:43 信息来源：来源网络

PCR技术的原理与方法（1）

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PCR定义

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。

PCR技术的基本原理

一.PCR反应成分：

1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；

4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2 等。

二.PCR反应基本步骤：

1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。

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2.退火：低温下，引物与模板

DNA互补区结合（55℃，30s）。

3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s）

1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。

2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。

3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。

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PCR扩增的基本方法

PCR技术的原理与方法（2）

2007-5-1 17:26:11 信息来源：来源网络

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PCR反应的成分和作用

总体积：一般为25μl～100 μl

（一）无Mg2 buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。

（二）Mg2 :终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影响反应的特异性和产率。

（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。

聚合酶链式反应技术

能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

PCR反应条件的选择（影响因素）

温度参数：

1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。

2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

聚合酶链式反应技术

循环数： PCR 的循环数主要由模板 DNA 的量决定，一般 20~30 次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增 产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。 PCR 产物积累规律： 反应初期产物以 2n 呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA 聚合酶形成一种平衡，产物 进入一个缓慢增长时期( “停滞效应” ,即“平台期” 到达平台期所需 PCR 循环数与模板量、PCR 扩增效率、 ) 。 聚合酶种类、非特异产物竟争有关。

PCR 扩增仪

聚合酶链式反应技术

PCR常见问题

一.没有扩增产物

1.循环温度：变性温度、退火温度

2.引物设计

3.DNA聚合酶活性

4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)

5、DNA样品

二.非特异产物及电泳呈涂布状

1.Mg2 浓度

2.调整引物、模板、聚合酶的用量

3.适当减少循环数

4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间

原位杂交组织化学技术的基本方法

信息来源：本站原创 更新时间：2005-10-22 13:04:09

一、核酸分子杂交技术

1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建

聚合酶链式反应技术

成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybridization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展

原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardelli和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。

由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。

近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可

聚合酶链式反应技术

以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。

核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single stranded, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是DNA探针，继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementary DNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（reverse transcriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。RNA探针是将特异性的 cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Sense probe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisense probe），又称互补RNA探针（complementary RNA probe , cRNA）。通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。 DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。

原位杂交组织化学技术在近20年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了，更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。 Coulton（1991）建议将非放射性标记技术更名为亲合复合物标记技术（Affinity– Complex Labelled Probes, ACLP ）。因为“非（ non）“在英文里是一个否定的名词，而且根据非放射性标记技术的原理是将一个标记物利用其亲合性，应用直接或间接的方法结合在核苷酸分子上。

原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。我们在下节将详加叙述。

三、位杂交组织化学技术的基本方法

如前所述，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示（visual－ization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。

a) 固定

原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或

聚合酶链式反应技术

组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释ISHH的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。在固定剂中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。对于mRNA的定位，我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果。各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性（Precipitating）固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISHH较为理想的固定剂。

b) 玻片和组织切片的处理

1．玻片的处理 玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放

由于ISHH的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾-明胶液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。

2．增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（detergent）或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存最和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。蛋白酶K（ Proteinase K）的消化作用在ISHH中是应用于蛋白消化的关键步骤，其浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用酶K1μg/ml(于0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0缓冲液中),37℃孵育15～20min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）报告应用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1N HCl 配）37℃、30min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。

聚合酶链式反应技术

不少实验工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外，还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/L NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名学者却对此持有异议，根据他们的实验和经验证明，乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。

3．减低背景染色 和免疫细胞化学染色一样ISHH实验程序中，如何减低背景染色是一个重要的问题。ISHH中背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后（Posthybridization）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。

预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。

有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗涤一次，以减低残留的和内源性的RNA酶，减低背景染色。

4．防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150℃左右。有条件的国外实验室在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。在无高温消毒的烤箱时，亦可用国内出产的卫生蒸汽消毒锅（山东新华医疗器材厂生产）。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。

c) 杂交（Hybridisation）

在ISHH，整个实验周期是比较长的，实验程序也比较繁杂，而杂交在ISHH整个实验中可被认为是“短兵相接”的一步。杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合。因此，杂交是ISHH中关键的而且是最重要的一个环节。

杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。国内向正华等采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片也可获得满意的实验结果。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（50℃左右）导致杂交液的蒸发。因此，也有为稳妥起见，在盖玻片周围加液体石蜡封固的，但作者认为这并不十分必要，因封固的石蜡在高温下融解反易导致杂交液的污染，必要时可加橡皮泥封固盖片四周。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。在孵育时间较长时，为保证杂交所需的湿润环境，可将复有硅化盖玻片进行杂交的载片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高温破坏）中进行孵育。杂交液的成分和预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖。

如前所述，杂交前的准备只是为杂交的成功奠定基础，要获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中还须注意以下的环节。

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1．探针的浓度 很难事先确定每一种实验探针的浓度，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。背景染色的高低也与探针浓度有关。根据国内外实验工作者的经验，认为最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。这和我们在免疫细胞化学试验中选择抗血清的最佳工作浓度的原则一样。

探针浓度依其种类和实验需要略有不同，根据笔者的经验及所查阅文献，在原位杂交细胞化学中，探针浓度为0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根据Heinz、Hofelt实验室经验，对放射性标记的dsDNA或cRNA探针，其浓度在2～5ng/μl。Conlton认为生物素标记探针，其最佳浓度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授实验室应用于放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/μl，而在非放射性标记（生物素或地高辛） cRNA探针浓度为2.5ng/μl，放射性标记DNA探针浓度为1.0ng/μl。向正华等应用地高辛标记生长抑素cRNA探针获得满意结果，其探针浓度为0.5ng/μl。

必须强调的是，国内外实验室都证明加杂交液的量要适当，以10～20μl/每张切片为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落，影响杂交效果，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色等不良后果。

2．探针的长度 一般应用于ISHH探针的最佳长度应在50～100个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。据报告，长500个碱基的探针，其杂交时间约需20h左右。200～500个碱基的探针仍可应用，如超过500个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解，使其变成短的片段，达到实验所需求的碱基数。

3．杂交的温度和时间 杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（melting temperature, 简称Tm）。原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90℃，而RNA则需要95℃。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于杂交液中。McConaughy报告，反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用调节盐浓度的办法来调节Tm。Tm的计算公式在第十九章有介绍，由公式的列出也表明了它与盐的浓度、探针的长度、甲酰胺的百分比等诸多因素有关。由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在Tm-25℃左右，即比Tm减低25℃，大约在30～60℃之间，根据探针的种类不同，温度略有差异，RNA和cRNA探针一般在37～42℃左右，而DNA探针或细胞内靶核苷酸为DNA的，则必须在80～95℃加热使其变性，时间5～15min，（有作用报告在105℃微波炉加热使之变性），然后在冰上搁置1min，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有2×SSC的温盒内，在37～42℃孵育杂交过夜。

杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右。Barns等（1987）报告用DNA探针杂交，其反应完成时间为2～4h。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜，从现有文献报告看无不良结果。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关，在确定杂交反应时间应予考虑，并经反复实验确定。有作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。

4．杂交严格度（Hybridization stringency） 杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对(mismatch)杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。

聚合酶链式反应技术

所以，杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。一般来说，低严格度（low stringency）杂交及冲洗条件在Tm-35℃至Tm–40℃之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度， Tm -20℃至Tm-30℃的范围。高严格度（high stringency）为Tm-10℃至Tm-15℃，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。麦跃行装用地高辛标记原位杂交技术检测尖锐湿疣中人乳头瘤病毒DNA型别，结果发现在严格条件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的检出率和阳性率明显低于非严格条件下（Tm-35℃），其相差非常明显（P<0.001）。因为，在严格条件下只有同源性很强的DNA才被检出，而在非严格条件下同源性较低的DNA序列也被检出。因此，他建议对病毒DNA分型需在高严格条件下进行，而低严格条件则可用于对病毒感染进行筛选。

由于原位杂交技术多数是在Tm-25℃进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高10～15℃。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。

5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide） 硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合（hydrate）作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。

甲酰胺的主要作用在上节已提及，在调节杂交反应温度方面，甲酰胺起了极为重要的作用，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。

d) 杂交后处理（post hybridisation treatment）

杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。在原位杂交组织化学的实验程序中，这也是一个重要的环节。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。放射性标记探针杂交后漂洗过程中可用底片曝光的方法检测背景染色（非特异性标记的多少）作为改善漂洗程序的指针。在35S标记的核酸探针在漂洗液中须加入14mmol/L的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或硫代硫酸盐（thiosulphate），以防止35S标记的核酸探针被氧化。总之，如何控制漂洗的严格度从而达到理想的信/噪比无既定方案可循，必须从反复的实践中取得经验。

e) 显示（Visualization）

显示又可称为检测系统（Detection system）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射

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