转基因酿酒酵母产番茄红素的研究 - 图文

Ｙ１５３０９６４硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究ＳｔｕｄｙｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａａｎｄｌｙｃｏｐｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ学科专业：生物化学与分子生物学研究生；牛昆指导教师：季静教授天津大学化工学院二零零八年六月摘要番茄红素是存在于番茄、西瓜、红色萄萄柚等果实中的一种天然类胡萝卜素。１９９５年开始国外对番茄红素的功能性研究引起重视，并确认番茄红素具有较强的防癌和抗癌功能，尤其具有预防前列腺癌的功能。效果优于Ｂ一胡萝卜素。酿酒酵母遗传背景清楚，胞内含有番茄红素合成前体比较丰富，而且可以方便的应用于食品工业，在转基因方法产番茄红素的领域中，酿酒酵母因其诸多优点，而得到越来越多的重视和应用。目前应用于转基因酵母的类胡萝卜素合成酶基因均来源于细菌和真菌，本文首次将来自于药用草原黄花龙胆的类胡萝卜合成酶基因：八氢番茄红素合成酶基因（ｐｓｙ）√＼氢番茄红素脱氢酶基因ｐｄｓ、ｚｄｓ）。质粒ＹＣｐ２２－Ｇａｌ－ｐｓｙＹＥｐｌａｃ１９５－ｐｄｓ、ＹＥｐｌａｃｌ８１－ｚｄｓ（质粒为本实验室构建）经验证后逐一转入酿酒酵母ｗ３０３菌株中，并得到了阳性转化子。对挑取的阳性转化子进行连续三次的发酵实验，得到了遗传性状比较稳定的一株转化菌株，使用酸热法提取色素物质，进行ＨＰＬＣ检测，与番茄红素标准品进行比对，证实了类胡萝卜素合成酶基因在转化菌株中得到表达，产生了番茄红素，并利用ＨＰＬＣ对样品定量，得到了转化菌株的原始番茄红素产生量６０肛ｇ／ｇ。本实验继续对此酿酒酵母阳性转化子的发酵培养基进行了探索，分别通过对速效碳源、迟效碳源、有机氮源、无机氮源、金属离子、中间代谢物的有效性和浓度的探索，最终确定了葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、酵母粉、苹果酸钠、柠檬酸钠、ＦｅＳ０４、ＭｇＳ０４这８种因素对番茄红素的产生是有着积极影响的，对这８种因素分别取三水平进行Ｌ２７３８的正交实验，最终得到了２．４％葡萄糖，１．２％蔗糖，１．０７％蛋白胨，０．３５％酵母粉，０．０４％苹果酸钠，０．０６％柠檬酸钠，０．０１％ＦｅＳ０４以及０．０１５％ＭｇＳ０４作为最优的发酵培养基并使得番茄红素的产量提高了６０％，初步达到了筛选培养基的目的。关键词：番茄红素转化ＨＰＬＣ酿酒酵母培养基优化ＡｂｓｔｒａｃｔＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓａｒｅｙｅｌｌｏｗ，ｏｒａｎｇｅ，ａｎｄｒｅｄｐｉｇｍｅｎｔｓｗｈｉｃｈｏｎｅａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅ．Ｌｙｃｏｐｅｎｅｉｓｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓａｎｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｃｌｕｄｅｓｔｒｏｎｇｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ，ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｃａｎｃｅｌ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｈａｓｃｌｅａｒｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ，Ｔｈｅｃｅｌｌｃｏｎｔａｉｎｓｌｙｅｏｐｅｎｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓａｎｄｃａｎｂｅｅａｓｉｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｈｅｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｔｈｅｌｙｃｏｐｅｎｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｈａｓｍａｎｙａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｇｅｔｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｌｌＡｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｔｈａｔｕｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｉｃｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄｆｕｎｇｕｓ．ＡｎｄｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｉｎＧｅｎｔｉａｎａｌｕｔｅａ．Ｔｈｅｙａｒｅｏｕｒａｒｅｓｔｕｄｙａｒｅｆｒｏｍｐｈｙｔｏｅｎｅｃａｒｏｔｅｎｐｉｄｓｓｙｎｚｙｍｅｓｐｓｙ，ｐｈｙｔｏｅｎｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｐｄｓａｎｄｚｄｓ．ＯｕｒＬａｂｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｒｅｅ．ｐｌａｓｍｉｄｓＹＣｐ２２一Ｇａｌ—ｐｓｙＹＥｐｌａｃｌ９５－ｐｄｓ．ＹＥｐｌａｃｌ８１－ｚｄｓ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎ＆ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｗ３０３．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎｔａｔ６０肛ｇ／ｇ（ｄｒｙｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｓａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｌｙｃｏｐｅｎｅｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｉｇｈｔ）ｏｆｃｅｌｌｓ．ＴｈｉｓｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｐａｒｔｉａｌｌｙｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄｔＯａｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｃａｒｂｏｎｆｌｏｗｉｎｔｏｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｅｉｎｇｔｈｅｎｏｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐａｔｈｗａｙｆｏｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ．Ｂｙｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｒａｐｉｄｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｓｌｏｗｌｙａｖａｉｌａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｏｒｇａｎｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｍｅｔａｌｉｏｎ，ｖａｌｉｄｉｔｙａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓｏｄｉｕｍｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，８ｆａｃｔｏｒｓ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ，ｐｅｐｔｏｎｅ，ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ，ｂｒｉｎｇｓｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｔｏｔｈｅｍａｌａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ，ＦｅＳ０４ａｎｄＭｇＳ０４ｏｆｔｈｅ８ｆａｃｔｏｒｓｗｉｔｈ３ｌｅｖｅｌｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅ．Ｌ２７＿３——８ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｓｌａｕｎｃｈｅｄ．ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｍｅｄｉｕｍｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｓ２．４％ｇｌｕｃｏｓｅ，１．２％ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ，１．０７％ｐｅｐｔｏｎｅ，０．３５％ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ０．０４％ｓｏｄｉｕｍ’ｍａｌａｔｅ，０．０６％ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ，０．０１％ＦｅＳ０４ａｎｄ０．０１５％ＭｇＳ０４．Ｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅｂｙ６０％．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｉｓａｃｈｉｅｖｅｄｐｒｉｍａｒｉｌｙ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ，Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｙｃｏｐｅｎｅ，Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，ＨＰＬＣ，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＭｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚｅ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：≯∞孑年５月≥ｏＥｌ学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解苤盗盘鲎有关保留：使用学位论文的规定。特授权苤鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：—ｔ．以厶Ｊ｛、ａ翩毪硝签字同期：少衫年ｌ－月弘同签字同期：ｗ。降Ｓ月弓Ｄ同天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究第一章文献综述１．１类胡萝Ｉ、素类物质简介１．１．１类胡萝ｌ、素类物质的结构特点类胡萝卜素类物质通常是指Ｃ４０的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物（叶黄素）两大类色素的总称ｎ１。它们在结构上由８个类异戊二烯单位浓缩形成，典型的Ｃ４０类胡萝卜素携带紫罗酮环（Ｉｏｎｏｎｅ），在环上不同位置的氢原子可被氧基、羟基、环氧基代替；类胡萝ｂ素分子中最重要的部分是决定颜色和生物功能的共轭双键系统。类胡萝卜素类物质是所有光合生物的基本成分，贮存在生物体的脂相中。在植物中，类胡萝卜素类物质担当叶绿体光合作用的辅助色素和保护叶绿素免受强光破坏，同时也是合成植物激素ＡＢＡ的前体。除八氢番茄红素、六氢番茄红素等几种类胡萝ｂ素无色外，绝大多数类胡萝卜素类物质呈黄色、橙色．或红色嘲。１．１．２类胡萝ｌ、素类物质的主要生理功能１．１．２．１类胡萝Ｉ、素的ＶＡ原活性人和动物除了从奶、蛋、肝脏、鱼肝油及其衍生物等食物中获取ＶＡｌ３］外，植物中的类胡萝卜素也是ｖＡ的重要来源。许多类胡萝ｂ素类物质只要其分子一端具有１５酮芷环且其侧链长不少于ｌ１个碳，均具有ＶＡ活性，其中以１３．胡萝卜素活性最高ｆ钔。类胡萝卜素类物质具有顺反构型，其中顺式构型的类胡萝ｂ素ＶＡ活性最高。１３．胡萝ｂ素缺乏会造成维生素Ａ缺乏症，引起角膜上皮的脱落、增厚和角质化，使原来透明的膜变得不透明，造成角膜溃疡。轻者会导致夜盲症，重者会损害上皮组织细胞的生长与分化，使人的皮肤变厚、干燥、痂变或发生皱纹。因此，维生素Ａ可以治疗各种皮肤角化症。１．１．２．２类胡萝Ｉ、素类物质的抗氧化作用【５】类胡萝ｂ素类物质分子结构中含有多个共轭双键，具有捕获、淬灭单线态氧和自由基的能力，是有效的抗氧化剂，可减少自由基对细胞遗传物质和细胞膜的

第一章文献综述损伤，阻止光氧化和脂质氧化。类胡萝卜素类物质对自由基的淬灭和捕获能力随类胡萝卜素类物质分子共轭双键数量的增加而增强。它通过与自由基反应生成无毒产物或者中断自由基的连锁反应来清除体内自由基。由于这种特性，过氧化自由基很容易与类胡萝ｂ素类物质结合，形成类胡萝卜素自由基。这种作用受氧分压的影响，氧分压越小，作用越强。由于哺乳动物体内氧分压较低，因而类胡萝ｂ素类物质是生物体中一种有效的抗氧化剂。最近的研究还表明，天然胡萝ｂ素与Ⅱ～生育酚联用可协同产生抗氧化作用。１．１．２．３类胡萝Ｉ、素类物质与机体免疫类胡萝卜素类物质能增加免疫系统中Ｂ细胞、辅助性Ｔ细胞和其他免疫组分的活力，协助Ｂ细胞产生抗体；同ＶＡ类相似，类胡萝卜素类物质也能调控大鼠、小鼠以及体外培养的淋巴细胞的免疫应答№１。虾青素、角黄质、黄体素和Ｂ胡萝ｂ素可刺激动物体内的免疫应答反应。Ｃｈｅｗ发现类胡萝卜素类物质与牛淋巴细胞的生理功能有关，类胡萝卜素类物质提高了机体的免疫功能忉。补充１３一胡萝ｂ素能促进大鼠淋巴细胞的有丝分裂。Ｒｏｔｈ发现某些无ＶＡ活性的类胡萝卜素能防止裸鼠发生因紫外线照射引起的皮肤肿瘤∞３。１．１．２．４类胡萝Ｉ、素类物质对繁殖机能的影响类胡萝ｂ素类物质影响繁殖的机理尚不十分清楚，大致认为：一方面，１３一胡萝卜素可作为一种生理性抗氧化剂，阻碍类脂的过氧化作用和刺激孕酮的产生，从而保护了卵泡和卵巢细胞免受氧化反应的破坏；另一方面，１３一胡萝ｂ素可能调节靶细胞中细胞核的活动。在１９７６年就有报道，口服Ｂ一胡萝ｂ素可以防止未补饲Ｂ一胡萝卜素的奶牛出现繁殖障碍。但是，随后韵．研究并不能证实添加１：：’１３一胡萝卜素能改善繁殖性能。相反，高水平补饲Ｂ一胡萝卜素（５００ｍｇ／ｄ）降低了受精率。ＯｐＦａｌｌｏｎ等证明牛黄体中Ｂ一胡萝卜素能与微粒体片段共价结合，且Ｂ一’胡萝卜素的水平保持恒定不变时，ＶＡ浓度水平与卵泡液中卵泡大小及质量有关。胡萝ｂ素还影响公牛的精液品质，血液Ｂ一胡萝卜素水平与牛的繁殖性能密切相关，９一胡萝ｂ素对糖子的形成和附睾内精子的成熟有不依赖于ＶＡ的独特作用，ｐ胡萝卜素的缺乏会导致胚胎早期死亡、不发情和受胎率下。在配种后期，给后备２天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究母猪口服１３一胡萝卜素（２２８ｒａｇ／周），胚胎死亡率下降，窝产仔数增加，窝重提高，肌肉注射等量的ＶＡ却没有达到相同的效果渤。１．１．２．５类胡萝Ｊ、素类物质的着色功能类胡萝卜素类物质是一种天然的着色剂ｎ刚。在牛体内类胡萝卜素类物质沉积于脂肪组织中，使胴体呈黄色，影响牛肉的品质。而在家禽体内，类胡萝卜素类物质沉积于爪、喙及皮下脂肪中使其着色，提高家禽胴体品质ｎ¨。１．２番茄红素概况番茄红素（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ）是一种呈黄色到红色的类胡萝卜素，广泛存在于动、植物体中。１８７５年Ｍｌｌａｒｄｅｔ从番茄中最早获得番茄红素的粗提物，称之为Ｓｏｌａｎｏｒｂｉｎ。１９０３年Ｓｃｈｕｎｃｋ发现从番茄中提取的这种色素与从胡萝卜中提取的胡萝卜素具有不同的吸收光谱，并将其命名为Ｌｙｃｏｐｅｎｅ。随后，人们开始对番茄红素的基本化学结构进行研究。１９１０年Ｗｉｌｌｓｔａｔｔｅｒ和Ｅｓｃｈｅｒ首先提出番茄红素是胡萝卜素的异构体，并确定其分子式为Ｃ∞Ｈ弱。１９３０．年Ｋａｒｒｅｒ等提出，番茄红素的化学结构式为１１个共轭及２个非共轭的碳一碳双键组成的非环状平面共轭多不饱和脂肪烃，并在１９３２年ｌ枣ｌＫｕｈｎ和Ｇｒｕｎｄｍａｎｎｉｌｑ：实Ｈ２１。ｊ———ｋ——ｋ——＾—～—’——、——１——、一々√—ｂＡ—吖—乙ｐ吖Ｉ一图ｉ－ｉ番茄红素一些主要的立体异构体Ｆｉｇｌ一１Ｓｏｍｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｉｄｅｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅ第一章文献综述过去由于番茄红素不象胡萝卜素那样具有维生素Ａ原的活性，而未被重视。近２０年来，国内外越来越多的研究和调查表明。番茄红素具有淬灭活性氧、消除人体自由基、预防心脏病、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症、保护心血管、抗老化、保护皮肤等优越的生理功能。番茄红素是类胡萝卜素中最有效的单线态氧淬灭剂，它的淬灭能力是Ｂ一胡萝卜素（Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅ）的２倍，是维生素Ｅ的１００倍，因此其抗氧化性是类胡萝卜素中最强的。另外，番茄红素的防癌抗癌的效果也明显优于ａ一胡萝卜素和Ｂ一胡萝卜素ｎ引。据北卡州立大学研究，番茄红素是所有类胡萝卜素中最强的心脏保护剂ｎ钉。目前，番茄红素的研究已成为国际上功能性食品成分分析和抗癌防癌研究中的一个热点。１．２．１番茄红素的理化性质１．２．１．１物理性质番茄红素是一种非环状平面直线型碳氢化合物，相对分子质量为５３６．８５，深红色针状晶体（从二氧化碳和乙醇混合液中的析出物），熔点为１７４℃（全反式＞，在４７２ｎｍ处有一强吸收峰。不溶于水，难溶于甲醇、乙醇。可溶于脂肪、油脂、乙醚、石油醚、正己烷和丙酮，易溶于苯、氯仿、二硫化碳等有机溶剂。自然界中的番茄红素主要以全反式存在，只有小部分是顺式构型，并以５一顺、９一顺和１３－顺型为主。但在加工过程中，植物中的反式构型会向顺式构型转化。动物体内则以顺式构型为主，人血清中的番茄红素含量为０，６～１．９ｐｍｏｌ／ｍＬ，其中顺式构型的占５８％～７３％。番茄红素链上有１１个碳一碳共轭双键，每个双键都可能存在２种构型。理论上应有２１１（最９２０４８）种异构体，但由于甲基化引起的位阻作用，大大限制了重排的数目，目前发现的异构体约有７２种。顺式异构体与反式异构体在化学和物理性质上有很大差别。顺式构型的颜色弱，熔点低（小于１７４℃），消光系数小，极性强，更易溶解，并在紫外一可见光区的短波长处（３５０～３６５ｎｍ）会出现较强的吸收，而全反式的番茄红素无此吸收，通常可用此吸收峰来检验番茄红素中顺式异构体的存在与否ｎ趵。４天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究１．２．１．２化学性质多双键结构使番茄红素的化学性质非常活泼，极不稳定。凡对其他类胡萝卜素可造成降解的物理或化学因素包括光照、温度的升高、ｐＨ降低、与氧接触以及表面活性剂等均可使它降解。番茄红素纯品在日光下１２ｈ基本损失殆尽，紫外光下３ｄ损失４０％，且温度越高降解越快。因此在提取番茄红素时要避免阳光，可在红光或黄光下进行。番茄红素对碱和氧化剂较稳定，酸对番茄红素有破坏作用，且随酸浓度的增加，其稳定性下降。还原剂如ｖＥ、ｖＣ及ＢＨＴ（二丁基羟基甲苯）可延缓其氧化。番茄红素的所有共轭和非共轭双键都在同一平面上，这使它在消除自由基和淬灭单线态氧的反应中为速率最大的一种类胡萝卜素，其淬灭有物理和化学两种方式，并以物理淬灭为主。物理方式是通过把激发态氧的能量传递给番茄红素，产生基态的氧和激发态的三线态番茄红素，再通过三线态番茄红素和周围介质之间相互的分子振动和转动作用，使能量散发，同时产生基态番茄红素。在这种物理淬灭的循环过程中，番茄红素本身没有发生变化，类似于催化剂的作用。化学灭氧量占总灭氧量的百分率不Ｎｏ．０５％，’它主要是通过番茄红素分子与氧作用发生分解的方式来完成。有关番茄红素与氧作用的研究发现，在亚甲基蓝光敏剂的存在下，番茄红素与氧作用裂解为小分子量化合物的短链结构ｎ６】。１．２．１．３番茄红素的稳定性对光照的稳定性ｎ７１：番茄红素对光十分敏感，尤其是日光和紫外光。目光照射经过１２小时，番茄红素基本上损失殆尽。对紫外光也较敏感，在暗处保存效果较好。Ｌｅｅ等在实验中发现番茄红素在光照的过程中，全顺式构型浓度减少。番茄红素在光照１４４ｈ后，全顺式番茄红素减少１３．１％，然而５一反式番茄红素、９一反式番茄红素、１３－反式番茄红素和１５－反式番茄红素各增加了１．４７％、０．９２％ｉ。５．２８％和０．４４％。双反式番茄红素也增加了３．０４％。全顺式番茄红素在光照下转化为反式番茄红素因而使得反式番茄红素的比例增加。第一章文献综述对热的稳定性Ｄ砌：番茄红素对热具有较好的稳定性。番茄红素在热条件下除分解外，也会发生异构化。番茄红素在５０℃加热３ｈ后也会形成新的双反式番茄红素。全顺式番茄红素在开始的１２ｈ内浓度并没有明显的变化，但在１２ｈ后，浓度开始减少，单反式番茄红素的形成速度小于降解的速度。１００℃下加热１２０ｍｉｎ后，全反式番茄红素浓度减少了７８％，所有的单反式番茄红素浓度也降低，双反式番茄红素在开始６０ｍｉｎ增加，然后开始减少。１００℃时全顺式番茄红素的浓度减少较快。１５０℃下加热ｌＯｍｉｎ后全顺式番茄红素和单反式番茄红素几乎全部降解，双反式番茄红素在前４ｍｉｎ增加，然后也开始减少。说明番茄红素在温度越高时降解速度越快，工业生产，以不超过８０℃为宜。１．２．２番茄红素在自然界中的分布番茄红素在自然界中分布很广泛ｎ们。在植物中，主要是那些成熟的红色水果和蔬菜，如番茄、西瓜、番石榴、番微果、木瓜、葡萄、‘草莓、苦瓜籽、萝卜、胡萝卜、红肉脐橙、红色葡萄柚等，且成熟度越高，番茄红素的含量也越高。含量最高的是番茄，约为３～１４ｍｇ／ｌＯＯｇ。不同番茄品种番茄红素含量也不同，在普通的番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）中，含量为３．３～７．７ｍｇ／ｌＯＯｇ，在一些特殊番茄品种（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉ）中，含量高达４０ｍｇ／ｌＯＯｇ。值得一提的是美国农业部的科学家最近发现，在秋橄榄这种浆果中番茄红素的含量相当于普通番茄的１８倍，发现番茄红素含量如此高的食用浆果迄今还是首次乜们。番茄红素也广泛存在于人体各种器官和组织中，主要分布在人的血液、肾上腺、肝脏、睾丸、前列腺、乳腺、卵巢、子宫、消化道等器官中，其中血液、肾上腺、睾丸、肝脏等器一官中含量较高。。Ｓｔａｈｌ和Ｋａｐｌａｎ对人体各种器官和组织中，如肝、肾、肾上腺、睾：‘ｌ‘丸、卵巢、皮肤、肺、脂组织等的番茄红素含量作了研究，都发现肾上腺和睾丸中含量较高，分别为１．９０ｎｍｏｌ／ｇ、４．３４ｎｍｏｌ／ｇ（Ｓｔａｈｌ的研究结果），２１．６０ｎｍｏｌ／ｇ、２１．３６ｎｍｏｌ／ｇ（Ｋａｐｌａｎ的研究结果），研究对象不同，结果差别也很大，这可能与被研究对象的年龄、血浆胆固醇、饮食摄入等因素有关陋¨。６

天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究１．２．３番茄红素的生物合成途径以及主要生产方法１．２．３．Ｉ番茄红素的生物合成通过生化分析、经典遗传学和近年来分子遗传学的研究，已经基本清楚类胡萝ｂ素生物合成的主要途径。所有类胡萝卜素都是通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成的。它是一类自乙酰ＣｏＡ开始的次生代谢产物，其形成过程为：３个乙酰ＣｏＡ分子通过失去１个分子的羧基而缩合成３一甲基一３，５一二甲基戊酸（ＭＶＡ），在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸（ＩＰＰ），ＩＰＰ在ＩＰＰ异构酶作用下异构为二甲基丙烯基二磷酸（ＤＭＡＰＰ），ＤＭＡＰＰ依次与３分子的ＩＰＰ在ＧＧＰＳ（ＧＧＰＰ合成酶）的作用下，缩合生成二甲基辛烯焦磷（ＧＰＰ）、法尼基二磷酸（ＦＰＰ）、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸（ＧＧＰＰ）。２个ＧＧＰＰ在八氢番茄红素合成酶（ＰＳＹ）作用下头对头进行二聚作用形成第１个无色的类胡萝ｂ素一八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成Ｑ一胡萝卜素、Ｂ一胡萝卜素，‘Ｑ、１３一胡萝卜素经引入、转化、环化、氧化等反应形成结构更复杂的虾青素、叶黄素、新黄质等乜２１。异戊烯焦磷酸（１ＰＰ）ｌＧＧＰＳ栊儿基栊牛儿基焦磷酸（ＧＧＰＰ）ｌＰＳＹ八氢番茄红素ＩＰＤＳ夭氢番茄红素ｌＰＤＳ‘．胡萝卜素ｌＺＤＳ链孢红素ｌＺＤＳ番茄红素７第一章文献综述在这里我们对本试验所要使用的三种基因及最新进展进行简要介绍ＰＳＹ（八氢番茄红素合成酶）ＰＳＹ催化ＧＧＰＰ转化成八氢番茄红素，ｎｈｐｓｙ基因编码，其ｅＤＮＡ长１．３～１．６Ｋｂ，编码４０９～４２３个氨基酸，基因全长３．２～６．０Ｋｂ，有５～７个内含子【２３１。ＰＤＳ（八氢番茄红素脱饱和酶）ＰＤＳ催化八氢番茄红素向己一胡萝卜素转化，由ｐｄｓ基因编码，其ｃＤＮＡ长１．９～２．３Ｋｂ，编码５６６－－－５８２个氨基酸。从八氢番茄红素到番茄红素一系列去饱和的过程中，细菌、真菌和植物与蓝细菌中涉及不同类型的酶。分子生物学研究表明，在八氢番茄红素到番茄红素的代谢过程中涉及一系列的去饱和酶。基本可将他们分成两种类型，Ｃｒｔ、Ｐｄｓ型。Ｃｒｔ型包括细菌和真菌的八氢番茄红素去饱和酶，羟基链孢红素去饱和酶，‘一类胡萝ｂ素去饱和酶。ｐ口ｉ：泡括植物、’蓝细菌的八氢番茄红素去饱和酶和辣椒的‘～类胡萝卜素去饱和酶。这两种酶的区别在于去饱和反应中作为受体氢的辅助因子不同，分别是ＦＡＤ和ＮＡＤＰ乜钔。‘ＺＤＳ（‘．胡萝ｂ素脱饱和酶）ＺＤＳ催化‘．胡萝‘卜素向番茄红素转化，由ｚｄｓ基因编码，?其ｃＤＮＡ长１．８～２．ＩＫｂ，编码５５８～５７４个氨基酸【２５１。１．２．３．２番茄红素的生产方法目前番茄红素的生产方法主要有天然产物制备法、化工合成法和微生物发酵法口郇。天然产物制备法包括从高等植物和藻类中提取Ｂ一胡萝卜素、番茄红素和虾青素，此法的制备技术由原料的前处理，萃取和纯化三部分组成，成本较高。化工合成法比较成熟，在１９５４年即有Ｂ一胡萝ｂ素产品问世，但多年来化工合成的类胡萝卜素一直存在着立体化学结构与天然类胡萝卜素差别较大，生物活性低，只能作为着色剂使用。随着现代发酵技术和生物反应器技术的发展，利用微生物生产类胡萝ｂ素成天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究为获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径。研究人员对利用微生物发酵生产番茄红素方面进行了大量研究，涉及微生物主要有三孢布拉氏霉菌（Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ）乜７１、一些基因改造的酵母菌㈨、红色细菌及能自身合成番茄红素的革兰氏阴性非光合菌，包括萎蔫欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）和草生欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ）啪１。下面分别以不同微生物的发酵生产研究进行简单概述。红色细菌的番茄红素含量较高，但未能进行工业化生产。有一则６８年专利曾报道用浅红链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）突变株发酵６ｄ产番茄红素０．５９／Ｌ。最红素。将ｐＨ控制在非生长最适宜范围（ｐＨ６～６．４）或在培养基加入高盐（８５ｍｍｏｌ／１氯化钠），番茄红素产量达７．４ｍｇ／ｇ生物量。革兰氏阴性非光合菌ｉ包括萎蔫欧文氏生物合成代谢途径的研究。之后，ＲｏｓｅＭ等利用大肠杆菌载体ｐＡ－－－－－ＣＹＣｌ８４建立携带欧文氏菌控制番茄红素合成基因的质粒ｐＡＣＣＲＴ－－ＥＩＢ（载有ｃｒｔＥ，Ｂ，Ｉ），将其转入！三孢布拉氏霉菌在工业化生产中主要用于１３一胡萝卜素的生产。当在培养过７．，的前体物质（１３一紫罗酮和异烟肼）之后选正确时机添加１３一胡萝卜素环化阻断剂，一申请，产量０．１５９／Ｌ。Ｇａｖｒｉｌｏｖ等人添加了烟草的废弃物１％于霉菌的发酵液中，经９细菌近研究者分离出一分枝杆菌属野生菌株，在其产生的类胡萝卜素中有８０９６为番茄茵和草生欧文氏菌虽然也能自身合成番茄红素，但含量较低，主要用于番茄红素．ＩＭｌ０１大肠杆菌后生产出２００，－－－５００ｕｇ／ｇ（ＤＷ）的番茄红素啪１。霉菌程中添加一些胺类和杂环氮化合物以抑制细胞内环化酶的活性时，三孢布拉氏霉菌合成大量的番茄红素。不过，这种抑制机制一直是用来研究胡萝卜素生物合成途径，用于生产则较少。王永生等在培养中添加三孢布拉氏霉菌合成１３一胡萝卜素一定程度地提高了番茄红素的产量。控制环化的另一个重要条件是ｐＨ，中性偏高有利番茄红素形成，方法是添加碳酸钠保持发酵液ｐＨ６．６以上，有关工艺已有专利１ｌＯｈ发酵，得到番茄红素约６０～８０ｍ∥ｌＯＯｍｌ［３１］ｏ非离子型表面活性剂ｓｐａｎ一２０可以第一章文献综述改变发酵液流体特性和细胞通透性，再加上其水溶性，从而有利于细胞内外物质的传递，达到有利于番茄红素合成的条件，因而可使番茄红素生产能力提高２倍，达９８．６ｍｇ／Ｌ发酵液。用三孢布拉氏霉菌发酵生产技术获得的结晶番茄红素，经异丁基醋酸盐再结晶可得到高纯度的反式番茄红素。藻类藻类中广泛地存在有类胡萝卜素，但以１３一胡萝卜素最为普遍。国内外学者们在利用藻类发酵生产类胡萝卜素的生产菌株及工艺方面进行了广泛的研究，其中杜氏藻、红球藻等在国外已被批准用于商业生产类胡萝卜素。结合三孢布拉氏霉菌研究，如若在藻类发酵过程中添加合适的阻断剂，阻断番茄红素到类胡萝卜素的环化途径，同样就可以积累大量的番茄红素。而利用藻类生产类胡萝卜素技术的相对成熟，转化率较高，这必将会大大促进微生物发酵生产番茄红素应用潜力。综上所述，利用基因工程和生物技术己能部分控制番茄红素合成过程中前体物质的转化方向，如使ＦＰＰ竞争性地从生成麦角固醇转向番茄红素。虽然采用微生物发酵生产番茄红素技术目前未能达到工业化生产的规模，但从发展趋势来看，发酵法成本及污染相对较低，如能进一步提高菌体的贮存力和转化力，是实现工业化生产番茄红素经济而有效的途径粤酵母菌酵母菌本身并不能合成番茄红素，研究者发现酵母在生长稳定期能在体内积累的大量麦角固醇，利用麦角固醇与类胡萝卜素的生物合成途径在ＦＰＰ分叉的特性，通过引入欧文氏茵ｃｒｔＥ竞争ＦＰＰ，使之部分从麦角固醇生物合成途径转向番茄红素的生物合成。１９９４年Ｓｈｉｇｅ－ｙｕｋｉＹａｍａｎｏ等人将生物合成番茄红素和Ｂ胡萝卜素的基因（ｃｒｔＥ，ｃｒｔＢ，ｃｒｔｔ，ｃｒｔＹ）及其启动子插入啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中，将该酵母菌在选择性培养基３０。Ｃ培养３ｄ。冷冻干燥离心过滤所得细胞，再加入丙酮，破碎细胞，再用丙酮萃取４次并蒸干丙酮得到番茄红素的含量为１１３蚓ｇ细胞干重ｂ引。产蛋白假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）也是工业生产上应用广泛的酵母菌，经常用于生产单细胞蛋白、谷胱甘肽及ＲＮＡ。ＹｕｔａｋａＭｉｕｒａ等将欧文氏杆１０天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究菌控制番茄红素合成的基因转入产蛋白假丝酵母中，利用被重组基因的产蛋白假丝酵母培养生产番茄红素，每１９干重产蛋白假丝酵母可得到０．７５８ｍｇ的番茄红素和０．４０７ｍｇ的八氢番茄红素㈨。１．２．３．３番茄红素的市场前景分析由于天然番茄红素生产困难，且具有较多对人体有利的生物活性，所以价格昂贵。国内市场上９０％的天然番茄红素售价为３万元／千克，国际市场上价格较国内市场稍低。我国已在新疆建成了番茄红素生产企业，从番茄中分离提取番茄红素，但其高成本和低产量并为缓解番茄红素供应紧张，价格昂贵的局面。虾青素目前主要是化工合成，由于其结构复杂，合成困难，其售价为２０００美元／千克。美国国内每年化工合成的类胡萝卜素销售额达３亿美元，如将这部分类胡萝卜素全部改为微生物发酵生产天然类胡萝卜素，那么将提高入类的健康水平，且带来巨大的经济效益口副。１．３微生物转基因生产番茄红素的热点及进展虽然目前已经探明了自然界存在６００多种类胡萝卜素，但是真正得到纯品的只有３０多种，并且大部分在生物体内是痕量存在的。所以目前类胡萝卜素合成研究的热点是：发现新的类胡萝卜素类物质合成基因并对原有的高产类胡萝卜素的生物体进行基因改造或在不产类胡萝卜素的生物体内导入类胡萝卜素合成酶基因，使其高产类胡萝卜素。目前的研究进展如下：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ等首次从荚膜红细菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）中分离出类胡萝卜素生物合成酶基因。随后Ｍｉｓａｗａ等从噬夏孢欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）中也克隆到参与类胡萝卜素生物合成基因㈨。目前，已有１５０多个类胡萝卜素合成酶基因被分离，这些基因都为结构基因，共编码２０多种不同类胡萝卜素合成酶。．．这些基因不仅可用于利用异源基因来克隆与高等植物类胡萝卜素生物合成’’？、?．一?途径中的其它基因，并可通过基因操作，在不具有类胡萝Ｉ－素生物合成途径的大肠杆菌中合成这些类胡萝卜素物质。迄今，应用反向遗传学技术（Ｂｉｒｄ等

第一章文献综述１９９１）啪１、转座子标签法（Ｍａｒｉｎ等１９９６）啪１、异源基因作探针筛选基因组或ｅＤＮＡ文库（Ｒｏｍｅｒ等１９９３ｍｕ，Ｍａｎｎ等１９９４嘲，Ｒｏｎｅｎ等１９９９ｍ，蝴）、图位基因克隆技术（Ｉｓａａｃｓｏｎ等２００２陟１，Ｐａｒｋ等２００２叫）及其利用可合成各种类胡萝卜素的工程大肠杆菌作为酶的底物的“颜色互补＂等技术（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等１９９６‘‘瑚１，Ｍｏｅｈｓ等２００１咖’），使得参与类胡萝卜素生物合成的基因都已从高等植物中分离出来。１．４酿酒酵母体内合成番茄红素在本身不产类胡萝卜素的微生物体内合成类胡萝卜素，这个系统需要具备以下几个条件：①要有足够的前体物质（萜类化合物）畸ｕ；②在宿主体内转入类胡萝卜素生物合成酶基因后，要保持这些酶表达的平衡性，不形成中间代谢物的大量积累，妨碍目标产物的合成；③进行合理的载体构建，以减少中间代谢物的堆积，增加目标产物的产量魄１。例如：产朊假丝酵母㈨转入ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔｌ后，合成Ｊ，番万百红素，然后冉转入全长删Ｇ基因，番茄红素产量由原来的１．１ｍｇ／ｇ（Ｄｗ）提高到２．１ｍｇ／ｇ（ＤＷ）。转化ＨＭＧ基因的催化区域（该基因的１３３９－－－一２８０５部分）比转化全长删Ｇ更有效，‘番茄红素产量达４．３ｍｇ／ｇ（Ｄｗ）。此外，引入一些其他基因，还能产生出Ｂ一胡萝卜素和虾青素等。Ｙａｍａｎｏ陆¨等将ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔｌ基因转入酿酒酵母体内，得到番茄红素１１３ｕｇ／ｇ干菌体，同时测得细胞内麦角固醇的含量为１．９６ｍｇ／ｇ干菌体，比转化前减少了１０％，麦角固醇和类胡萝卜素的分支点在香叶焦磷酸（ＦＰＰ），说明ｃｒｔＥ基因的导入，使代谢流向类胡萝卜素方向倾斜。本试验之所以最后选择酵母作为转基因宿主是因为：酵母（ｙｅａｓｔ）是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性（易培养、繁殖快、便于遗传操作等），又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酿酒酵母的工业应，●用比较广泛，历史悠久，遗传背景清楚，不产生有毒物质，生物安全性好，易于推广应用，现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型：天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究酵母本身不产类胡萝卜素，但其体内有类胡萝ｂ素前体萜类物质，如向酵母体内转入一系列类胡萝卜素合成酶基因，可在酵母体内形成类胡萝卜素合成途径。且类胡萝卜素物质不需提取，可随酵母单细胞蛋白一起食用或作饲料用。这将大大降低生产成本，并减少在利用有机溶剂提取类胡萝ｂ素过程中的产品污染，这就为酿酒酵母的番茄红素的合成奠定了基础。在本试验中，将实验室保存的由季静老师在药用草原黄花龙胆中分离出来的ｐｓｙ，ｐｄｓ、ｚ凼三个基因泓１转Ａ．至Ｕｗ３０３酿酒酵母中，从而实现转基因酿酒酵母对番茄红素的高效表达。１．５研究中的主要技术目前在番茄红素的生物合成方面应用各种分子生物技术进行基因重组操作：在产物分析检测手段上利用ＨＰＬＣ．ＭＳ等检测手段。１．６研究目标、内容及方案１．６．１研究目标①构建高产类胡萝ｂ素的酵母菌株；②摸索构建好的基因工程菌株的最适发酵条件，以期能工业应用。１．６．２研究内容①以酿酒酵母为宿主，以酵母整合型载体为表达载体，探索构建高产类胡萝ｂ素的酵母菌株‘５５１；’●②对构建好的基因工程菌株进行发酵试验，逐级扩大Ｐ摸索其发酵最佳的培养条件。第一章文献综述１．６．３实验方案以酿酒酵母为宿主，向其体内转入来自药用黄花龙胆的一系列类胡萝ｂ素生物合成酶基因，因在酿酒酵母体内异戊二烯类代谢途径只到ＧＧＰＰ为止，且酵母自身不具有合成类胡萝卜素的能力，需要转入的基因包括：八氢番茄红素合成酶基因ｐｓｙ，，八氢番茄红素脱氢酶基因ｐ出和ｚ凼等，促使其表达类胡萝卜素产物，最终获得表达番茄红素的酿酒酵母菌株。以摇瓶发酵实验为基础，确定培养条件以及最佳培养基。１４天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究第二章将目的基因转入酿酒酵母酵母（ｙｅａｓｔ）是一类单细胞低等真核生物，它既具有类似原核生物的生长特性（易培养、繁殖快、便于遗传操作等），又具有典型真核生物的分子和细胞生物学特性。酿酒酵母的工业应用比较广泛，历史悠久，遗传背景清楚，不产生有毒物质，生物安全性好，易于推广应用，现已成为分子生物学研究最重要的工具和模型。酵母本身不产类胡萝Ｉ－素，但其体内有类胡萝卜素前体萜类物质，如向酵母体内转入一系列类胡萝卜素合成酶基因，可在酵母体内形成类胡萝Ｉ－素合成途径。且类胡萝卜素物质不需提取，可随酵母单细胞蛋白一起食用或作饲料用。这将大大降低生产成本，并减少在利用有机溶剂提取类胡萝卜素过程中的产品污染，这就为酿酒酵母的番茄红素的合成奠定了基础。在本试验中，将实验室保存的由季静老师在药用草原黄花龙胆中分离出来的ｐｓｙ、ｐｄｓ、ｚｄｓ＝一个基因转入到ｗ３０３酿酒酵母中，从而实现转基因酿酒酵母对番茄红素的高效表达。２．１实验材料２．１．１质粒、菌株与引物本实验中使用的菌株和质粒见表２．１，所用引物见表２．２。第二章将目的基因转入酿酒酵母表２－１本工作所用菌种和质粒Ｔａｂｌｅ２．１ＳｔｒａｉｎａｎｄＰｌａｓｍｉｄｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋｗ３０３（ＭＡＴａ／ＭＡＴａ｛ｌｅｕ２－３，１１２菌种ｔｒｐ！－１ｃａｎＩ一１００ｕｒａ３－１ａｄｅ２—１ｈｉｓ３—１ｌ，１５）【ｐｈｉ＋】）ＤＨ５ａｐｄｓｐｄｓ－ＵＰ一５’ｇｇｇｃｃｃｔｃｔａｇａａｔｇｔｃｔｃａａｔｔｇｇｇａｃａｃａ３’’ｐｄｓ－ＤＮ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｇａｔｃｃｔｃａｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃｔｔｇｃｔ３‘ｚｄｓｚｄｓ—ＵＰ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｃａｔｇｔｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃｔｇｃｔｔ３’．ｚｄｓ－ＤＮ－５’ｇｇｇｃｃｃｇｔｃｇａｃｔｃａｇａｃａａｃａｃｔａａａｃｔｔｃ３’ｐｓｙｐｓｙ－ＵＰ一５’ｇｃｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｔｃｔａｔｔｔｇｔａｃｇｃｔａｔ３’，．ｐｓｙ－ＤＮ－５’ｇｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｃａｔｇｔｔｔｇｇｇｇｔａｔｃａｔａ３’２．１．２实验仪器表２．３实验仪器Ｔａｂ．２—３Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ１６

天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究２．１．３主要药品表２．４主要实验药品Ｔａｂ．２?４Ｉｍｐｏｒｔａｎｔｍａｔｅｒｉａｌｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ药品名称酵母抽提物（Ｂａｃｔｏ—Ｙｅａｓｔ蛋白胨（Ｂａｃｔｏ—ｐｅｐｔｏｎｅ）胰化蛋白胨（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）ＹＮＢ（酵母氮源）各种Ｌ型氨基酸葡萄糖琼脂琼脂糖甘油Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅｘｔｒａｃｔ）生产商ＢＢｌＢＢＩＢＢＩＤｉｆｃＯＳｉｇｍａＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩＡＭＥＲＳＣＯＢＢＩ溶菌酶Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ一２０ＴＰＥＧ４０００ＳｉｇｍａＡＭＥＲＳＣＯ１７第二章将目的基因转入酿酒酵母ＬｉＡｃＥＤｌＡ１ＨｓＮａＯＨＨＣｌＳｉｇｍａＢＢＩＩＣＮＳｉｇｍａＭＥＲＣＫＴｒｉｓ饱和酚（ｐＨ７．８）无水乙醇氯仿甲醇Ｄ．ｓｏｒｂｉｔｏｌａ－ｆａｃｔｏｒ上海生工ＭｌＥＲＣＫＭ哐ＲＣＫＭＥＲＣＫＢＢＩＳｉｇｍａＳｉｇｍａＢＢＩＢＢＩ过硫酸铵ＮａＣｌＧｌｙｃｉｎｅＵｒｅａＳＤＳＳｉｇｍａＣａｌＢｉｏＣｈｅｍＦｅｒｍｅｎｔａｓ内切酶、聚合酶２．１．４主要试剂阳Ｔｒｉｓ?ＨＣＩ溶液（５０ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）０．００５ｍｏｌＴｒｉｓ，２９．２ｍｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ加去离子水至１００ｍ１．ｐＨ８．０。ＥＤＴＡ溶液（０．５ｍｏｌ／Ｌ）１８．６１９ＥＤＴＡ—Ｎａ?２Ｈ２０溶于ｌＯＯｍｌ水中，磁力搅拌剧烈搅匀，以固体Ｎａ０Ｈ调节ｐＨ值至８．０。髓溶液（１０ｍｇ／ｍ１）’１９溴化乙锭溶于１００ｍｌ去离子水中，磁力搅拌数小时，置于棕色瓶中室温保存。Ｎａ０Ｈ溶液（２ｍｏｌ／１）１８天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究称取８．０９ＮａＯＨ固体加水溶解，定容至ｌＯＯｍｌ。ＮａＡｃ溶液（３ｍｏｌ／Ｌ）取４０．８１９三水乙酸钠，加水溶解，以冰醋酸调节ｐＨ至５．２，定容至１００ｍｌ。ＬｉＡｃ（１．０Ｍ）称取１０．２０１９ＬｉＡｃ溶于适量水中，完全融解后定容止１００ｍｌ，过滤除菌。ＴＡＥ缓冲液（无需灭菌）５０×：２４２９Ｔｒｉｓ碱，５７．ｉｍｌ冰醋酸，１００ｍ１０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８：０），定容至１０００ｍｌ。１Ｘ：用时将上述储存液稀释５０倍。破菌缓冲液ＴｒｉｔｏｎＸ－１００２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ．１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ１００ｍｍｏｌ／１Ｔｒｉｓ’ＨＣＩ（ｐＨ８．０）ｌＯｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ１ｍｍｏＵｌＰＥＧ４０００５０％ＰＥＧ８０％（ｖ／ｖ）ＩＯｘＴＥ（ｐＨ７．５）ｌＯ％（ｖ／ｖ）１０ｘＬｉＡｃ贮液１０％（ｖ／ｖ）ＬｉＡｃ溶液：１．０Ｍ，过滤除菌葡萄糖溶液：４０％，１１５℃灭菌３０ｍｉｎ１９第二章将目的基因转入酿酒酵母半乳糖溶液：４０％，１１５＂Ｃ灭菌３０ｍｉｎＳＴＥＴ８％蔗糖，０．１％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ－１００，５０ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ?ＨＣｌ，ＣａＣｌ２溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ），取０．１ｍｏｌＣａＣｌ２溶于去离子水中，定容至１０００ｍｌ。苯酚：氯仿（１：ｌｖ／ｖ，无需灭菌，冷藏保存）ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）２００ｒａｌ５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓａｒｉｅｌ（ｐＨ８．０），２ｍｌ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），定容至１０００ｍｌ。ＣＴＡＢ（５％）称取５克ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ溶于适量水中，加热溶解后定容至１００ｍｌ。溶菌酶（５０ｍｇ／ｍ１）取５０毫克溶菌酶溶于ｌｍｌ水中。ＮａＣＬ（１．２Ｍ）称取７．０１２８克ＮａＣＬ，溶于适量水中，溶解后定容止ｌＯＯｍｌ。２．１．５培养基ＬＢ（Ｌｕｒｉａ—Ｂｅｒｔａｎｉ）培养基：２０天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究液体：１％胰化蛋白胨，０．５％酵母提取物，１％ＮａＣｌ，调ｐＨ＝７．５，１２１＂Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ。冷却至室温加入氨苄青霉素（ｈｍｐｉｃｉｌｉｎ）至终浓度为１９氨苄青霉素／Ｌ培养基。固体：在调好ｐＨ值的液体培养基中加入１．５％的琼脂粉，１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ，冷却至室温加入氨苄青霉素至终浓度为ｌｇ氨苄青霉素／Ｌ培养基。ＹＰＤ培养基：液体：１％酵母提取物，２％蛋白胨，ＰＨ自然，１２１＂Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ，再加入单独灭菌的４０％葡萄糖至终浓度为２％。固体：在ＹＰＤ液体培养基中加入１．５％（ｗ／ｖ）琼脂粉，．１２１。Ｃ下灭菌１５ｍｉｎ。完全极限省却成分培养基（ＣＭ）：ＹＮＢｗ／ｏＡＡ：０．６７％，葡萄糖：２％，Ｄｒｏｐｏｕｔｐｏｗｄｅｒ：０．０８３％，其中含（ｍｇ／Ｌ）：酪氨酸３０谷氨酸１００甲硫氨酸２０精氨酸２０．缬氨酸１５０丝氨酸Ｊ５０苯丙氨酸５０苏氨酸１５０赖氨酸３０天冬氨酸１００异亮氨酸３０其它营养成分（ｍｇ几）：腺嘌呤５０亮氨酸１００尿嘧啶５０?色氨酸１００组氨酸１００省却特定的氨基酸成分，液体培养基ｐＨ５．６，固体培养基加１．５％的琼脂粉，ｐＨ６．５１２１℃下灭菌１５ｍｉｎ。产孢培养基：液体（ｗ／ｖ）：ＫＡｃ１％，酵母提取物０．１％，葡萄糖０．０５％。２１

第二章将目的基因转入酿酒酵母固体：在液体培养基中加入１．５％（ｗ／ｖ）琼脂粉。高效产孢培养基：１％ｉＡｃ０．１％酵母提取物５００．０５％葡萄糖１００ｍｇ／Ｌ腺嘌呤ｍｇ／Ｌ色氨酸ｍｇ／Ｌ亮氨酸ｍｇ／Ｌ组氨酸ｍｇ／Ｌ尿嘧啶１００５０１００注：根据需要可省却特定的氨基酸成分。预产孢培养基：１％ＫＡｃ１％酵母提取物２％蛋白胨５一氟乳清酸（５－ＦＯｂ）培养基：３％琼脂溶液：１００Ｍ高压灭菌。配制１００ｍｌ下列溶液，ＹＮＢＷ／ｏ从１．４９Ｄｒｏｐｏｕｔｐｏｗｄｅｒ０．１７９组氨酸３０ｒａｇ腺嘌呤１０ｍｇ色氨酸２０ｒａｇ葡萄糖４９尿嘧啶２０ｍｇ亮氨酸４０ｍｇ５－ＦＯＡ０．２９在４５℃搅拌（ＦｏＡ需要一定的时间溶解），过滤除菌后。将上述两种溶液混合均匀后倒平板。天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究２．２实验方法２．２．１大肠杆菌感受态细胞的制备与转化２．２．１．１ＣａＣｌ２法１．将ＤＨ５Ｑ接入５ｍｌＬＢ液体培养基中，３７＂Ｃ过夜摇培，２５０ｒｐｍ２．按１％的接种率将液培管中的菌液接种到ＬＢ摇瓶中，３００ｒｐｍ）３７＂Ｃ摇培３ｈ（≥３．摇瓶在冰水中迅速冷却至Ｏ＇Ｃ，分装至冰预冷的离心管（５０ｍ１），冰置数分钟４．４℃，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞，将残留液空干（迅速）５．冰预冷的１０ｒａｌ０．１Ｍ的Ｃａｃｌ。重悬细胞，４＂Ｃ，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞６．１０ｍｌ０．１Ｍ的Ｃａｃｌ。重悬细胞，冰浴１ｈ以上７．４＂Ｃ，４０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ回收细胞８．每５０ｍｌ原培养物用２ｍｌ含１５％甘油的Ｃａｃｌ２来重悬，分装于１．５ｍｌ离心管，２００ｕｌ每管。－－８０℃保藏。９．将１－１０Ｌ质粒ＤＮＡ和ｌｍｌ感受态细胞混匀，置于冰上３０ｒａｉｎ。１０．４２＂Ｃ水浴保温９０ｓ，热休克，置于冰上冷却２ｍｉｎ。１１．加入２倍体积的液体ＬＢ，３７＂Ｃ振荡培养４５ｍｉｎ，离心浓缩菌体，弃上清。１２．用液体ＬＢ悬浮菌体，然后涂布在含有抗生素的ＬＢ平板上，３７。Ｃ恒温培养。２…２１２电转化法１．将２．５ｍｌ新鲜的Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐｌＯ’过夜培养液接种到５００ｒａｌＬＢ培养基中。３７℃，振荡培养至ＯＤ６００为０．５到０．６。．２．冰上冷却１５ｍｉｎ，转移到预冷的离心管中，２～４℃５０００９离心２０ｍｉｎ，收集细胞。用与原培养物体积相等的冰水（２～４℃）清洗两次。３．用５ｍｌ冰水悬浮菌体。整个过程保持细胞的冰冷状态。２～４４Ｃ５０００９离心第二章将目的基因转入酿酒酵母２０ｒａｉｎ。弃上清，用剩余液体悬浮菌体。４．如果即刻使用，将菌悬液倒入另一个预冷的试管中，２～４℃５０００９离心１０ｒａｉｎ。用冰水悬浮细胞，使其终浓度约为２×１０１１个细胞／ｍ１。再将细胞分装在预冷的离心管中。５．如果冷藏备用，加入４０ｒａｌ冰的１０％的甘油，混匀，２，－－，４０ｃ５０００９离心１０ｒａｉｎ。用冰的１０％的甘油悬浮细胞，使其终浓度约为２ｘ１０１１个细胞／ｍｌ。再将细胞分装在预冷的离心管中。于干冰上快速冷冻，－８０＂Ｃ保藏。６．在含４０止感受态细胞的试管中加入１此ＤＮＡ（１０ｐｇＤＮＡ），用微量移液器轻轻搅拌数次，混匀。７．将混合物转移到预冷的电转槽中。擦去电转槽表面水气，插入电转化仪中。８．电转化：设定电压为１７００Ｖ，放电一次。９．立即在电转槽加入ｌｍｌＬＢ液体培养基，转移到一个无菌试管中。３７℃缓慢振荡培养３０－＇－，６０ｍｉｎ。ｌＯ．回收细胞，涂布于含抗生素的ＬＢ平板上，３７＂Ｃ恒温培养。２．２．２小规模提取大肠杆菌质粒法（ＣＴ柚法）１．挑取转化子接入５ｍｌＬＢ培养液的试管中，３７＂Ｃ摇培（２５０ｒｐｍ）过夜。２．在１．５ｍｌ的离心管中离心收获菌体（３Ｘ１．５ｍ１）。３．２００Ｉ－ｔｌＳＴＥＴ重悬菌体。４．加入５９ｌ溶菌酶（２５ｍｇ／ｍ１），混匀后在室温温浴５－－－，７ｍｉｎ。５．上述离心管在煮沸锅中煮沸ｌｍｉｎ。６．１３０００离心１５ｍｉｎ。７．牙签挑去粘稠物（破碎菌体）。８．加入１０Ｉ．ｔｌＣＴＡＢ溶液，混匀，室温２ｍｉｎ。９．１３０００离心５ｍｉｎ，弃上清。天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究１０．３００ＩｄＮａＣｌ溶解沉淀。１１．加入７５０山用冰预冷的无水乙醇，混合后冰上放置２０ｒａｉｎ。１２．１３０００离心１５ｍｉｎ，弃掉上清。１３．７０％乙醇ｌｍｌ洗涤沉淀。１４．１３０００离心５ｍｉｎ，弃去上清。１５．敞开离心管盖子，室温将沉淀凉干。１６．ＴＥ．２０Ｉ－ｔｌ溶解ＤＮＡ沉淀，一２０℃保存。１７．取适量质粒ＤＮＡ进行限制酶消化，琼脂糖凝胶电泳分析。２．２．３ＤＮＡ的限制酶消化１．单酶切体系在１．５ｍｌ离心管中，按以下成分建立酶切体系。１０×酶切缓冲液ｄｄＨ２０．１２ｔｔｌ７－ｘ。山ｘＤＮＡｍ限制性内切酶总体积０．２—０．４“ｌ２０ｍ将体系混匀，在提供酶试剂的厂商推荐温度下温育１～２小时。消化后的产物采用于琼脂糖凝胶电泳分析。２．双酶切体系在１．５ｍｌ离心管中，按以下成分建立酶切体系。２５第二章将目的基因转入酿酒酵母１０×酶切缓冲液２山ｄｄＨ：０１７－ｘｐｌＤＮＡＸＩｌｌ限制性内切酶１０．２－０．４ｍ限制性内切酶２０．２—０．４脚总体积２０山将体系混匀，在提供酶试剂的厂商推荐温度下温育１～２小时。消化后的产物采用于琼脂糖凝胶电泳分析。双酶切使用的公共缓冲液可在厂商网站上检索。２．２．４从琼脂糖中回收ＤＮＡ片段１．切取含ＤＮＡ片段的琼脂糖（１００－－－３００ｒａｇ），按切取重量：溶液Ａ体积为１：３的比例加入溶液Ａ。２．６５＂Ｃ水浴５～１０ｍｉｎ，至胶完全溶化。其间振荡２～３次助溶，溶化后冷却至室温时，加入１５ｍｌ溶液Ｂ，充分混匀。３．将溶液置于离心柱中，静置２ｍｉｎ，８２００ｒｐｍ离心２０＂～３０ｓ。若一次离不完，可分两次离心。４．弃去液体，在离心柱中加入５００ｍｌ溶液Ｃ，８０００ｒｐｍ离心２０－－－３０ｓ，弃去液体。５．重复步骤４。６．１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，甩干剩余液体以除去残余酒精。７．将离心柱置于新离心管中，敞开离心管盖室温放置５～１０ｍｉｎ，使乙醇挥发净。８．加入２５ｍｌ溶液Ｄ（５０℃水浴），静置２ｍｉｎ。９．１３２００ｒｐｍ离心‘３ｍｉｎ，管底溶液即为所需ＤＮＡ。１０．如果直接从溶液中回收ＤＮＡ，则在ＤＮＡ溶液中直接加入３倍体积的溶液Ａ

第二章将目的基因转入酿酒酵母∞靳Ｃ?ｒ－Ｉ吕●∞∞３ｔＣ约加。００．０２０．０４０．０６Ｏ．０８０．１番茄红素量（ｐｇ）图２．１番茄红素标准曲线ＨＰＬＣ标准曲线Ｆｉｇ．２－１ＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓｄａｔａｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅｏｆｌｙｃｏｐｅｎｅ２．３实验结果及分析将经过验证的三个质粒ｚｄｓ、ｐａｒｓ、ｐｓｙ分别通过高效转化转入酵母中，挑取阳性结果提取基因组进行ＰＣＲ检测。２．３．１ＹＥＰｌａｃｌ８１－ｚｄｓ检测结果：哪。雩’ＹＥＰｌａｃｌ蜘鄹。。～Ｆｉｇ．２—２＆时ｌ（２７４２）３－＾Ｔ图２－２ＹＥＰＩａｃｌ８１－ｚｄｓ质粒图谱ＴｈｅｄｉａｇｒａｍｏｆＹＥＰＩａｃ１８１－ｚｄｓｐｌａｓｍｉｄＹＥＰｌａｃｌ８ｌ－ｚｄｓ酶切、ＰＣＲ结果见表２．５：天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红素的研究表２．５ＹＥＰＩａｃ】８ｌ－ｚｄｓ酶切、ＰＣＲ结果ｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲｏｆＹＥＰｌａｅｌ８１－ｚｄｓｚ出转化ｗ３０３酵母平板见图２－３日图２－３转：出的酿酒酵母第二章将目的基罔转入酿酒酵母２．３２ＹＥＰｌａｃｌ９５－ｐｄｓ检测结果“ｆ…＿＼图２—４ＹＥＰｌａｃｌ９５－ｐｄＦ质粒幽谱Ｆｉｇ２－４ＴｈｅｄｉａｇｒａｍｏｆＹＥＰＩａｃｌ９５ｐｄ‘ｐｌａｓｍｉｄＹＥＰｌａｃｌ９５－ｐｄ＊酶切、ＰＣＲ结果见表２－６表２－６Ｔａｂ２－６ＹＥＩ，ｌａｃｌ９５－ｐｄｓ酶切、ＰＣＲ结果ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲｏｆＹＥＰｌａｃｌ９５－ｐｄｓ＿一＿ｌ昌●１…ＬＪＩ，＿ｆｂ∈、Ｂａ＿】ｌｈ耆＿Ｉ取酶切得到／７４９ｂｐ产物Ｐ』ＦｌＲ右粜ｌｌ∥一Ｉ７４９ｂｐ?－－一１７４９ｂｏＮ转化Ⅵ３０３酵母基因组ＰＣＲ结果ｌ转化菌株基因纽ＰＣＲ结果，１、２为ｐ出１７４９ｂｐ条带，３、４为二出ｌ７７０ｂｐ条带天津大学硕士学位论文转基因酿酒酵母产番茄红紊的研究ｐ出转化ｗ３０３酵母平板囵图２－５转＝出和ｐｄｓ的酿酒酵母Ｆｉｇ２—５Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（ｐ出ａｎｄｚｄｓ）ｙｅａｎｐｏｗｅｒ２．３３ＹＣｐ２２－Ｇａｌ－ｐｓｙ检测结果ＴＲＰ１、舢。、４≈亭图２－６ＹＣｐ２２Ｇａｌ－ｐｓｙ质粒图谱Ｆｉｇ２－６ＴｈｅｄｉａｇｒａｍｏｆＹＣｐ２２一Ｇａｌ—ｐｓｙｐｌａｓｍｉｄＹＣｐ２２一Ｇａｌ口∥酶切、ＰＣＲ产物见表２１五第二章将目的基因转入酿酒酵母表２—７Ｔａｂ２－７ＹＣｐ２２Ｇａｌｐｓｙ酶切、ＰＣＲ结果ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰＣＲｏｆＹＣｐ２２一Ｇａｌ—ｐｓｙ曼兰使用：＿ｍＨ卜１２８７ｂｐｐｘｖ旨冒ｘｂａｌ§切验证其连接Ｊｆ－确性，８到９７５ｂｐ条带：Ｐ（Ｒ钝聚ｎ３０３酵母基因自ｌＰＣＲ结果，ｌ、２ｐｄ＾ＰＣＲＩ７４９ｂｐ结果：３、４为二小ｌ，ＣＲ结果Ｉ７７０ｂｐ．５、６为Ｐ州Ｉ，ＣＲ结果１２８７ｂｐ

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