细胞生物学实验教案(1) - 图文

实验一 特殊光学显微镜的结构与使用

【实验安排】 3学时 教师讲解演示，学生操作 【目的要求】

1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的特殊部件； 2、掌握暗视野、相差和荧光显微镜的工作原理和使用方法； 3、熟悉暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的基本结构。 【实验用品】特殊显微镜、酵母、牙垢微生物、菠菜、离心机、匀浆机 【实验内容】

1、特殊光学显微镜特殊部件的构造及调节

2、特殊光学显微镜的使用及注意事项 一、暗视野显微镜： 【实验原理及使用】

１、特殊部件：暗视野聚光器——使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。

暗视野显微镜工作原理示意图

2、用途：暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。 3、使用方法：

（1）从聚光器座架上卸下明视场聚光器，换装暗视场聚光器，安装到位并固紧。

（2）把被检样品的玻片标本置于载物台上，需用油浸的暗视场聚光器，要在聚光器上透镜与载片间滴加香柏油，使

之密接。

（3）聚光器光轴的调中。聚光器的光轴要与显微镜的光轴位于同一轴线上。其方法是，用低倍物镜对样品聚焦，随

之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置，当在暗视场中清晰地窥见一光环或圆形光点时，停止升降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，使视场中的光环或光点，调至视场中心位置。

（4）调节聚光器焦点，使之位于被校样品处，转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一最小的圆形光点，此刻即

为聚光器的焦点恰于样品处。 （5）更换需用的高倍物镜进行镜检观察。 4、注意事项：

（1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。 （2）使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油浸，使两者密接。否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射，照明光线照射不到被检样品，呈现不出暗视场照明的效果。

（3）载片厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后，产生空心照明光锥，即中心为暗区，而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上很短的距离，因此，载玻片的适宜厚度应在0.8一1.2mm。

（4）载玻片和盖片应清洁无伤痕，否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照明。

（5）照明光源的照明强度要高。因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品，若照明强度过弱照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果，目前多应用高功率的溴钨灯作为照明光源以提高其照明强度。 二、相差显微镜：

1、原理：在显微镜下镜检时，视场内的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化．即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。

相差方法法应用于生物学的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚于失真。因此才使相差法显得异常重要。

相差是指同—光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某—时间上光的波动所达到的位置。

一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨这种差别的。只有当变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。

用肉眼看不到的相差．只要利用衍射和干涉现象．把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。

相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件；在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。

为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板，在圆形相板的平面上．有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分；

（1）共轭面：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。 (2)补偿面(comPIemQtagy are3)：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。

在相板的共扼面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变．从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。在后焦面上装有种类不同的相板的物镜称为相差物镜。

2、相差显微镜特殊附件：相差物镜、带环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜、绿色滤色镜。

（1）相差物镜： 相差物镜是显微镜特有重要装置。相位板涂有氟化镁，可将直射光或衍射光相位推迟1/4λ。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。

明反差或负反差：是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，直射光被相板的共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质)推迟1／4波长，同时吸收80％一90％，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟l／4波长，两者(直射光与衍射光)有完全相同的相位，合成波P等于直射光s与衍射光D之合，即P＝s十D，故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。

B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，结构比周围介质更加变暗，形成暗反差（或称正反差）。

暗反差或正反差是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面(因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质)的衍射光推迟1／4波长，使衍射光与直射光的相位相差1／2波长，同时，直射光在共轭面(上涂吸光物质)被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波(P＝s—D)振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。

根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜，聚光镜下面设有环状光阑．物镜后焦面装有相板。

（2）带环状光阑的转盘聚光器：位于镜台之下。普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用。环状光阐的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转换前端朝向使用者一面有标示窗(孔)，转盘上的不同部位标有0、l、2、3和4或0、10、20、40和100字样，通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40、4或l00，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入标示窗内之数字．表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。

（3）合轴调中望远镜：合轴调中望远镜简称CT，又名合铀调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有较长焦距的一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔(亮环)与相差物镜相板的共

扼面环孔(暗环)的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差物镜必须匹配，且环状光阑的环孔与相差物镜相板共扼面的环孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠。以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光路中前述两环的影像较小、一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，需借助合轴调中望远镜。

（4）绿色滤色镜：相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜或PL物镜，消色差物镜最佳清晰范围的光谱区为510-630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。所以，使用相差物镜时在光路上加用透射光线波长为500一600nm左右的绿色滤色镜．使照明光线中的红光和蓝光被吸收。只放过绿光，可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。 3、使用方法： （1） 打开光源

（2） 在明视野下对光、调焦。观察透明标本时要缩小光阑。

（3） 旋转转盘聚光器，使环状光阑直径和孔宽和所使用的相差物镜相匹配，并充分开大虹彩光圈。

（4） 合轴调中：拔出一目镜，换上合轴调中望远镜，用左手固定其外筒，一边看望远镜，一边用右手升降内筒

调焦，准焦时即可看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可固定望远镜。升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，再左右前后调节光阑的侧边，使亮环和暗环完全重合。

（5） 取下望远镜，换上目镜，即可进行观察。 4、注意事项：

（1）载物片必须平整、均匀；标本不能太厚，否则相差显微镜成像效果不好。 （2）标本在有水的环境中，要用水封片等，成像效果明显。

（3）载物片表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑，影响观察效果。 （4）光路上最好加单色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。

（6） 注意当换不同倍率的物镜时，都要选用相一致的相板和相环，并重新调中。否则，相差显微镜成像效果不

佳。

三、荧光显微镜

1、实验原理：荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。

某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热能或用于光化学反应外．相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。

某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等．经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、丫叮橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。 2、荧光显微镜的基本装置

( 1 )光源：采用高压汞灯。汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。 (2)滤色镜系统：按用途或功能，主要分为下列两类；

激发滤色镜：激发滤色镜的作用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光。荧光染料均有一定的吸收光谱(激发峰值)，利用滤色镜对光线选择吸收的能力．选用其透射光谱。恰为荧光染料的最大吸收光谱(激发高峰)的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中选择透过最宜波段的光线供使用。激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。

阻断滤色镜：阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间．用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线．以防伤害眼睛，使荧光透过。选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光。

荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一重要的分色镜系统——二向色镜，位于汞灯和激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的垂直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能。在荧光显微术中承当色光的“分流“作用。

3、荧光显微镜的光路：荧光显微术按激发光对样品的激发方向或方式区分为透射式和反射（落射）式两类。实际应用上多用反射式。

透射荧光显微术光路：透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。其具体光路如下：

汞灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。

反射荧光显微术光路又称落射荧光显微术光路：因激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品．激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。其光路如图2—10。 4、使用方法：

① 经荧光染料染色的样品放在载物台上，先用溴钨灯透射照明，用低倍物镜聚焦，待寻找到最佳影像后，熄灭溴

钨灯，改用汞灯。 ② 点亮汞灯，观察。

5、注意事项：使用汞灯严禁频繁开闭，点亮后欲暂停使用时，不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭后．不能立刻点亮，经5一l0min待汞灯冷却后再通电点亮。 使用油浸物镜时，应用无荧光浸油。 6、作业：

（1）为什么暗视场照明的视场暗黑，样品影像明亮?

（2）使用暗视场照明时，为什么必领在聚光器与载玻片间进行油浸? （3）相差显微镜有哪些特有的附件，其构造如何？ （4）相差显微镜镜检时．为什么要用绿色滤色镜?

o

（5）为什么相差显微镜可以直接观察活体样品？ （6）什么是荧光?它是怎佯发生的? （7）荧光显微术为什么要以汞灯当光源？

（8）激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及其区别?两者有何关系? （9）二向色镜的作用原理?如何选用?

实验二 血涂片的制作和细胞形态观察及细胞计数

【实验安排】 ( 共 3学时 ) ：

1、教师讲解实习内容，示范血涂片制作、染色 ( 约 30 分钟 ) 。

2、同学两人一组，相互采血，各自独立完成血涂片制作、染色、红细胞计数 ( 约 120分钟 ) 。 3、书写实验报告 【目的要求】

1、掌握血涂片的制备染色方法

2、认识各种血细胞的典型形态，了解细胞形态的多样性 3、掌握细胞计数板的结构和细胞计数方法 一、血涂片的制备与血细胞形态观察 【实验原理】 1、血涂片的制备：

涂片是一种基本的临时制片技术。血涂片是血液学研究中最基本的技术。血涂片的制作就是将血液样品制成单层细胞的涂片标本的过程。经过瑞氏染色，对各种血细胞形态进行观察。 2、瑞氏染色原理：

瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。

美蓝(又名亚甲蓝mehylene blue)，通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为天青. 伊红(又名曙红cosin)通常为钠盐即伊红钠。

美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀, 即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后, 又重新解离为带正电的美蓝（蓝色）和带负电的伊红离子（红色）。

细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用. 各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样. 因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩

嗜酸性颗粒与酸性染料伊红结合染粉红色;

嗜碱性物质与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色; 中性物质成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色; MCL

+

–

+ NaE

+–

ME + NaCL 【实验用品】

1、 器材：显微镜、医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、染色缸 2、 试剂：瑞氏染液、蒸馏水、pH6.4－6.8 PBS缓冲液 【方法与步骤】

1、 血涂片的制备与染色观察

(1)、采血：先用75%酒精棉球消毒左手无名指局部皮肤。等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约 2 毫米。

待血液从针孔流出，用干棉花擦去第一滴血。

(2)、涂片：轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。将血滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的

推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后使推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜。

（3）、待干：血涂片制成后可手持玻片在空中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.

（4）、染色：将血膜平放在染色架上. 加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定1～3分钟. 滴加等量缓冲液或新鲜

蒸馏水,与染料混匀染色5-10（2～5）分钟. 用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。

（5）、观察：分别在低倍镜、高倍镜、油镜下观察血细胞的形态。 二、红细胞计数 【实验原理】

1、血细胞计数板的结构血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板，在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格，每个大方格的容积为0.1ul。

四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。

中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。

2、血细胞计数：用相应的稀释液将血液稀释若干倍，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。 稀释血液有血细胞吸管法和试管法，本实验采用后者。 计算公式：

5个中方格内红细胞数×5×10×10×200（稀释倍数）= 红细胞数/L血液 【实验用品】

1、 器材：显微镜、血细胞计数板、移液管 2、 试剂：生理盐水、抗凝全血 【方法与步骤】

1、 血液稀释：用移液管量取0.1ml抗凝全血，加入19.9ml生理盐水中稀释，混匀。

2、 充液：取干洁的计数板，置于水平的桌面上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，

将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃，再重新充液。 3、 计数：找到计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺

序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。

4、 计算：按计数室构造及血液稀释倍数,将红细胞计数结果换算成每升血液

中红细胞的个数。 【实验注意事项】

1、 使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干

燥,中性、无油腻。

2、 细胞染色对氢离子浓度十分敏感,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,冲洗用水应近中性, 否则各种细胞染色反应异

常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。

3、 推片时用力要均匀，否则容易形成波浪状，厚薄不匀。

4、 一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐, 两侧留有空隙。

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5、 血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落, 因此血膜必需充分干燥. 血片制好后最好立即

固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。

6、 染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长，或应适当增

加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.

7、 染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.

8、 冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.

9、 充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。 10、计数板、盖玻片、吸血管、血片等用过后必须立即按要求洗涤干净。 染色结果

在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚, 粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色. 【实验报告】

1、 记录血涂片中各种类型细胞形态及染色结果 2、 计算每升血液中红细胞的数量

实验三 叶绿体的分离与观察

【实验安排】 ( 共 3学时 ) ： 1、教师讲解( 约 30 分钟 ) 2、同学六人一组，分离叶绿体 3、书写实验报告 【目的要求】

1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法 【实验原理】

将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。然后在3000 r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 【实验用品】

(一) 材料 新鲜菠菜

（二）器材 普通离心机、研钵、天平、光学显微镜、250m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、10m1离心

管10 支、纱布若干、载玻片和盖片等。 （三）试剂 0.35mol/L NaCl 溶液，0.01%丫啶橙 【方法与步骤】

1. 游离叶绿体的制备与观察

（1） 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml的0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织

捣碎机。

（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。 （3）将匀浆液用6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。 （4）取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。弃去沉淀。

（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。 （6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。

（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。

（8）取叶绿体悬液1 滴滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察自发荧光。

（9）取叶绿体悬液1 滴加0.01%丫啶橙1滴混合后，滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察次生荧光。 2、菠菜叶手切片观察

用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1滴0.35mol/L的NaCL,加盖片后轻压，置显微镜下观察。

（1）在普通光镜下观察。 （2）在荧光显微镜下观察。

（3）用同样方法制片，但滴加l一2滴0.01％丫啶橙染液染色染色1min，洗去余液，荧光显微镜下观察。 3. 组织中叶绿体的观察

取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。 【实验结果】

一、叶绿体的分离与观察

1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色自发荧光；

3. 加入丫啶橙染色后，叶绿体发出桔红色次生荧光．而其中混有的细胞核则发绿色荧光。 二、菠菜叶手切片观察

1、在普通光镜下可以看到3种细胞

(1)表皮细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。 (3)叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。

叶绿体呈绿色檄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

2．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱，气孔发绿色荧光。两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。

3．用丫啶橙染色后．叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光、气孔仍为绿色， 三、组织中叶绿体的观察

1. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。

2. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时呈单一或多个排列。另外，视野

下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。 3. 叶脉导管呈螺纹状。

4. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。

5. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。 【实验报告及作业】

1. 画出分离后的细胞组分（注明形态的放大倍数）。 2. 分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？

实验四 细胞膜的通透性 实验五 植物凝集素对RBC的凝集作用

【实验安排】

1、实验原理讲解；（30分钟） 2、细胞凝集反应；（40分钟） 3、细胞膜的渗透性。（50分钟）

4、实验小结 ：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。 （15分钟）

【实验目的】

1、 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 2、 掌握细胞凝聚的原理； 3、 熟悉凝集素；

4、 了解凝集素对细胞凝集的特异性。 【实验原理】 1、细胞膜的渗透性

渗透：在半透膜隔开的两种不同浓度的溶液之间，水分子通过半透膜由低浓度一侧流向高浓度一侧的现象。 扩散：在半透膜隔开的两种不同浓度的溶液之间，溶质分子通过半透膜从高浓度一侧向低浓度一侧移动的现

象。

等渗溶液：渗透压相等的溶液。

渗透压：在渗透作用进行时，溶液中溶质所具有的吸引和保留水分子的力量称为渗透压。

当红细胞置于不同种等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，有的溶质可透入，有的不能渗入。渗入红细胞的溶质就可提高红细胞的渗透压，使细胞外水分进入红细胞，引起细胞膨胀破裂，导致溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。 2、细胞凝集反应：

细胞外被：细胞膜外表面的一层粘多糖物质。参与细胞粘着、细胞识别、细胞生长分化、免疫反应等；

凝集素：一类含糖的，并能与糖专一结合的蛋白质，具有凝集细胞，刺激细胞分裂的作用。

凝集素的特点：一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力；另一方面，凝集素具有多价结合能力。

凝集原理：与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成 “桥”的结果。加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。

凝集素是一类从各种植物种子和动物组织中提取的糖蛋白或结合糖的蛋白。因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A（ConA）、麦胚凝集素(WGA)、植物血激素(PHA)、花生凝集素(PNA)等，凝集素(Ietin)是其总称。日前已纯化并鉴定的植物凝集素有近100种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白和糖脂中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力．如刀豆素A与吡喃糖基甘露糖结合，麦芽素与N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N—乙酰乳糖胺结合。因此，凝集素可以作为研究细胞膜结构的探针。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其生物活性，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。在探索细胞分化、增生和恶变的生物学演变过程，显示肿瘤相关抗原物质，以及对肿瘤的诊断评价等方面均有一定的价值。 【实验用品】

（一）、材料：人血细胞、土豆。

（二）、器材： 离心机、载玻片、天平、滴管、刀片、小烧杯，试管、试管架，移液管、吸耳球、秒表。 （三）、试剂： 1. 蒸馏水。

2. 0.17mol/L NaCl 溶液。 3． 0.17 mol/L NH4Cl 4． 0.17 mol/L NaNO3溶液。 5. 0.12 mol/L Na2SO4 溶液。 6. 0.32 mol/L 葡萄糖。 7. 0.32 mol/L 甘油。

8. 0.32 mol/L 乙醇。 9.

0.32 mol/L 丙酮。

10. 生理盐水 11. PBS缓冲液 【实验步骤】 一、细胞膜的通透性

1、血细胞悬液的制备： 血液：生理盐水 = 1：10 2、低渗溶血观察： 3ml蒸馏水+ 0.3ml RBC悬液，混匀。 溶血现象的观察：透明度、离心

3、RBC对物质的渗透性观察： 3ml溶液+ 0.3ml RBC悬液 试管编号

1、0.17mol/LNaCI+RBC 2、0.17 mol/L NH4Cl+RBC 3、0.17 mol/L NaNO3+RBC 4、0.12 mol/L Na2SO4 +RBC 5、0.32 mol/L 葡萄糖+RBC 6、0.32 mol/L 甘油+RBC 7、0.32 mol/L乙醇+RBC 二、细胞凝集反应

1、提取植物凝集素：土豆去皮，称取20g ，切成薄片，加入100mlPBS缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶

性土豆凝集素） 2、制备2%的RBC悬液：

（1）、洗涤血细胞：2ml抗凝全血中加入8ml NS，2000r/min离心5min,弃去上清，再加入生理盐水，反复洗涤5

次；

（2）、制备2%的血细胞悬液：经过洗涤的RBC，按压积用生理盐水配成2%的RBC悬液。

（3）、细胞凝集观察：载玻片上滴一滴土豆凝集素 ，再滴一滴2％红细胞悬液 ，充分混匀，静置20 min，观察血

球凝集现象。

PBS缓冲液加2％血细胞悬液作为对照实验 【作业】

1、 分析比较细胞膜通透性实验中所观察到的结果 2、 推断下列溶液的溶血反应：

0.17mol/L KCI 、0.17mol/L KNO3、0.12mol/L MgCI2、0.12mol/L(NH4)2SO4、0.32mol/L甘露醇、0.32mol/L蔗糖

是否溶血

溶血时间

结果分析

3、绘图表示血细胞凝集现象，并说明原因。

表6—1 常见的凝集素一览表

凝 集 素 花生（ Peanut agglutinin） 刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin） 蓖麻（Ricinus communis agglutinin） 扁豆（Lens cuinaris agglutinin0 豌豆（Pisum satiwum agglutinin） 菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin） 大豆（soybean agglutinin） 荆豆（Ulex europeaus agglutinin） 麦胚(Wheat germ agglutinin) (Bandeiraea simplicifolia agglutinin) 双花扁豆（Dolichos bifows agglutinin） 槐（Sophora japonica agglutinin） 缩 定 PNA ConA RCA LCA PSA PHA SBA UEA WGA BSA DBA SJA 特异性结合 D—半乳糖、Gal(1→3)—GalNAC D-葡萄糖、D-甘露糖 D—半乳糖、D-GalNAC>半乳糖 D-甘露糖、D—葡萄糖 D-甘露糖 D-GalNAC D-GalNAC>>D-半乳糖 L-岩藻糖 D-GalNAC、NANA D-半乳糖 D-GalNAC D-半乳糖、D-GalNAC 实验六 DNA的Feulgen染色

【实验安排】

1、讲解实验原理、操作过程、注意事项。 2、分组实验：6人一组 【实验目的】

1、 掌握Feulgen反应显示DNA的组织化学过程 2、 掌握Feulgen方法的基本原理 3、 了解DNA的分布部位 【实验原理】

利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

标本经1N HCl 、60℃水解，可将DNA分子中嘌呤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键打断，使嘌呤脱下，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色，从而显示出DNA的分布。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应。

2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

Schiff试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸。

碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。碱性品红原为桃红色，当与亚硫酸作用时还原，使醌型变为苯型，由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱，当它与醛基作用时，其分子式又恢复为醌型结构，呈现紫红色。 【实验用品】

1、 器材 显微镜、立式染色缸、水浴锅、镊子，盖玻片 2、 材料 用carnoy’s固定液固定的洋葱根尖。

3、 试剂 1mol/L HCl、Schiff氏试剂、carnoy’s固定液、漂洗液、0.5%亮绿水

溶液 【实验步骤】 （一）、实验组 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、

carnoy’s固定液固定的洋葱根尖放入蒸馏水中漂洗 移入1 mol/L HCl的染色缸内清洗1min 60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min 取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液 蒸馏水冲洗3次（使水解停止） Schiff试剂中染色40min

用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料) 流水冲洗5 min

9、 10、

蒸馏水洗片刻

1%亮绿复染数秒钟（注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）

（二）对照

省略步骤3、4，其余同实验组 【实验结果】

细胞核中的DNA呈紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为绿色。 【注意事项】 1. 对照的制做

进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假阳性反应。 2. 水解时间

Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。 3、Schiff试剂的作用

Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。 【实验报告】

1、绘图表示Feulgen反应的染色结果 2、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

Feulgen方法应注意的几个问题： 1. 对照切片的制做

实验七 细胞骨架的光学显微镜观察

【实验目的】

掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。 【实验原理】

细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。

光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。

由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝。 染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。 【实验用品】

1、 实验材料：新鲜洋葱鳞茎

2、 实验器材：普通光学显微镜，小烧杯，滴管，试剂瓶．载玻片，盖玻片，镊子、吸水纸，擦镜纸 3、 试剂

1） M缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为： 50mmol/L咪唑(MW:68.08), 50mmol/L KCl(MW:74.55),

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30), 1mmol/L EGTA(MW:380.36), 0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24), 1mmol/L DTT(MW:154.3) 2） 6mmol/L PBS磷酸缓冲液 （pH 6.5）:

KH2PO4 : Na2HPO4·2H2O = 7:3 (见附录3 查磷酸缓冲液的配置) 3） 0.9% 生理盐水

4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-缓冲液

5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL 6） 0.2% 考马斯亮蓝R250染液 200mL: 考马斯亮蓝R250 0.2g, 甲醇 46.5mL, 冰乙酸 7mL, 蒸馏水46.5 mL 各种试剂成分的作用：

1、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂，适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。

2、M－缓冲液 和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压

3、EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度 。 4、戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态 5、考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色） 【实验步骤】

1、撕取洋葱鳞茎近中轴内表皮约l cm大小和靠近外层鳞片内表皮约l cm大小做对照，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。 2．吸去磷酸盐缓冲液．用1％Triton X—100处理60min。 3．吸去Triton X—100液，用M缓冲液洗3次，每次5min左右。 4．用3％戊二醛固定30min。

5．再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min。 6．0.2％考马斯亮蓝R250染色15min(在载玻片上)。

7．用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。 【实验结果】

洋葱不同鳞茎部位光镜观察结果 1、取材

2

2

2、光镜观察结果

【结果分析】

1、洋葱不同鳞茎部位光镜观察结果 2、人口腔上皮细胞骨架观察结果 【注意事项】

1、取洋葱近中轴内层中下部的内表皮细胞 2、用滴管吸取缓冲液漂洗时不要洗掉样品 3、染色、水洗均在表面皿上操作

4、显微镜观察时先用低倍镜找，找到后转高倍镜观察 人口腔上皮细胞的光镜观察

1、涂片：用干净牙签刮取人口腔上皮细胞，置于1.5ml离心管中，加1ml生理盐水，混匀后3000转离心10分钟，剩0.5ml上清液，吹管吹打均匀、涂片、晾干。 2、漂洗：M缓冲液洗3次。

3、处理：1％Triton X－100 37℃处理30分钟，M缓冲液洗3次。 4、固定：3％戊二醛固定15分钟，磷酸缓冲液洗3次，滤纸吸干。 5、染色：0.2％考马斯亮蓝R250染色5分钟 6、封片：水洗制成临时片，镜检。 人口腔上皮细胞骨架观察结果

实验八 线粒体的超活染色与观察

【实验目的】

1. 观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。 2. 学习一些细胞器的超活染色技术。 【实验原理】

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化

以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分．主要是染料的“电比学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离产．而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作入活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀谈的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具备溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性。易于被细胞吸收。詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色．这可能是与液泡中某种蛋白质有关。 【实验用品】

（一）材料 人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞

（二）器材 显微镜、恒温水浴锅、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 （三）试剂 1．Ringer 溶液

氯化钠 0.85g 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml

2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）

称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。 3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）

取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。 4．10％、1：3000中性红溶液

称取0.5g中性红溶于50m1 Ringer 溶液。稍加热(30-40C)使之很快溶解。用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存。否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1％中性红溶液1m1加入29m1 Ringer 溶液混匀。装入棕色瓶备用。

o

【实验操作】

1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴詹纳斯绿B 应用染液。

(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色

10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。

(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分

布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。 2. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察

(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，

染色10～15min。

(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒

体的形态与分布。

3、植物细胞液泡系的中性红染色观察 （1）实验前，培养大蒜根尖

（2）．用双向刀片把根尖(约l一2cm长)小心切取一纵切面，放入载玻片中内的1：3000中性红染液中，染色5—

10min。

（3）吸去染液，滴一滴Ringer 溶液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖片，使根尖压扁，利于观察。 （4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，

这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区，在一些已分化长大的细胞，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧近细胞壁处。 【实验报告及作业】

1．用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?

2．根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅? 3、绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞中线粒体的形态与分布。

实验九 离子胁迫诱导洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡

【实验安排】 1、 理论讲解 2、 一人一组操作 【实验目的】

1、 了解细胞凋亡的形态学特征 2、 了解环境胁迫对细胞凋亡的诱导作用 【实验原理】

细胞凋亡(apoptosis) 是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为,是一个主动和高度有序的过程。细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。

细胞凋亡的研究最早始于对动物的研究。植物细胞由于覆有细胞壁,难于操作与检测。因此,凋亡研究相对起步较晚。现在许多研究证明,植物中也普遍存在凋亡现象,如植物正常生长发育过程(胚的发育,导管筛管的形成,根、茎、叶的发育等)、对环境的胁迫反应及被病原体侵入引起的超敏反应中等。

本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料,以不同浓度Ca量凋亡小体的形成。

NaCl 、CaCl2 等离子胁迫剂能刺激线粒体外膜上的受体,使线粒体膜通透性改变,线粒体跨膜电位的消失,线粒体通透性增高,从而导致细胞色素C(Cyt C) 、凋亡诱导因子(AIF) 等促凋亡物质的释放,最终导致细胞凋亡。

目前的研究表明,在许多细胞凋亡过程中,都伴随胞内自由Ca的大幅增加,特别是在凋亡早期,Ca急剧增加,提示Ca

2 +

2 +

2 +

2 +

2 +

和Na作为凋亡诱导剂,得到明显的诱导效果,观察到大

+

往往表现出

可能是启动细胞凋亡的早期信号。细胞内、外一些凋亡因子,可能激活内质网、线粒体上的钙通

2 +

2 +

道,使其中的Ca大量释放,并打开质膜上的钙通道,使胞外Ca内流,导致细胞质内Ca增加,进而诱导细胞凋亡。而Ca

2 +

依赖的凋亡信号途径又可以被高盐(NaCl)所诱导。本实验中CaCl2 中的Ca

2 +

2 +

2 +

可能通过细胞质膜上的钙通道进入

细胞质,使细胞质内Ca浓度急剧增加,从而高效诱导细胞凋亡。并且,Ca还能激活相应的核酸内切酶及参与凋亡相关信号的转导等。因此CaCl2对凋亡的诱导效率比单纯的盐胁迫剂NaCl略高。 【实验用品】

1、材料： 洋葱鳞茎内表皮 2、器材：显微镜、载玻片

3、试剂：0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2；改良苯酚品红染液 【实验步骤】

1、预处理及洋葱鳞茎内表皮细胞凋亡的诱导 取新鲜洋葱室温下于清水中培养数小时,使其活化。

2、自培养好的洋葱鳞茎上切取1cm 左右的内表皮若干,分成三组。第一组是正对照,为正常细胞。第二组是试验组,分四管,每管10 片洋葱内表皮,分别于0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2中培养。第三组是负对照,为煮沸5min 的坏死细胞。

3、细胞凋亡的形态学观察 分别于2 、4 、6 、8 、10 h 取样,改良苯酚品红染液染色20min后制片。观察细胞形态变化。 【实验结果】

1、 未经处理的正对照组,细胞膜完整,细胞核呈球形、染色均匀,细胞质均匀透明。

2、 经煮沸处理5min 的负对照组,细胞壁、细胞膜裂解,细胞核有裂解现象,细胞质内分布有不均匀碎末状物质,细

胞内物质外溢,不能保持细胞的完整性。

2

3、 经0.1MNaCl 、0.5MNaCl、0.1M CaCl2 、0.5MCaCl2 处理的洋葱内表皮细胞,均能诱导产生凋亡现象。随处理时

间的增长,凋亡细胞数目大大增加,凋亡的形态学变化也越来越明显，但同时坏死细胞数量大大增加。细胞膜破损,细胞核裂解,细胞内含物外泄,不能保持细胞完整性。

实验十 巨噬细胞吞噬现象的观察

【实验安排】

1、 讲解教学内容，示范小鼠的抓取、腹腔注射以及处死方法 2、 学生每六人一组，解剖一只小白鼠 【实验目的】

1、 通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作 用的过程及其意义。

2、掌握小鼠腹腔注射给药和脊椎脱臼处死方法。 【实验原理】

细胞吞噬作用原来是单细胞动物摄取营养物质的方式、也是原始防御作用。随着动物界的进化,在高等动物中，则发展生成大小两类吞噬(即巨噬细胞和嗜中性粒细胞)，专司吞噬作用，成为非持异免疫功能的重要组成部分。

巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成，然后进入血液到达各组织内，并进一步分化为各种巨噬细胞。当病原微生物或其它异物侵入机体时，能招引巨噬细胞，而巨噬细胞又有趋化性，能响应招引因子的招引，产生活跃的变形运动，主动向病原体和异物移行，在接触到病原体或异物时，即伸出伪足，将之包围并内吞入胞质，形成吞噬泡，继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合，形成异噬溶酶体，通过其中水解酶等作用下，将病原体杀死，消化分解，最后将不能消化的残渣排出细胞外。

通过观察细胞的吞噬能力可以分析判断机体的免疫水平。 【实验用品】

(1)器材；显微镜、注射器、载玻片、盖玻片、解剖剪、镊子、解剖盘。 (2)试剂：中华墨汁 用生理盐水1：7稀释、研磨，用前煮沸，凉后待用。 (3)材料：小白鼠 【实验步骤】

1、在实验前一天，给小白鼠腹腔注射稀释墨汁1rnl，以诱导腹腔内产生较多的巨噬细胞。

注射时先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上。用左手拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按任尾巴及后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部后1/2处的—侧注射。 2、实验时．每组取一只注射过的小白鼠，再次腹腔注射稀释墨汁1ml，轻按小 白鼠腹部．使悬液分散。

3、20min后，用脊椎脱臼法法处死小鼠(右手抓住鼠尾，用力向后拉．左手拇指与食指同时向下按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致鼠死亡)。

4、将小鼠置于解剖盘中，剪开腹部，把内脏推向一侧，用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液。 5、每入取一张干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。 【注意事项】

1、腹腔注射时进针勿过深．否则易损害肝及血管等，造成出血致死。 2、 观察时，调节集光器使显微镜视野中光线稍暗些。 【实验结果】

将视野光线调暗，高倍镜下可看到许多体积较大的圆形或形态不规则的巨噬细胞，胞质中含有数量不等的墨汁颗粒，可看到巨噬细胞吞噬墨汁过程中的不同阶段情况。有的墨汁紧贴附于巨噬细胞表面，有的部分或全部被巨噬细胞吞入，形成吞噬泡。有的巨噬细胞内的吞噬泡已与溶酶体融合，正在被消化。 【实验报告与作业】

1.绘制巨噬细胞吞噬墨汁的过程图。 2．为什么要事先向小鼠腹腔注射墨汁？ 3．细胞的吞噬活动对生物体有何意义?

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