应用于PCR技术的DNA聚合酶

关于酶学

第27卷第6期

Vol127　No16长春师范学院学报(自然科学版)JournalofChangchunNormalUniversity(NaturalScience)2008年12月Dec.2008

应用于PCR技术的DNA聚合酶

盛艳敏,杨燕平,吴英杰,王倩倩

(长春师范学院生命科学学院,吉林长春　130032)

[摘　要]DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一,在PCR过程中起着至关重要的

作用,在某种意义上甚至可以说,PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善

其酶学性能,已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研

究历史及现状进行简要综述。

[关键词]PCR;DNA聚合酶;酶学特性

[中图分类号]Q94615　　　[文献标识码]A　　　[文章编号]1008-178X(2008)06-0067-04

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术,是在由DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液等组成的反应混合物中,由DNA聚合酶催化,对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增的反应。在此过程中,DNA聚合酶起着关键性作用,所以自PCR技术产生至今,人们一直在通过各种手段努力寻找高效特异地催化单核苷酸聚合的DNA聚合酶。

1　DNA聚合酶的分类

从大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ被分离和鉴定至今的50年时间里,已有100多个DNA聚合酶相关基因被克隆和测序,它们分别来自于嗜热极端细菌和古细菌。多种天然的和重组的耐热DNA聚合酶也被鉴定和纯化,这些酶大部分是单体酶,在溶液中的分子量一般为80～115KD[1-3]。人们根据核苷酸序列将大肠杆菌酶DNA聚合酶划分为四类,即DNA聚合酶Ⅰ(FamilyA)、DNA聚合酶Ⅱ(FamilyB)、DNA聚合酶Ⅲ(FamilyC)和其它的(FamilyX)[4]。DNA聚合酶Ⅰ主要参与DNA损伤的修复,同时在半保留复制中起辅助作用。DNA聚合酶Ⅲ是DNA复制的主要酶[4]。与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ同源的为A群,该群除酵母线粒体DNA聚合酶Ⅰ外,都来自于原核生物,对双脱氧核苷酸抑制剂敏感,因此可用于DNA序列分析。包括E1coli栖热菌属(Thermus)的DNA聚合酶Ⅰ、芽胞菌属(Bacillus)的DNA聚合酶Ⅰ、噬菌体T5、以及T7DNA聚合酶等。与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ同源的为B群,对双脱氧核苷酸不敏感甚至可以接受诸如双脱氧-UTP、生物素-dUTP或荧光标记的dUTP等修饰过的核苷酸,因此这类DNA聚合酶可用于聚合酶链式反应制备或标记核苷酸。与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ同源的为C群,C群可分为两个亚群,即以蛋白质引导的(protein-prime)和以RNA引导的(RNA-prime)DNA聚合酶。此外真核生物的β-DNA聚合酶是已知最小的DNA聚合酶,只有335个核苷酸残基,与其它DNA聚合酶缺乏同源性,曾单列为X群[5-8]。

目前发现的耐热DNA聚合酶均属于A群或B群。属于A群的都来源于真细菌,如来源于栖热属的Taq(Thermusaquaticus)[6]、Tth(T1themophilus)[7]、Tca(T1caldophilus)[9]、Tfl(T1flavus)[10]、Tfi(T1filiformis)[11]以及来源于芽胞菌属的Bst(Bacillusstearothermophilis)[12];属于B群的耐热DNA聚合酶均来源于古细菌,如来源于高温球菌属的Tli(Theymococcuslitoralis)[13]、焦热球菌属的Pfu(Pyrococcus1furio2sus)[14]和KOD1(Pyrococcussp1)[15]、硫叶菌属的Sac(Sulfolobusacidocaldarius)[16]和Sso(S1solfataricus)[17]等,大量来自B群的DNA聚合酶被称为α-likeDNA聚合酶,因为它们都具有一个保守的真核α-DNA聚合酶氨

[收稿日期]2008-10-15

[作者简介]盛艳敏(1964-),女,吉林洮南人,长春师范学院生命科学学院教授,从事生物化学与分子生物学研究。

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基酸序列,这些DNA聚合酶都已经广泛应用于PCR技术中。

2　早期应用于PCR技术的DNA聚合酶———Klenow片段

1957年A1Kornberg等从大肠杆菌中分离出了一种以DNA为模板催化单核苷酸聚合的酶,称之为Kornberg酶,它是由单一多肽组成的球蛋白,相对分子量为103000Kd。活性区域位于Leu516和His920之间,包括三种不同的酶活性,即5′-3′聚合酶活性、5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性。与其它种类的DNA聚合酶一样,其催化单核苷酸聚合的反应需要引物的存在,并且在37℃时聚合活性最高,催化单核苷酸聚合的速率为1000nt/min。Kornberg酶即为DNA聚合酶Ⅰ。

聚合酶Ⅰ可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶裂解成两个活性片段,较大的C端片段称为Klenow片段,它仍具有5′-3′聚合酶和3′-5′核酸外切酶活性,但失去了5′-3′核酸外切酶活性。较小的N端片段只有5′-3′核酸外切酶活性。Klenow片段就是早期应用于PCR的DNA聚合酶。但是KlenowDNA聚合酶的缺点是在37℃下催化DNA的合成,在60℃时很快就失活,故每一轮PCR都需要追加KlenowDNA聚合酶,使PCR过程繁琐而复杂,同时其亲核反应的掺错率也居高不下,正因为上述缺点而限制了该酶在PCR反应中的应用。其后人们也曾将T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶应用于PCR反应,但是终因它们的热稳定性差而没能得到推广应用[4]。

3　耐热TaqDNA聚合酶的发现和应用

Themusaquatics是一种热栖的可在70℃～95℃下生活的水生真细菌。1988年RandllK1Saiki等从Thermusaquatics中分离纯化到了TaqDNA聚合酶,并将其应用于PCR技术,取代了大肠杆菌Klenow片段,使PCR过程实现了自动连续循环。TaqDNA聚合酶基因全长2496bp,编码832个氨基酸,蛋白分子量为94Kd,以Mg2+作辅助因子,属于DNA聚合酶家族A,和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有非常高的同源性。其功能区域在287～832氨基酸之间,它是一种极端耐热的DNA聚合酶,在9215℃酶活性可持续130min,95℃可保持40min,9715℃5～6min仍可保持约50%酶活性。Taq酶是第一个被应用于PCR的高热稳定DNA聚合酶,也是活性最高的一种耐热DNA聚合酶,具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性,同时还存在非模板依赖性活性[18],但缺乏3′-5′外切酶活性,所以在DNA合成过程中对单核苷酸错配没有校正功能,每一循环错配率高达2×10-4核苷酸碱基,不能很好地保证PCR产物的保真性,并且对于短距离PCRTaqDNA聚合酶尚可以,但对于长距离的片段(6kb以上的片段)就无法完成。近年来利用基因工程方法已经获得了缺少5′-3′外切核酸酶活性和具有3′-5′外切核酸酶活性的Taq酶,从而拓宽了Taq酶的应用范围[19]。由于TaqDNA聚合酶的发现,PCR技术才真正得以推广和应用。

4　有校正功能的耐热DNA聚合酶应用于PCR技术

自PCR技术问世以来人们一直在不断地寻找酶学性能好、保真度高的PCR用DNA聚合酶。继TaqDNA聚合酶之后,人们又陆续发现了Vent1、Deep、Pfu、Tgo和KOD1等耐热的有校正功能的DNA聚合酶。

PfuDNA聚合酶是从喜温的古细菌Pyrococcusfuriosus中获得,因其超强的纠错功能等特性受到人们极大的关注。该酶为2个蛋白亚基(P45和P50)的多聚体,含775个氨基酸,分子量为90KD[18]。

PfuDNA聚合酶热稳定性极强,有5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切核酸酶活性,所以在催化聚合反应的同时可纠正聚合反应过程中的错误掺入。Pfu酶以其比其它校正酶低2～60倍、比TaqDNA聚合酶低6～100倍的低错误率显示出极高的保真度,所以与其它的聚合酶相比,它使产物的错配率大大降低,特别是进行2kb以内的DNA片段的扩增,效果甚佳。

来自PyrococcusSp1的KOD1是另外一个具有强的校正功能DNA聚合酶。其聚合酶基因含有一个由5013个碱基组成的开放阅读框,编码1671个氨基酸,分子量为19312KD,比已知的其它耐热DNA聚合酶平均分子量大许多,其氨基酸序列与来自于Thermococcuslitoralis的TliDNA聚合酶有78%的同源性。该酶属于聚合酶家族的A群,具有很强的3′-5′外切酶活性,而没有或有极弱的5′-3′外切核酸酶活性[20-21]。KOD1酶热稳定性极强,在95℃和100℃的活性半衰期分别是12h和3h,其最适延伸温度为75℃,延伸反应的最适pH是615,单核苷酸聚合反应的错误掺入率与Pfu酶的相当,但是具有比Pfu酶高的延伸速率和持续合成能力[20]。

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Thermococcusgorgonarius是生活在新西兰地热火山口中的硫代谢极端嗜热古细菌,从其中分离纯化的TgoDNA聚合酶也具有强的耐热性。其晶体结构显示具有5′-3′聚合酶活性域、3′-5′核酸外切酶活性域和热适应结构域[22]。氨基酸序列分析表明TgoDNA聚合酶与Pfu酶有高达82%的同源性,具有与Pfu酶相当的扩增效率和扩增忠实性。其聚合酶活性和3′-5′核酸外切酶活性共同保证了高温复制功能和高保真性(错误率:313-212×10-6)。

上述DNA聚合酶因其固有的高保真性和其它独特的生物化学特性已被应用于各种分子生物学研究中,如平端克隆、富含GC碱基对模板的扩增、突变检测、粘末端克隆和定点突变等。它们的发现和使用不仅极大促进了PCR技术的发展和广泛应用,也使其成为分子生物学研究的重要工具。

可是Tgo等DNA聚合酶也存在着一些缺陷。目前已发现与TaqDNA聚合酶相比较,酶的延伸速率较低,其原因是酶本身低的聚合效率和来自于3′-5′核酸外切酶活性的干扰;对于长距离模板的扩增尚不能很好地实现,主要原因是由不能及时纠正或难于纠正的错配引发的“关闭”DNA聚合反应[23224];反应实现的最佳条件比Taq酶的严格等。为此,我们从嗜热古细菌Thermococcusgorgonarius中克隆了TgoDNA聚合酶基因,并利用基因工程技术对聚合酶基因进行了改造,建立了重组TgoDNA聚合酶的大肠杆菌高效表达体系,表达和纯化了新型重组酶,建立了重组TgoDNA聚合酶的PCR扩增方案,并检测了重组酶的部分特性[25-27],获得了新型高活性、高保真和长距离的TgoDNA聚合酶。

5　耐热DNA聚合酶应用于PCR技术所遇问题及展望

酶的开发利用是现代生物技术的重要内容之一。利用基因重组以及定点突变等技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因是生物酶工程的主要内容。

近年来随着以测序为主要内容的人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)完成,HGP已进入了以基因功能研究为主的功能基因组学和蛋白质组学研究阶段,预计在未来10～20年里,人类将解读绝大多数模式生物的遗传密码。对于基因组功能的研究是人类系统、全面地解读和研究生命遗传物质的宏伟计划,具有重大的科学意义、经济效益和社会意义,因此世界各国都投入巨大的资金用于此项研究。但是,目前的主要困难之一是普通耐热聚合酶对高GC和高AT碱基对含量基因组DNA和cDNA扩增困难,还不能实现对上述特点基因组DNA和cDNA的顺利扩增,并且到目前为止尚无较好的解决办法[28-30],故综合研究聚合酶改善其酶学性能,通过获得适于扩增高GC和高AT碱基对含量基因组DNA和cDNA的聚合酶,解决上述基因组研究过程中的问题,具有一定的理论意义和实际应用价值。

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DNAPolymeraseAppliedinPCRTechnique

SHENGYan-min,YANGYan-ping,WUYing-jie,WANGQian-qian

(SchoolofLifeScience,ChangchunNormalUniversity,Changchun130032,China)

Abstract:DNApolymerase,asanimportantfactorofPolymeraseChainReaction(PCR),playsavitalroleinPCRprocess.Inasense,PCRtechnologyisaheat-resistantDNApolymerasetechnique.Therefore,ithasbecomeoneofthehotresearchareasformolecularbiologiststoinvestigateandimprovetheenzymaticfunctionofpolymerase.ThispapergaveanoverviewofDNApolymerase,thehistoryandpresent,appliedinPCRtechnique.

Keywords:PCR;DNApolymerase;enzymaticcharacter

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3qsm.html