从两种精子检测技术对比看科研实验中创新意识的重要性

从两种精子检测技术对比看科研实验中创新意识的重要性2401

肖清明

（滨州职业学院，山东 滨州 256603）

摘要：精子单细胞凝胶电泳试验和精子染色质扩散试验均是检测精子核DNA链完整性的精确而灵敏的技术，对比两种实验技术在步骤和方法上的异同点以及临床实际应用情况，阐明实验过程中创新意识的重要性。 关键词：精子单细胞凝胶电泳试验；精子染色质扩散试验；创新意识

单细胞凝胶电泳试验于1984年首先提出，广泛用于体细胞DNA链断裂评价。该试验方法经改进后于20世纪90年代中期开始用于精子核DNA链完整性的检测和评价，其方法虽然灵敏，但因难以标准化而一直未能广泛应用于临床。精子染色质扩散试验创立2003年，2005年便开发出试剂盒，现临床上广泛应用于精子质量的检测和评价。

对照两种实验方法的步骤异同，结合笔者于2002~2003年采用单细胞凝胶电泳试验检测不育患者精子核DNA链完整性时的发现，深切体会到创新意识的重要性。

1 精子单细胞凝胶电泳试验（single-cell gel electropherosis，SCGE）

单细胞凝胶电泳试验又称彗星试验，由Ostling等于1984年首先提出，Singh等于1988年改用碱性电泳液，之后又经历了几次改进，其广泛用于体细胞DNA链断裂评价，该方法于20世纪90年代中期开始用于精子核DNA链完整性的检测。

1.1 基本原理 精子细胞膜在细胞裂解液的作用下被破坏，使细胞内的DNA附着在剩余的核骨架上。如果细胞核未受损伤，电泳中核DNA停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象；若细胞核受到损伤，在碱性电泳液中，DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。细胞核DNA受损伤越严重，产生的断链或碱变性碎片就越多，片断也越小，电泳表现为彗星尾越长和彗尾越亮。通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、亮度、出尾率等，判断精子细胞核DNA有无损伤及损伤程度。 1.2 操作流程

1.2.1 制片 先在冰冻玻片上铺上100μl 0.75%的正常溶点琼脂，盖上盖玻片，在室温下静置5 min，为底层凝胶。6μl精子细胞悬液(2×10细胞/ml)与54μl0.75%的低溶点琼脂在37℃条件下充分混匀，并立即铺在底层凝胶上，在4℃静置8 min。120μl 0.75%低溶点琼脂铺在第2层凝胶上，在4℃静置8 min，为顶层凝胶。

1.2.2 精子细胞预处理 玻片在含有2.5 mol/LNaCl、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L Tris、1%硫氰酸肌氨酸钠、1%Triton X-100的弱碱性裂解液(pH10)中4℃条件下作用1 h，然后依次在下列溶液中作用以解聚精子核中DNA：在含有2.5 mol/LNaCl、5 mmol/L Tris、0.05%硫氰酸肌氨酸钠、10mmol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)中性溶液(pH7.4)中4℃条件下作用1 h；在含有2.5mol/LNaCl、5 mmol/L Tris、0.05%硫氰酸肌氨酸钠、10μg/ml核糖核酸酶中性溶液(pH7.4)中37℃条件下作用4 h；最后在含有2.5mol/L NaCl、5mmol/L Tris、0.05%硫氰酸肌氨酸钠、200μg/ml蛋白酶K的中性溶液(pH7.4)中、37℃条件下连续作用15 h。

1.2.3 单细胞凝胶电泳 玻片在含有300 mmol/L醋酸钠、100 mmol/L Tris的弱碱性电解液(pH10)中，在12V(0.46 V/cm)、100 mA、4℃条件下电泳60 min。 1.2.4 染色 用EB或DAPI染色。

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1.2.5 镜检和计数 在荧光显微镜下选择无重叠，荧光信号强的精子核计数。根据彗星尾部DNA含量将精子细胞核DNA损伤程度分为5级(图1)。0级(G0)：<5%，无损伤，精子核完整；1级(G1)：5%~20%，中度损伤，可见彗尾，精子核缩小；2级(G2)：20%~40%，中度损伤，可见明显慧尾，精子核缩小；3级(G3)：40%~95%，重度损伤，彗尾荧光信号强而密，并见明显缩小的精子核；4级(G4)：>95%，完全损伤，仅见荧光强而密的彗尾，精子核基本消失。每个样本重复测试3次，每次计数100个精子细胞。

2 精子染色质扩散试验（(sperm chromatin dispersion test，SCD)

精子染色质扩散试验是由Fernandez等于2003年创立的一种精子DNA完整性检测方法，2005年开发出试剂盒，现临床上广泛应用于精子质量的检测和评价。

2.1 基本原理 没有DNA碎片的精子在经过酸变性和去掉核蛋白，荧光剂染色后，通过荧光显微镜观察有无特征性的光晕。完整的DNA有光晕的产生，而带有DNA碎片化的精子不会产生这种特征性的光晕，根据光晕的有无和大小判断精子的DNA碎片化程度。 2.2 操作流程

2.2.1 制片：精液标本用人输卵管培养液(HTF)(pH=7.2~7.4)调精子浓度为5~10×10/ml；将10 mg/ml37℃的低熔点琼脂糖胶70μl与30μl精液混匀；吸取混匀后的精液悬液50μl滴在被6.5 mg/ml琼脂糖胶包被的载玻片上，盖上盖玻片，于4℃冰箱下固定5 min；小心移走盖玻片。

2.2.2 精子细胞预处理 将载玻片浸入新鲜配的0.08 mol的HCl溶液中7 min，进行DNA变性；将载玻片平行浸入中和裂解液1(0.4 mol/L Tris，0.8 mol/L DTT，10 mg/mlSDS和50 mmol/L EDTA，pH 7.5)15 min；中和裂解液2(0.4 mol/L Tris，2 mol/L NaCl和5 mg/ml SDS，pH 7.5) 5 min；TBE缓冲液(pH 7.5，0.09 mol/L Tris borate和0.002 mol/L EDTA)2 min；依次用70%、9 0%和1 0 0%的酒精脱水2 m i n，风干备用。 2.2.3 染色：瑞氏染色或用EB或DAPI染色。

2.2.4 结果判断：在荧光显微镜下计数500个精子，根据Fernández标准分级，大光晕：晕轮≥精子头横直径；中光晕：介于大小光晕之间；小光晕：晕轮≤精子头横直径1/3；无光晕；退化精子：无光晕且着色浅，形状不规则。大光晕、中光晕精子为DNA完整精子，小光晕、无光晕和退化精子为DNA损伤精子。 3 两种实验方法的比较

单细胞凝胶电泳试验和精子染色质扩散试验均为灵敏的精子核DNA链完整性的检测方法，对照实验步骤可以看出，后者较前者省却了电泳步骤，其他操作步骤及所用试剂相同或相似。 4 讨论

笔者从实验过程中体会到，单细胞凝胶电泳试验的关键步骤之一是凝胶电泳，其要求条件高，且在电泳过程中容易出现脱胶现象，一旦发生脱胶则实验失败。相比之下，SCD省却了电泳，使实验更加简便，既节约了实验成本、缩短了实验时间，又提高了实验成功率，并且易于标准化而很快开发出试剂盒，由此在辅助生育技术得到广泛的临床应用。

单细胞凝胶电泳试验又称彗星试验，该方法于20世纪90年代中期开始用于精子核DNA链完整性的检测和评价。单细胞凝胶电泳试验是一种灵敏的DNA链完整性检测方法，但因其难以标准化而一直未能广泛应用于临床。笔者于2002~2003年采用单细胞凝胶电泳试验检测不育患者精子核DNA链完整性时发现，完整的精子核有“光晕”（halo）现

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象的存在，而有彗尾的精子核细胞（即彗星细胞，表示有DNA损伤）则无“光晕”。笔者想当然认为，光晕现象的产生是由于荧光染色剂未冲洗干净引起，查阅当时文献亦有类同的解释。当时的主要精力集中在对实验方法进行改进在观察实验结果时，对完整细胞核的光晕现象未再深究。当看到SCD试验报道后再查看笔者的实验照片，发现完整的精子细胞均有光晕，而有彗尾的彗星细胞均无光晕现象。该现象也从另一角度证明了SCD试验的可靠性。笔者反思实验过程，虽然在单细胞凝胶电泳试验的方法改进上取得了一定成绩，但仍然是沿着前人的思路墨守成规，而缺乏创新的意识。当时如能在发现“不正常”现象时便改变思维方式，对“光晕”现象进行深究和对比研究，或许能首创精子染色质扩散试验这一更加简便、更加实用的精子质量检测技术。 \

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