枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化 - 图文

枯草芽孢杆菌发酵培养基优化

作 者 姓 名 专 业 指导教师姓名 专业技术职务

目 录

摘 要 .................................................. 1

ABSTRACT ............................................... 2

第一章 绪论 ............................................ 3

1.1枯草芽孢杆菌简介 ...................................... 3 1.2枯草芽孢杆菌的应用 .................................... 3 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 ................. 3 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用................ 3 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 ............ 4 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 ..................... 4 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 ....................... 4 1.2.6 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料 ..................................................... 5 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 ................. 5 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 ........................... 6 1.4研究的思路、目的及意义 ................................ 7

第二章 材料与方法 ...................................... 7

2.1实验材料 .............................................. 7 2.1.1 菌株鉴定 ......................................... 7 2.1.2 培养基 ........................................... 7

2.1.3 主要设备 ......................................... 8 2.2 培养基的优化 ......................................... 9 2.2.1 培养方法 ......................................... 9 2.2.2实验流程 ......................................... 9 2.2.3实验方法 ........................................ 10 2.2.4正交试验 ........................................ 11

第三章 结果和分析 ..................................... 11

3.1 鉴定结果如下 ......................................... 11 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 ................. 16 3.3 pH变化曲线（以G18为例） ............................ 19 3.4 实验总结 ............................................. 25

致 谢 ................................................. 27

摘 要

枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、 1.0% 、 1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。 [关键词] 枯草芽孢杆菌 培养基优化 正交试验

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ABSTRACT

Bacillus subtilis is the main feed probiotic strains, in this thesis, G18 and G21 to twoBacillus subtilis culture lag phase and doubling time for the evaluation and shaking culture flask, an the two factors and three levels orthogonaltest, the main components ofthe fermentationmedium, soybean meal processing protease plus the amount of 2u / gsoybean meal, 5u / g, soybean meal, 10u / g of soybean meal and corn syrup added0.5%, 1.0%, 1.5% do two factorsthe three-level orthogonal experiments, studies show that: G18, best medium: 0.5% glucose, starch 3%, soybean meal 3%, corn steep liquor1.0% yeast 0.5%, 0.2% disodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate 0.1%, manganese sulfate 0.01%, a common amylase 2u / g, starch, protease added 10u / g,soybean meal. G21 the best medium: glucose 0.5%, 3% starch, 3% soybean meal, corn steep liquor 1.5%, 0.5% of the Yeast, disodium hydrogen phosphate 0.2%, magnesium sulfate 0.1% and 0.01%, manganese sulfate, common a amylase 2u / g starch, proteaseadded 5u / g soybean meal.. [Keywords] Bacillus subtilis Medium optimization Orthogonal test

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第一章 绪论

1.1枯草芽孢杆菌简介

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等。

1.2枯草芽孢杆菌的应用

1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用

工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用

枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA) 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、

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灰霉病等病害。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平， 现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。

1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用

枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。如，研究发现猪采食含107CFU／g枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。1996年，枯草芽孢杆菌作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一已投入工厂化生产。

1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用

国家级一类新药白天鹅气雾剂以枯草芽孢杆菌作为有效成分，主要用于治疗和预防烧伤和各种外伤引起的各种细菌感染，其作用机理是通过枯草芽孢杆菌活菌在创面上定殖、增殖而发挥生物拮抗作用，达到抗感染、促进刨面愈合的作用。

1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用

在水产上运用的芽孢杆菌主要是枯草芽孢杆菌。在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的目的。芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，可降解饲料中的某些抗营养因子，饲料转化率提高8％以上，促进鱼类生长。芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用。芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质。

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1.2.6 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料

枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。目前国际上在遗传工程中使用的芽孢宿主菌几乎全部来自Spizien及其学生建立的枯草芽孢杆菌169菌株转化系统，它同另一种常用大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可以将转入目的基因表达出的产物分泌到细胞体外，这就降低了进一步收集、分离和纯化基因表达产物的成本和工作量。枯草芽孢杆菌能够在生长过程中产生有用代谢产物，且大部分直接分泌到培养基中，这在简化生产工艺的同时，也存在菌株自身分泌的降解性蛋白酶会影响表达产物的稳定性甚至会破坏表达产物的缺点。近年来有人构建的双蛋白酶和三蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB104和DB403菌株将有助于提高目的基因表达蛋白的稳定性。这些都为枯草芽孢杆菌的广泛应用奠定了基础。

1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用

尹文林等不同养殖水体用20亿／g枯草芽孢杆菌B115株0.5 mg／L后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第3~4天，平均降低(45.40±5.06)％；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.03±3.82)％；硫化物的最大降解值出现在使用后第3.4天，平均降低率为(23.01±7.27)％。与对照组相比有明显差异(P >0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。胡咏梅等以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的净水作用进行了研究。结果表明，该菌株能迅速降解有机物，在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降，48 h COD的去除率达67%以上，96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%，好氧条件下为28.6%，144h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%，96h降解硫化物达100%。此外，枯草芽孢杆菌在降解多环芳烃和乐果方面也有较好的应用前景。李丽等从长期受多环芳烃污染的土壤中分离出1株菲降解菌—菌Ⅱ，经生理生化及16SrDNA析鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。在单基质菲、芘反应体系中，该菌株具有较强的降解能力。菌不但可以在高浓度的多环芳烃存在下生长良好而且对高浓度多环芳烃有较高的降解能力。马丽娜等筛选出的一株枯草芽孢杆菌在乐果浓度为1000mg／L时，48h的降解率l8.1％。

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1.3 国内外的研究现状与发展趋势

国外对枯草芽孢杆菌的研究起步比较早，1945年Johnson等报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Papavizas G C报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。1992年Hwang等报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世纪90年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分别开发出活菌杀菌剂SerenadeTM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病[9][10]等细菌和真菌病害。GBO3(商品名为Kodiak)和MBI 600(商品名为Subtilex)分别由美国Gustafson公司和Microbio Ltd公司开发，根部施用或拌种可防治镰刀菌(Fusarium spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害。2001年Gustafson将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为BioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作为植物促长剂被Taensa公司商品化生产，商品名TaegroTM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病。俄罗斯全俄植保所开发了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂Alifine-B，可用于防治多种作物真菌(Fusarium，Rhizoctonia，Ascohyta，Colletotrichum，Sclerotinia，Botrytis，etc)病害，田间防效高达60％~95％，增产达25％~35％；另一枯草芽孢杆菌产品Gamair由活菌和代谢物组成，主要防治由Clavibacter michiganense subsp.Michiganense，Erwinia caratovota subsp.Caratovola和Pseudomonas corrugata引起的番茄细菌病害。韩国Bio公司将枯草芽孢杆菌与链霉菌抗生素、植物抗真菌多糖混合制成生物杀菌剂Mildewcide，叶面喷施可防治蔬菜和葡萄霜霉病、白粉病，也可防治花卉、水果和水稻真菌病害。

尽管当前化学杀菌剂在农药产业仍占主导地位。但枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，具有重要的理论意义和指导生产价值。现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为枯草芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。

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1.4研究的思路、目的及意义

为了提高枯草芽孢杆菌的产量，而又降低工业生产的成本，在前人研究的基础上， 我们以豆粕、玉米浆为主要原料的培养基作为枯草芽孢杆菌的发酵培养基，并对培养基中的蛋白酶添加量和玉米浆添加量作研究，研究它们对枯草芽孢杆菌生长的影响，然后做两因素三水平的正交实验，从而确定在工业生产中的最佳培养基。

第二章 材料与方法

2.1实验材料 2.1.1 菌株鉴定

鉴定所用菌株是否为枯草芽孢杆菌，是否具有强的产蛋白酶能力。

2.1.2 培养基

LB液体培养基：1.0 g 胰蛋白胨, 0. 5 g 酵母粉, 1.0 g NaCl, 溶于100 mL去离子水，121 ℃灭菌30min，4℃保存。

营养琼脂培养基：19.8g营养琼脂粉溶于600 mL去离子水，121 ℃灭菌30min。供试发酵培养基：

1号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。

2号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵

母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。

3号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵

母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g

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于10mL蒸馏水中，混匀，取12uL，100mL蒸馏水。

4号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵

母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。

5号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵 母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。

6号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵

母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取30uL，100mL蒸馏水。

7号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆0.5mL，0.5g破壁酵

母，0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。

8号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.0mL，0.5g破壁酵母，

0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。

9号培养基：0.5g葡萄糖，3.0g淀粉，3.0g豆粕，玉米浆1.5mL，0.5g破壁酵母，

0.2g磷酸氢二钠，0.1g硫酸镁，0.01g硫酸锰，将酶活为5361U/g的普通a-淀粉酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取112uL，将酶活为50000U/g的普通蛋白酶0.1g于10mL蒸馏水中，混匀，取60uL，100mL蒸馏水。

2.1.3 主要设备

仪器

722型可见分光光度计

型号 070411060039

生产厂家

上海精密科学仪器有限公司

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数显恒温水浴锅 电子天平 电子万用炉

立式压力蒸汽灭菌锅 pH计

隔水式恒温培养箱 恒温振荡培养箱 双人单面净化工作台 光学显微镜 冰箱展示柜

HH-4 JJ200型 DL-1

YXQ-LS-75SII PHS-3C GSP-9160MBE TZ-2DH SW-CJ-1C 型 XS—212 冰箱展示柜

金坛市科析仪器有限公司 常熟市双杰测试仪器厂 北京市永光明医疗仪器厂 上海博讯实业有限公司 上海精科

上海博讯实业有限公司

河北霸业长城医用设备厂

苏州净化设备有限公司 南京江南永新光学有限公司 澳柯玛

2.2 培养基的优化

2.2.1 培养方法

因为用的不同菌种但是实验操作都一样，在这里以G21为例。先用接种环接种1环试管菌种到LB液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到供试发酵培养基中，37℃培养一段时间。

2.2.2实验流程

取出供试菌种→扩增菌种→摇床培养→倒入供试培养基中→摇床培养→定时测pH，镜检 →画出pH曲线→找出延滞期、对数生长期→取对数期的两个时间平板计数

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→算出倍增时间

2.2.3实验方法

pH的检测：用5mL移液枪吸取4mL发酵0h后的发酵液于5mL离心管中，测其

pH，然后每隔两小时测一次，记录数据。

延滞期的判断: 画出枯草芽孢杆菌pH的变化曲线，在其达到最低点时大致可以判断结束延滞期。

对数期的检测：取一滴发酵到4h后的发酵液滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用结晶紫染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，观察画面中的杆数和对生数，判断是否进入对数期。在油镜下观察枯草芽孢杆菌的形状如下图。

图2.1油镜下的枯草芽孢杆菌

平板计数：用1mL移液枪吸取1mL到9mL无菌水中，摇匀得10培养24h，然后数培养皿上的菌落数。

?1，依次这样稀

释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌营养琼脂固体培养基中并涂匀，37℃

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倍增时间的计算：G =( T2 –T1 ) /3.322(㏒X2-㏒X1 )

T1、T2——对数期的任意两个时间 X1、X2—— 与T1、T2对应的活菌数

2.2.4正交试验

以蛋白酶添加量﹑玉米浆添加量作为考虑因素进行条件筛选，设计3个因素水平，以倍增时间作为第一指标，延滞期为第二指标，设计L9（3）正交实验，因素水平表见表2-1。

表2-1 因素水平表

Table1 The factor - level table

水平 level 1 2 3

2

因素

蛋白酶添加量(u/g

豆粕)

2 5 10

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5

通过正交实验，可以得到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的最佳条件。

第三章 结果和分析

3.1 鉴定结果如下

1. G18

GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTA

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CCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGACAGATGA HM486416.1 JF412545.1 Bacillus subtilis strain SFA6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus subtilis strain TUL322 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

2678 2678 2678 2678 100% 0.0 99% 100% 0.0 99%

CP002468.1 Bacillus subtilis BSn5, complete genome HM027569.1 GU250454.1 2.G21

Bacillus subtilis strain zj2008 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Bacillus subtilis strain BFE 5320 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

2678 2.687e+04 100% 0.0 99% 2678 2678 2678 2678 100% 0.0 99% 100% 0.0 99%

GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTNTGAACCGCATGGT

12

TCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCNACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGACAGATGA

Bacillus amyloliquefaciens 16S ribosomal AY620954.1 2676 2676 100% 0.0 99% RNA gene, partial sequence Bacillus subtilis isolate BS-2 16S

AY172513.1

ribosomal RNA gene, partial sequence

2673 2673 99% 0.0 99%

Bacillus sp. 3639ABRRJ 16S ribosomal RNA

JF309257.1 2671 2671 100% 0.0 99%

gene, partial sequence Bacillus sp. ITCr07 partial 16S rRNA gene,

FR823399.1 2671 2671 100% 0.0 99%

isolate ITCr07 HQ727971.1 Bacillus subtilis strain Aj080718IA-25 16S 2671 2671 100% 0.0 99%

13

ribosomal RNA gene, partial sequence

由上可知两菌株为枯草芽孢杆菌G18，G21。

G18和G21功能鉴定结果（与现生产菌株G18b比较）

1. 耐热性

芽孢耐热存活率G18B

G18

G21（纳豆芽孢杆

（%） 菌）

温度/时间 菌存活率（%） 75℃（20min） 96.43±0.89 83.21±1.06 85.58±0.97 80℃(10min) 69.34±1.73 79.79±1.38 70.79±1.38 100℃(5min)

42.03±0.73

52.06±2.60

30.13±0.02

2. 蛋白酶照片（培养48h后） G21(纳豆芽孢杆菌)

平行一 平行二 G21各平行光圈直径（mm） 光圈直28 27.5

28

28

27.5

27.5

26

27

径（mm） 平均值27.44 （mm）

G21-G18-G18B(1-2-3)

14

平行一 平行二

平行三 1.G21 2.G18 3.G18B 各平行光圈直径（mm） 名称 G21 G18 G18B 总结

平行一 27.5 30.5 29.5

平行二 26 30 26

平行三 26.5 30 28

平均值（mm） 26.67 30.17 27.83

光圈比较 G18>G18B>G21

通过以上照片及光圈直径比较可以看出，G21所产生的透明光圈在单独培养及与

15

G18,G18B混合培养中，其光圈直径基本一致，相差不大,可以确定其在混合培养中的直径在允许的范围之内；G18产蛋白酶的能力比其它两菌产酶能力强，G21与G18B的光圈直径基本差不多（测量也存在一定的误差），可见其产蛋白酶的能力相差不大。

3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果

通过设计的两因素三水平确定L9（32 ）正交实验，接枯草芽孢杆菌的液体种1mL，在37℃下培养8h和12h后分别检测它们的活菌数，结果如下表。

表3-1 G21的活菌计数

蛋白酶添加量（u/g豆粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10 蛋白酶添加量（u/g豆粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10

16

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5

项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9

发酵8h后的活菌数（105个/mL）

259 133 268 60 90 33 30 100 130

发酵8h后的活菌数（107个/mL）

75 27 2.6 20 11 70 52 16.2 12

发酵12h后的活菌数

（107个/mL）

30 3.1 55 34 74 60 44 73 85

发酵12h后的活菌数

（107个/mL）

136 55 14 98 80 156 175 75 40

表3-2 G18的活菌计数

算出倍增时间，结果如下

表3-3 枯草芽孢杆菌G21正交实验结果

项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K

1

蛋白酶添加量（u/g豆

粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5

倍增时间 1.312 3.212

0.918 0.687 0.629 0.533 0.556 0.646 0.663

1.814

K

0.852

2

0.616 1.496

K

3

0.622 1.198

0.705 0.791

R

从正交试验的检测结果极差分析可以看出，影响试验效果的主要因素排序为蛋白酶添加量>玉米浆添加量。工业生产枯草芽孢杆菌G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，

17

淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。

表3-4 枯草芽孢杆菌G18正交实验结果

项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K

1蛋白酶添加量（u/g豆

粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5

倍增时间 4.666 3.896

1.647 1.745 1.397 3.460 2.285 1.808 2.302

K

3.403 2.899

2 K

2.201 2.367

3 R

2.132 1.271

2.470 0.532

从正交试验的检测结果极差分析可以看出，影响试验效果的主要因素排序为蛋白

18

酶添加量>玉米浆添加量。工业生产枯草芽孢杆菌G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。

3.3 pH变化曲线（以G18为例）

6.36.26.165.95.85.75.65.55.45.30246时间（h）81012pH1号培养基的pH变化曲线

6.26.165.95.85.75.65.55.45.30246时间（h）81012pH2号培养基的pH变化曲线

19

5.855.85.755.75.655.65.555.55.455.45.350246时间（h）81012ph

3号培养基的pH变化曲线

6.36.26.165.95.85.75.65.55.40246时间（h）81012pH

4号培养基的pH变化曲线

20

765pH432100246时间（h）81012

5号培养基的pH变化曲线

6.36.26.165.95.85.75.65.55.45.30246时间（h）81012pH

6号培养基的pH变化曲线

21

6.56.46.36.26.165.95.85.75.60246时间（h）81012pH7号培养基的pH变化曲线

6.26.16pH5.95.85.75.65.50246时间（h）81012

8号培养基的pH变化曲线

22

5.95.855.85.755.75.655.65.555.55.450246时间（h）81012pH

9号培养基的pH变化曲线

表3-5 枯草芽孢杆菌G18正交实验结果

项目

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K

1蛋白酶添加量（u/g豆

粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10 7.467

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 6.933

延滞期（h） 7.5 7.3 7.6 7.1 4.5 4.0 6.2 6.1 7.3

K

2

5.200 5.967

K

3

6.533 6.300

23

R 2.267 0.966

从正交试验的检测结果极差分析可以看出，影响试验效果的主要因素排序为蛋白酶添加量>玉米浆添加量。影响枯草芽孢杆菌G18延滞期的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕 同分析G18一样画出pH的变化曲线，分析结果如下

表3-6 枯草芽孢杆菌G21正交实验结果

项目

1 2 3 4 5 6 7 8 9 K

1蛋白酶添加量（u/g豆

粕）

2 2 2 5 5 5 10 10 10 7.700

玉米浆添加量（%） 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 0.5 1.0 1.5 7.600

延滞期（h） 7.8 7.9 7.4 7.7 7.4 7.5 7.3 7.2 6.0

K

2 K

7.533 7.500

3

6.833 0.867

6.967 0.633

R

从正交试验的检测结果极差分析可以看出，影响试验效果的主要因素排序为蛋白酶添加量>玉米浆添加量。影响枯草芽孢杆菌G21延滞期的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。

24

3.4 实验总结

本课题以蛋白酶添加量和玉米浆添加量为变量，采用两因素三水平的正交实验，以倍增时间为主要指标，以延滞期为次要指标，对枯草芽孢杆菌G21、G18的发酵培养基进行研究。研究表明枯草芽孢杆菌G21的最佳发酵培养基为葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。G18的最佳发酵培养基为葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通 a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。枯草芽孢杆菌的应用非常广泛，在工业和农业上都有非常好的发展前景，对枯草芽孢杆菌培养基的研究也有很大的空间。由本研究可知通过调节加入蛋白酶的添加量和玉米浆添加量可以获得倍增时间最小的培养基，而且在实际中是可行的。

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致 谢

本研究是在我的导师张大伟老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。从论文的选题、实验的全过程以及论文的写作完成都凝聚着张大伟老师的心血，老师严谨的治学

27

态度，平易近人的诚恳为人和宽厚待人的处事风范令我受益终身。

在这一学期的学习工作中，张老师在生活上和思想上给予了我无微不至的关怀，并把我培养成了一个具有科研、教学工作素质和能力的人。在今后的学习、工作、生活中我将一如既往的悉听张老师的教导，做一个谦虚、诚实、踏实工作的人。在此谨向张大伟老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。

感谢在青岛根源研发中心的薛玉师姐对本研究的精心指导以及对实验仪器操作的指导，她从论文的设计到完成，甚至论文的撰写，每一步的开展都给予详细的指导，使得实验和论文完成的井然有序。师姐严密的思维，博学的知识，严谨的科学态度，诚恳的为人以及对师弟师妹的严格要求，让我受益终身!

同时感谢研发中心其他的师兄师姐们给予我的帮助与关怀。

本研究的完成受到老师、同学和朋友的关心和帮助。值此毕业之际，借此一隅，我真诚的向所有给予我支持帮助的师生致以深深的谢意!是您们支持和鼓励我走过人生中最重要的一段路!谢谢!

28

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3ltw.html