1143206 - 王震 - 几种辣根过氧化物酶底物的合成

中国药科大学本科生毕业论文（设计)

中国药科大学

本 科 毕 业 论 文

论文题目 几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成 英文题目 synthesis of several substrate for

horseradish peroxidase

专 业 制药工程 院 部 工学院 学 号 1143206 姓 名 王震 指导教师 孙海鹰

课 题

完成场所 中国药科大学江宁校区

论文工作时间： 2015 年 3 月 至 2015 年 6 月

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几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成

目录

摘要 ..................................................... 1 前言 ..................................................... 2 第一章 辣根过氧化物酶底物的发展 .......................... 3 1.1 色原底物 ............................................. 3 1.2 荧光底物 ............................................. 3 1.3 常见的化学发光底物 ................................... 4 1.3.1鲁米诺化学发光体系 .................................. 4 1.3.2过氧草酸酯类 ....................................... 6 1.3.3吖啶及其衍生物...................................... 6 第二章 吖啶环上无取代吖啶酯的合成 ........................ 8 2.1引言 ................................................. 9 2.2 操作过程 ............................................ 10 2.2.1 N-苯基茜素的合成 ................................. 10 2.2.2 吖啶-9-羧酸的合成 ................................ 10 2.2.3 吖啶-9-酰氯的合成 ................................ 11 2.2.4 两种吖啶-9-羧酸苯酚酯衍生物的合成 ................ 11 2.2.5 9-苯氧羰基-10-吖啶三氟甲基磺酸盐的合成 ........... 12 2.2.6 还原反应 ......................................... 12 第三章 吖啶环上有取代吖啶酯的合成 ....................... 14

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3.1 引言 ................................................ 14 3.2 操作过程 ............................................ 15 3.2.1 异亚硝基乙酰对甲苯胺的合成 ........................ 15 3.2.2 5-甲基靛红的合成 ................................. 15 参考文献 ................................................ 16 致谢 .................................................... 18

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几种辣根过氧化物酶(HRP)的底物的合成

1143206 王震

摘要：辣根过氧化物酶是一种以亚铁血红素为氧化还原中心的过氧化物酶，从辣根等植物的根部提取而来，现在已经被广泛地应用在免疫分析、医学检测、荧光分析等众多领域。化学发光试剂是辣根过氧化物酶常见的一类底物，其中吖啶酯及其衍生物又是一类常见的高效化学发光试剂，因此本文中主要探索了两类吖啶酯衍生物的合成方法，并具体介绍了三个化合物的合成。 关键词：辣根过氧化物酶，化学发光底物，吖啶酯，合成

Synthesis of several substratefor horseradish peroxidase

Abstract:Horseradish peroxidase extracted from the plants of horseradish roots, is a kind of peroxidase of heme as the Redox centers and widely used in the immunoassay, biomedical testing, fluorescence analysis.Chemiluminescent substrate is a common substrate for horseradish peroxidase, Acridine ester is a kind of efficient chemiluminescence, Therefore, this article is mainly designed to synthesize two series of acridinium ester, The first is no substituent groups onthe acridine ring, Including two compounds; The second acridinium ester that has substituents on the acridine ring.

Keywords: horseradish peroxidase, chemiluminescent substrate, acridinium ester, synthesis

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前言

辣根氧化物酶由辣根等植物的根部提取而来，是一种含糖量为18%，分子量为44000D的糖蛋白。辣根过氧化物酶分子的氧化还原中心为亚铁血红素，辣根过氧化物酶对芳香族等化合物具有良好的催化氧化性能。相比较于其他过氧化物酶来说，辣根过氧化物酶有其自身的优点，如原料易得,市场价格比较便宜,作用底物十分宽泛等,这使得辣根过氧化物酶成为过氧化物酶中应用十分广泛的一种酶。现在，辣根过氧化物酶已广泛应用于各个领域之中，在免疫分析、有机合成、食品分析等方面，辣根过氧化物酶都发挥了重要的作用。例如在有机合成之中，可作为催化剂使用,对苯胺、酚类等芳香族化合物都具有很高的催化效能；在酶免疫分析检测中,辣根过氧化物酶具有化学发光底物,因此而建立的化学发光免疫测定在临床中得到广泛应用【2】。

化学发光分析检测灵敏度高、本底低, 因此作为辣根过氧化物酶的底物的化学发光试剂的研究和制备是化学发光免疫检测的热点。其中吖啶酯衍生物是一种常见的化学发光试剂

【2】

，因此本论文研究的目的是对两种吖啶酯衍生物的合成

方法进行探索，合成三种不同的吖啶酯的衍生物，并在将来的工作中对各种吖啶酯的化合物的发光性能进行研究。

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第一章 辣根过氧化物酶的底物发展【3】

1.1 色原底物

最早发现的辣根过氧化物酶的底物是色原，色原底物经过酶的作用会产生一种新的颜色或其吸收光谱产生变化，这种检测方法所产生的颜色很容易用肉眼或光谱仪器观测到是它最大的优点，对比之下，检测仪器所需的价格较其他检测方法更加便宜，但检测灵敏度较其他检测方法来说较低是其不足之处。

不同取代的芳香族胺和酚可以用来表示色原底物的基本结构，在酶促氧化的过程之中，大多数不同取代的芳香胺、酚类或者它们的混合物会产生有颜色的缩聚物，易于观测。下面简单介绍几种常见的芳香族胺类色原底物:如四甲基联苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)、邻联甲苯胺(OT)等，这三种色原底物的结构如下图所示：

OHCOOHH2NTMB1.2 荧光底物

继色原底物之后，荧光底物的发现丰富了辣根过氧化物酶的的底物发展，荧光底物检测灵敏度比色原底物更高,更重要的是，荧光底物可以同时采用几种不同颜色的荧光材料，但与此同时，荧光底物也存在着其自身的缺点: 首先，荧光的激发和检测所需要的光源、过滤器和扫描仪等设备价格昂贵，相对色原底物来

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NH2H2NNH2NH2OT5-AS

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说，检测成本更高；其次，经由细胞或着其他分子产生的自发荧光同样会对实验的结果产生干扰；再次，在观测期间、样品存放期间、或者暴露于室内光线时，荧光会发生衰减, 导致实验难以获得恒定数据。

1.3 常见的化学发光底物

继荧光底物之后，化学发光底物的发现使得辣根过氧化物酶的底物发展进入一个快速发展的阶段，各种化学发光底物极大丰富了辣根过氧化物酶的应用。化学发光指的是物质分子在化学反应的过程当中吸收来自反应的能量，并以光的形式将能量释放出来的一种形式。化学发光的发光机理反应体系中某些物质吸收了来自反应所释放的化学能，然后物质分子从基态跃迁到激发态，当从激发态重新恢复到基态的状态时，反应体系所吸收的能量会以光的形式释放出来，从而产生发光现象。顾名思义，化学发光是指在化学反应的过程中所产生的化学能被吸收使分子激发而发射的光，荧光则是吸收了光能使分子激发而发射的光，这就是化学发光与荧光的区别所在，暨二者形成激发态分子的激发能的形式不同，一种为化学能，一种为光能。一般来说，化学发光底物具有高能化学键，酶的作用下，化学键会发生断裂，能量以可见光的形式释放。化学发光所需的检测仪器价格昂贵，发射光须随时采集，难以得到恒定值，但化学发光检测灵敏度高、背景低, 因而得到广泛应用【4】。下面简单介绍几种常见的化学发光底物，包括鲁米诺类、过氧草酸酯类，以及吖啶酯类，它们在实际的化学分析测定中是常用的几种化学发光试剂，在药物分析，环境监测等领域也有着重要的应用：

1.3.1鲁米诺化学发光体系

鲁米诺，化学名为3-氨基邻苯二甲酰肼，其结构简单易于合成、性质稳定、水溶性好、环境友好且无毒，是应用最多的化学发光试剂之一，并以研究最多、化学发光效率高而著称【5】。

鲁米诺作为一种常用的化学发光试剂可以用于多种物质的分析检测，如过氧化氢酶、辣根过氧化酶、铁盐、过渡金属离子等均可以作为氧化剂或催化剂增强

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鲁米诺的化学发光。上述物质通过影响鲁米诺的化学发光速率，而进一步影响鲁米诺的化学发光强度，因此，鲁米诺可以用于上述物质的检测【6】。

虽然鲁米诺可用于多种物质的分析检测，但至今为止，鲁米诺的化学发光机理仍未阐释清楚，主要原因在于捕获和分离反应中间体十分困难，所以，机理中仍然有一些细节难以明确。下面给出鲁米诺的一种可能的化学发光机理： 如图展示了一种可能的鲁米诺的发光机制【7】：

NH2ONHNH

OOHNNHOOHOOHNNONH2COOO

氧化剂NNO

HO过氧化物

N2 +hvCOO该机制经历四个阶段：

第一阶段：luminol→? LH -（luminol 在碱性环境作用下，生成 LH - 阴离子）；

第二阶段：LH - → L -（LH .）（LH - 阴离子在氧化剂的作用下，生成 LH。自由基或L- 阴离子）；

第三阶段：L -→ LHOOH（L- 自由基在过氧化物的作用下，生成 LHOOH）； 第四阶段：LHOOH →3-氨基邻苯二甲酸根负离子*+N2（LHOOH脱去 N2，生成 3-氨基邻苯二甲酸根负离子的激发态物质），最后，激发态物质回到基态的过程中，产生化学发光【8】。

鲁米诺可以用于多种类型的离子的测定，例如可以用于金属离子的含量测定，关于测定海水中铁离子含量的方法已经建立起来，并应用于海洋环境监测之中；与此同时，在过渡金属检测和碱土金属离子检测方面，鲁米诺化学发光体系也发挥了重要的作用；当然除了过渡金属离子和碱土金属离子之外，过渡金属配

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合物也影响金属的催化特性，因此鲁米诺也可以用于过渡金属配合物的检测。因此根据以上原理，可以通过鲁米诺化学发光体系建立各种离子的的检测方法。

另外，以鲁米诺为化学发光试剂的化学发光免疫分析方法现以广泛应用于环境监测，药物分析，食品分析等领域【9】。

1.3.2过氧草酸酯类

过氧草酸酯类是一种常见的化学发光试剂，最早被发现的过氧草酸酯类化学发光体为草酰氯，后来，科学家们发现草酸酯和草酰氯一样具有化学发光的性质，与草酰氯相比，草酸酯更为稳定，发光效率也更好。因此，更多的过氧草酸酯类物质被应用于化学发光检测。

与鲁米诺化学发光试剂相比较，过氧草酸酯类有其自身的优点。首先，过氧 草酸酯类化学发光试剂有较高的量子产率和灵敏度；其次，化学反应之中可能存在的金属离子或阳离子等，对过氧草酸酯类发光的影响很小，这使得检测体系的发光效率显著提高。与荧光底物相比，以过氧草酸酯为发光试剂的化学发光法的谱图更加简单，选择性更好，这大大提高了过氧草酸酯类化学发光试剂的应用范围。再次，在过氧草酸酯分子中，亚硝酸根作为离去基团，很容易脱去，因而使得反应的速度快，整个发光体系的发光强度更大。

到目前为止，尽管科学家们已经对化学发光进行了大量深入的研究，也有不少学者提出各种各样的反应机理，但由于草酸酯类化学发光反应活性中间体的寿命太短，难以捕捉和监测，导致现在对于草酸酯类化学发光的机理一直没有可靠地统一的解释，故在本文之中对此不做过多的介绍【10】。

1.3.3吖啶及其衍生物

吖啶类及其衍生物是一种用途广泛的高校化学发光试剂，也是本文所要介绍的重点内容【11】。吖啶酯、吖啶磺酰胺以及光泽精等是常见的吖啶类化学发光试剂，在本文中，光泽精和吖啶磺酰胺不做过多介绍，主要介绍吖啶酯及其衍生物

【12】

。

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吖啶酯的通式如下图所示：

NXR1OOR吖啶酯作为一类高效的化学发光试剂，具有很多的优点：首先，吖啶酯具有较高的量子产率，与鲁米诺相比，其化学发光效率是鲁米诺的五倍甚至更多；其次，吖啶酯的性质更加稳定，受反应体系中其它物质的影响也更小，储存方便。再次，吖啶酯的化学发光过程反应速度快，在过氧化氢或其他过氧化物的存在下存在的情况下即能引起发光【13】。

吖啶酯及其衍生物可实现抗原、抗体及DNA等生物大分子的化学发光分析，是一种性能优良的化学发光免疫分析标记试剂【14】。其主要作用原理是通过分子结构上所特有的取代基团与生物大分子上的氨基、羧基或磷酸基团直接或间接作用，从而标记这些生物大分子。

同鲁米诺化学发光体系和过氧草酸酯类化学发光试剂不同的是，吖啶酯类的化学发光机理已经得到了基本确认。科学家们认为，吖啶酯化学发光的关键在于吖啶酯在碱性条件下与过氧化氢相互作用形成过氧化合物的活泼中间体，然后再在电激发的条件下转化为稳定的终产物：吖啶酮，同时能量以光的形式释放出来。如下图所示即为吖啶酯的化学发光机理【15】：

OOCO电激发OOObaseH2O2HOOONCH3NCH3hvNCH3NCH3 7

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3nhp.html