光暗条件下大蒜DNA甲基化差异的初步研究_何艳霞

植物生理学通讯　　第４３卷　第１期，２００７年２月85

光暗条件下大蒜ＤＮＡ甲基化差异的初步研究

何艳霞，王子成＊，曹红平，张成婉

河南大学农业生物技术研究所，河南开封４７５００１

提要：用甲基敏感扩增多态性（ＭＳＡＰ）技术分析光暗条件下生长的大蒜ＤＮＡ甲基化水平差异。结果表明，用　８对引物组合扩增出３４３条带，完全一致的带型２４０条，不一致的１０３条。在不一致的条带中，光照条件下相同的４７条带与黑暗条件下相同的带型有差异，与黑暗相比光照下出现的去甲基化带２８条，有５６条差异带在２个处理内个体间也有差异。总的趋势是光照引起大蒜ＤＮＡ去甲基化。

关键词：ＤＮＡ甲基化；甲基敏感扩增多态性；大蒜

Initial Study of DNA Methylation Difference of Garlic (Allium sativum L.)Growing in Light and Darkness

HE Yan-Xia, WANG Zi-Cheng*, CAO Hong-Ping, ZHANG Cheng-Wan

Institute of Agricultural Biotechnology, Henan University, Kaifeing, Henan 475001, China

Abstract: The variation patterns of DNA methylation in Garlic (Allium sativum L.) genome under the conditionof light and darkness was studied using MSAP technique to reveal the effect of light to the level of plant DNAmethylation. Total of 343 fragments were identified by eight primer combinations and of which 240 were sharedby all the samples in the two conditions. It was shown that 47 consistent fragments in light condition appeareddifferent comparing with those in darkness. Comparing with the darkness condition, the 28 fragments appearedto be demethylated in light condition, and 56 fragments appeared to be varied among individuals in the samecondition. The overall results showed that light could induce DNA demethylation in Garlic.Key words: DNA methylation; methylation sensitive amplified polymorphism; garlicＤＮＡ甲基化在高等生物的生命活动中具有维持基因组稳定及调节生长发育等功能（Ｃｈａｎ等２００５）。ＤＮＡ甲基化程度与一系列的生物过程相关，如基因组稳定、Ｘ染色体失活、基因的转录调节和转座子元件的活性、基因沉默、基因组印迹等（Ｂｉｒｄ和Ｗｏｌｆｆｅ　１９９９；Ｂｅｓｙｏｒ　２０００；Ｂｅｎｄｅｒ２００４；Ｇｅｈｒｉｎｇ等２００４；Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ　２００２）。作为一种表观遗传修饰，ＤＮＡ甲基化在不改变碱基序列的基础上改变基因组的遗传信息，是现代表观遗传学研究中的一个热点（仪治本等２００５）。

胞嘧啶甲基化参与植物基因表达调控，进而调节植物的生长发育（Ｆｉｎｎｅｇａｎ等２０００）。植物在不同发育时期，通过遗传或环境变化调控内源基因的表达所产生不同的发育反应，植物ＤＮＡ甲基化水平的变化在此种调节中起作用（Ｒｉｃｈａｒｄｓ１９９７；Ｋａｓｓ等１９９７），而温度和光照等环境因素都可以促使ＤＮＡ甲基化水平发生变化（Ｇｕｒｍｉｎｄ等２０００）。

甲基敏感扩增多态性（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＭＳＡＰ）技术是基于扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）技术，以对甲基化敏感的酶ＨａｐＩＩ和ＭｓｐＩ代替ＭｓｅＩ作高频内切酶，以ＥｃｏＲＩ为低频内切酶进行ＡＦＬＰ反应。这种方法适用于检测材料ＤＮＡ序列未发生变化情况下的ＤＮＡ甲基化水平变化。

本文以遗传基础一致、光和暗条件下培养的大蒜为材料，用ＭＳＡＰ技术分析大蒜胞嘧啶甲基化的变化情况，探讨光对植物ＤＮＡ甲基化水平的影响。

材料与方法

实验材料是郑州农科所赠送的大蒜（Ａｌｌｉｕｍｓａｔｉｖｕｍ　Ｌ．）品种‘双高一号’。取４个大蒜头，分

收稿

２００６－１１－２８

修定　　２００７－０１－１５

资助　河南大学基金。

　＊　　　通讯作者（Ｅ－ｍａｉｌ：　ｗｚｃ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｔｅｌ：　０３７８－２１９０６９９）。

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表１　　实验的引物序列

Ｔａｂｌｅ　１　　Ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ

　　　　　　　　引物Ｅ－Ａ＊

Ｈｐａ－ｍｓｐ＊Ｅ－ＡＡＣＥ－ＡＡＧＥ－ＡＣＡＥ－ＡＣＴＥ－ＡＣＣＥ－ＡＣＧＥ－ＡＧＣＥ－ＡＧＧ

Ｈｐａ－Ｍｓｐ－ＴＣＡＡ

　　　　　　　　　　　　　　　　　序列（５＇→3＇）ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴＣＡＡ

别编为１号、２号、３号和４号材料，即重复４次。从每个重复的材料中，分别取１０个大小基本一致的蒜瓣均分为２部分，取相同的玻璃杯（２００　ｍＬ），盛装等量的自来水，用滤纸制成滤纸桥，滤纸桥中间打一小孔，以便大蒜根生长。将滤纸桥放入水杯，并接触水面，实验材料置于滤纸桥上，使其生根部分与水面接触。材料都放在２３　℃恒温培养室中培养，一部分于光照下培养，光照强度为１１　µmｏｌ·m－２·s－１，每天光照１２　ｈ，另一部分于暗箱中遮光培养。

ＭＳＡＰ分析以ＡＦＬＰ实验为基础，实验流程参照Ｘｉｏｎｇ等（１９９９）和Ｃｅｒｖｅｒａ等（２００２）的方法。模板ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ和ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ进行酶切。ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切分步进行，２０　ｍＬ体系含２５０　ｎｇ　ＤＮＡ，ＥｃｏＲＩ　３　Ｕ，１０倍缓冲液（５００ｍｍｏｌ·L－１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ　７．５；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＭｇＣｌ２；１０　ｍｍｏｌ·L－１　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＮａＣｌ）和无菌水，于３７　℃下温浴２￣４　ｈ，加２倍体积无水乙醇后于－２０　℃下放２　ｈ，抽干加６　ｍＬ无菌水溶解，然后加入３　Ｕ　ＨｐａＩＩ，２　ｍＬ　１０倍缓冲液（１００ｍｍｏｌ·L－１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ　７．５；１００　ｍｍｏｌ·L－１　ＭｇＣｌ２；１０　ｍｍｏｌ·L－１　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ），用水补足到２０　ｍＬ，３７　℃下酶切３　ｈ；ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ酶切体系同前，只是加入ＥｃｏＲＩ和ＭｓｐＩ　这２种酶后同时反应，在３７℃下放３　ｈ。酶切产物分别都加上ＥｃｏＲＩ接头和ＨｐａＩＩ－ＭｓｐＩ接头，ＥｃｏＲＩ接头序列是５＇－ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ－３＇，３＇－ＣＴＧＡＣＧＣＡＴ－ＧＧＴＴＡＡ－５＇，ＨｐａＩＩ－ＭｓｐＩ接头序列是５＇－ＧＡＴＣ－ＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴ－３＇，３＇－ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＧＡ－ＧＣ－５＇，于２５　℃下连接２　ｈ；以稀释５倍的连接产物进行预扩增反应，预扩增产物稀释２０倍后再进行选择性扩增反应。所有的引物序列见表１，预扩增和选择性扩增程序参照邹喻苹等（２００１）书中的程序，扩增产物加入１／２体积的变性缓冲液（见分子克隆第三版），放入９４　℃水浴３　ｍｉｎ后立即转入０　℃中，进行６％的变性聚丙烯酰胺电泳，条件为５５　Ｗ，２．５　ｈ，最后银染显色。

＊为预扩增引物，其余的为选择性扩增引物。

黄），苗高而纤细；光照条件下正常生长的大蒜为绿色，蒜苗粗壮而矮一些（图略）。２　　ＤＮＡ甲基化水平变化

光暗条件下生长的大蒜ＤＮＡ分别进行ＭＳＡＰ分析，观察到３种带型：Ｉ型带是在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ和ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ这２种酶切组合中均出现的带；ＩＩ型带是在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切中出现但在ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ酶切中不出现的带；在ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ酶切中不出现但在ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ中出现的带为ＩＩＩ型带（图１）。用８对引物组合进行扩增，共得到３４３条清晰的条带，所有的带型统计见表２。在光照和黑暗２种条件下生长的样品，完全一致的条带有２４０条，其中最多的带型是Ｉ型带，有１６５条；而ＩＩ型和ＩＩＩ型带相对较少，ＩＩ型带有３４条，ＩＩＩ型带有４１条。样品间不一致的ＤＮＡ条带共有１０３条，其中光照与非光照处理样品之间有差异的条带有４７条。在这些差异带中，光照处理的样品与黑暗处理的相比较，去甲基化位点２８个（标＊的带）。有１９条带无法确定是去甲基化还是新产生的甲基化（标＊＊的带），这４７条差异带在所有黑暗或光照条件下的样品都是一致的（即要么是所有光下的样品有，要么是所有暗下的样品有），由于样品的其他生长条件完全相同，因此这些差异应该与光照与否有关。其中光照条件下特有的带有２５条，而黑暗条件下特有的带有５条。有５６条带在处理间的差异很大，且处理内部各样品间也有差异，这些可能是样品本身差异造成的。总之，光下生

实验结果

１　　光暗条件下大蒜的生长性状差异

黑暗条件下生长的大蒜苗出现黄化现象（蒜

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讨　　　　论

ＨｐａＩＩ和ＭｓｐＩ是一组同裂酶，二者均识别并切割５＇　ＣＣＧＧ　３＇序列，但是ＨｐａＩＩ不能切割任何１个或２个均甲基化的序列，即ＨｐａＩＩ对５＇ＣｍＣＧＧ３＇、５＇ｍＣＣＧＧ３＇和５＇ｍＣｍＣＧＧ３＇都不表现出活性，但若只是单链发生甲基化，则能识别切割。ＭｓｐＩ对内部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，但对外部胞嘧啶的甲基化敏感，也就是说ＭｓｐＩ可以切割５＇ＣｍＣＧＧ３＇但不能切割５＇ｍＣＣＧＧ３＇。如果在同一位点上，Ｉ型带变成ＩＩ型、ＩＩＩ型带或无任何带，则说明在原来的５＇ＣＣＧＧ３＇序列至少有１个胞嘧啶发生了甲基化，反之则是去甲基化。但用这种方法分析ＤＮＡ甲基化水平的变化存在一个不能克服的弊端，即不能区分非甲基化的５＇ＣＣＧＧ３＇序列与单链的胞嘧啶甲基化序列。

本文结果显示，光下生长的样品其电泳条带较多，这种结果似乎也说明光对ＤＮＡ去甲基化有效应。有人认为ＤＮＡ甲基化水平的变化是为了适应生存环境而变化的一种自我修饰（Ｃｅｒｖｅｒａ等２００２）。大蒜在是否受光照的条件下，ＤＮＡ甲基化发生１３．７％的变异，这种变异是否与某些基因表达相关？植物ＤＮＡ甲基化水平在植物的不同组织及不同生长时期都会有差异，这在番茄、玉米和水稻中已有过报道（陆光远等２００５），本文的材料来源单一，用于提取ＤＮＡ的叶片都处在同一生长期，这可减少实验误差。在我们的实验中有５６条差异带存在于样品个体间，推测可能是由于个体本身的营养差异造成的。

ＤＮＡ甲基化信息在植物的生长发育过程中起着关键的调控作用。表型观察表明，光下的样品生长较茁壮，暗下的蒜苗黄化且较细长，这种性状是否是甲基化信息变化的结果？抑或是性状改变导致甲基化信息遗传的改变？对此需进一步研究。至于光暗条件下特有的ＤＮＡ甲基化差异条带回收和序列测定及差异ＤＮＡ序列的功能分析，是我们下一步的工作。此外，植物对光信号的接受涉及到一系列信号转导过程，这些信号究竟如何调节ＤＮＡ的甲基化，也有待深入研究。

参考文献

陆光远，　伍晓明，　陈碧云，　高桂珍，　许鲲，　李响枝（２００５）．　油菜种子萌

图１　　模板ＤＮＡ的ＭＳＡＰ分析

Ｆｉｇ．１　　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ＭＳＡＰ　ａｎａｌｙｓｉｓ

１￣４是４个蒜头样品。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３和Ｈ４为黑暗下的，Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３和Ｇ４为光照的；Ｈ和Ｍ分别代表样品由ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ和ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ酶切后扩增的条带。

表２　　光照和黑暗条件下样品的ＭＳＡＰ分析带型统计Ｔａｂｌｅ　２　　Ａ　ｓｕｍｍａｒｙ　ｏｆ　ＭＳＡＰ　ｂａｎｄ　ｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ

ｇｒｏｗｉｎｇ　ｕｎｄｅｒ　ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｄａｒｋｎｅｓｓ

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　带型

　　　　类型

　光照　　　　黑暗２种条件处理均

有相同的条带２种处理间条带有差异，但处理内条带相同

ＩＩＩＩＩＩＩＩ－－－ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ

２种处理间和处理内均有差异的条带

Ｉ、ＩＩ和ＩＩＩ为３种ＭＳＡＰ带型。“－”表示无任何带型；

＊

条带数

Ｉ

ＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩＩ

１６５

３４　　４１　　　　６＊　　１３＊　　　　８＊＊　　　　４＊＊　　　　３＊＊　　　　２＊＊　　　　２＊＊　　　　９＊　　５６

为去甲基化的条带；＊＊为无法确定是去甲基化还是新产生的甲

基化的条带。

长的样品甲基化敏感酶的切割位点增多，即光对大蒜ＤＮＡ有脱甲基化作用。

88植物生理学通讯　　第４３卷　第１期，２００７年２月

Ｆｉｎｎｅｇａｎ　ＥＪ，　Ｐｅａｃｏｃｋ　ＷＪ，　Ｄｅｎｎｉｓ　ＥＳ　（２０００）．　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，

ａ　ｋｅｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｄｅｖ，　１０：　２１７￣２２３

Ｇｅｈｒｉｎｇ　Ｍ，　Ｃｈｏｉ　Ｙ，　Ｆｉｓｃｈｅｒ　ＲＬ　（２００４）．　Ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｅ

ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　１６　（Ｓｕｐｐｌ）：　Ｓ２０３￣Ｓ２１３

Ｇｕｒｍｉｎｄ　ＳＴ，　Ｊａｃｉｎｔｈａ　Ｍ，　Ｃｈｅｎｄａｎｄａ　ＣＣ，　Ｄａｖｉｄ　ＭＲ　（２０００）．　Ｅｆ－

ｆｅｃｔ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｏｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｍｅｔｈｙｌａ－ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｔｅｍ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｅｃｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｓｔｅｌｌａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ，　１０９：　３１３￣３２１

Ｋａｓｓ　ＳＵ，　Ｐｒｕｓｓ　Ｄ，　Ｗｏｌｆｆｅ　ＡＰ　（１９９７）．　Ｈｏｗ　ｄｏｅｓ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ

ｒｅｐｒｅｓｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ？　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ，　１３：　４４４￣４４９Ｒｉｃｈａｒｄｓ　ＥＪ　（１９９７）．　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．

Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ，　１３　（８）：　３１９￣３２２

Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ　Ｍ　（２００２）．　ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．　Ｐｌａｎｔ

Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　４３：　２０３￣２２０

Ｘｉｏｎｇ　ＬＺ，　Ｘｕ　ＣＧ，　Ｓａｇｈａｉ－Ｍａｒｏｏｆ　ＭＡ　（１９９９）．　Ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　ｃｙ－

ｔｏｓｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎ　ｅｌｉｔｅ　ｒｉｃｅ　ｈｙｂｒｉｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐａｒｅｎｔａｌｌｉｎｅｓ，　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，　２６１　（３）：　４３９￣４４６

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Ｂｅｓｔｏｒ　ＴＨ　（２０００）．　Ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｓ．

Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ，　９　（１６）：　２３９５￣２４０２Ｂｅｎｄｅｒ　Ｊ　（２００４）．　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ

Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ，　５５：　４１￣６８

Ｃｈａｎ　ＳＷ，　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ　ＩＲ，　Ｊａｃｏｂｓｅｎ　ＳＥ　（２００５）．　Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ

ｇｅｎｏｍｅ：　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｎａｔ　ＲｅｖＧｅｎｅｔ，　６　（５）：　３５１￣３６０

Ｃｅｒｖｅｒａ　ＭＴ，　Ｒｕｉｚ－Ｇａｒｃｉａ　Ｌ，　Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｚａｐａｔｅｒ　ＪＭ　（２００２）．　Ａｎａｌｙ－

ｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒｂｉａｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ　Ｇｅｎｏｍ，２６８：　５４３￣５５２

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3j71.html