选修1 生物技术实践

第一讲传统发酵技术的应用

知识点一 果酒和果醋的制作 1．制作原理 类型 果酒 微生物 酵母菌 原理 ①有氧条件下，进行有氧呼吸，大量繁殖 ?酶?②无氧条件下，进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6――→2C2H5OH＋2CO2 ①当氧气和糖源都很充足时，可将糖分解为醋酸 果醋 醋酸菌 ②当氧气充足，缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛转变为乙酸 2．制作流程

知识点二 腐乳的制作 1．菌种 主要是毛霉。

蛋白酶

?蛋白质――→小分子的肽和氨基酸?

2．原理? 脂肪酶

―→甘油和脂肪酸??脂肪―

2．影响条件

(1)卤汤配制：卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。加酒既能抑制微生物的生长，又能使腐乳具有独特的香味。香辛料不但能调制腐乳的风味，还具有防腐杀菌作用。

(2)材料用量：

①控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。

②酒的含量一般控制在12%左右。 知识点三 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 1．泡菜制作

(1)制作原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。 (2)制作流程：

2．亚硝酸盐含量的测定

(1)亚硝酸盐＋对氨基苯磺酸―→反应物；

反应物＋N－1－萘基乙二胺盐酸盐―――――→玫瑰红色染料。

(2)亚硝酸盐溶液的浓度越高，颜色越深；溶液浓度越低，颜色越浅。

(3)用显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行对比，并估算泡菜中亚硝酸盐的含量。

一、理解运用能力 判断下列叙述的正误

(1)在果酒自然发酵中，需人工添加酵母菌种(×)

(2)红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的(√) (3)变酸的酒的表面的菌膜是酵母菌大量繁殖形成的(×)

(4)在葡萄酒制作中，采摘的葡萄应反复冲洗，且要先除枝梗再冲洗(×) (5)制作腐乳的菌种只有毛霉(×)

(6)在腐乳制作过程中加入香辛料既能调节风味，还具有防腐杀菌作用(√) (7)在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右(√) (8)泡菜制作的菌种主要是醋酸菌(×) (9)泡菜制作的前期通氧，后期应严格厌氧(×) (10)配制盐水时，盐与水的质量比为4∶1(×)

(11)在果酒发酵后期，打开瓶盖的间隔时间可延长(2012江苏卷T21A)(√) (12)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，向发酵装置通入空气(2010北京卷T2C)(×) (13)果醋发酵包括无氧发酵和有氧发酵(2011江苏卷T3B)(×)

HCl?或盐酸?

(14)将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量(2012江苏卷T21D)(×) 二、读图析图能力

据腐乳制作的实验流程回答下列问题： (1)腐乳制作的原理是什么？

答案：毛霉等微生物产生的蛋白酶、脂肪酶等将蛋白质、脂肪等水解为小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。

(2)豆腐中生长的毛霉来源于哪里？ 答案：空气中的毛霉孢子。 (3)加盐腌制的目的是什么？

答案：①析出豆腐中的水分，②抑制微生物的生长。

[理清脉络]

考点一|对比分析，考查果酒和果醋的制作

1．菌种的比较

酵母菌 醋酸菌

2．制作步骤的比较 相同 过程 制果酒 制果醋 生物类群 真核生物 原核生物 代谢类型 异养兼 性厌氧 异养需氧型 发酵条件 前期需氧后期厌氧 一直需氧 温度 20℃左右 30～35℃ ①选材和材料处理：选择新鲜的葡萄，先用清水冲洗葡萄1～2遍除去污物后，再去枝梗 ②制作发酵液，防止杂菌污染 ③发酵：将葡萄汁注入发酵瓶，注意液体量不要超过发酵瓶总体积的2/3 ④将温度严格控制在18～25℃，时间控制在10～12 d左右。发酵旺盛期的CO2产量不同 过程 非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂 ⑤检测指标：7～10 d以后，可以开始进行取样检验工作。例如，可以嗅味和品尝、用重铬酸钾检验酒精含量，进行酵母菌的镜检、测定pH等工作 ④将温度严格控制在30～35℃，并注意适时通过充气口充气 ⑤检测指标：果醋的制作是否成功可以通过观察菌膜的形成、嗅味和品尝初步鉴定，再通过检测和比较醋酸发酵前后的pH进一步鉴定。还可以在显微镜下观察发酵液中是否有醋酸菌，并统计其数量作进一步鉴定 [典例1] 下列有关酵母菌和醋酸菌的叙述，不正确的是( ) ．A．两者的正常繁殖都离不开氧气

B．在无氧条件下，利用酵母菌可以生产酒精，而醋酸菌则不能用于生产醋酸 C．两者都是异养生物，它们的生存都离不开葡萄糖 D．醋酸菌可以以酵母菌的某种代谢产物为原料来合成醋酸

[解析] 醋酸菌是好氧型生物，在氧气充足的环境中才能完成其正常的生命活动(包括繁殖和代谢产生醋酸)；酵母菌属于兼性厌氧型生物，在有氧和无氧环境中都能生存，但其无氧呼吸产生的能量少，不足以满足其自身繁殖对能量的需求，所以两者的正常繁殖都离不开氧气，A、B正确。醋酸菌在缺乏糖源时，能把乙醇氧化成乙醛，再将乙醛氧化成乙酸；而酵母菌在无氧环境中能产生酒精，C错误，D正确。

[答案] C

果酒和果醋制作过程易错易混辨析

1．材料的选择与处理

选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄冲洗，并除去枝梗，以防葡萄汁流失及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，且不要太干净，以防洗去野生型酵母菌。

2．防止发酵液被污染 (1)榨汁机要清洗干净并晾干。

(2)发酵瓶要洗净并用体积分数为70%的酒精消毒，或用洗洁精洗涤。 (3)装入葡萄汁后要封闭充气口。 3．控制好发酵的条件

(1)葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。

(2)严格控制温度：18～25℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35℃利于醋酸菌的繁殖和醋酸发酵。

(3)充气：酒精发酵为无氧发酵，需封闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需适时通过充气口充气。

4．制作果酒和果醋的装置图分析

(1)各部位的作用：

①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。

②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2；与排气管相连的长而弯曲的胶管，可有效阻止空气中微生物的进入，避免来自空气的污染。

③出料口：用来取样。

(2)该装置的使用方法：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口，制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气。

[针对练习]

高考命题常从以下角度设置陷阱

(1)综合考查果酒、果醋制作的原理和操作步骤。

(2)结合原核生物与真核生物的区别，考查酵母菌和醋酸菌的有关知识。

1．(2014·南京四校联考)下列关于果酒和果醋的制作原理、发酵过程的叙述中，错误的是

( )

A．果酒和果醋的发酵菌种不同，但代谢类型相同

B．制作果酒和果醋时都应用体积分数为70%的酒精对发酵瓶消毒 C．在变酸果酒表面所观察到的菌膜可能是醋酸菌的菌落 D．果酒和果醋的制作可用同一装置，但需控制不同发酵条件

解析：选A 用于果酒发酵的菌种是酵母菌，其代谢类型是异养兼性厌氧型；用于果醋发酵的菌种是醋酸菌，其代谢类型是异养需氧型，两者的代谢类型不同。

考点二以流程图为载体，考查腐乳和泡菜的制作

1．腐乳的制作流程

让豆腐上

长出毛霉直接接种或利用空气中的毛霉孢子

?

?a.析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，以免过早酥烂?②目的?????b.抑制微生物生长，避免豆腐块腐败变质

①方法：逐层加盐，随层数加高而增加盐量，近瓶口表面铺厚些

?加卤汤?酒：抑制微生物生长，并使腐乳具有独特香味

?卤汤 装瓶?香辛料：调味、防腐杀菌?

密封腌制用酒精灯对瓶口灭菌后密封 2．泡菜的制作流程

[典例2] (2014·北大附中模考)下面为腐乳制作过程的流程图，下列说法不正确的是 ．

( )

豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制

A．毛霉为好氧型真菌，为避免其无氧呼吸，码放豆腐时要留出一定缝隙 B．加盐腌制的目的是析出豆腐中的水分使之变硬，同时能抑制微生物的生长 C．加卤汤、密封腌制中，毛霉不断增殖，并产生大量的酶，分解蛋白质 D．密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，以防止瓶口污染

[解析] 从图示可以看出，毛霉在加盐腌制前就已长成，加卤汤、密封腌制中，毛霉不再增殖，C项错误。

[答案] C

1．腐乳制作的注意事项分析 (1)豆腐选取：其含水量为70%为宜。

(2)控制好材料的用量：对卤汤中盐(盐∶豆腐＝1∶5)和酒(12%左右)的用量需要严格控制。

(3)防止杂菌的污染：

①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。

②装瓶腌制时，操作要迅速小心，且要逐层加盐，离瓶口表面的盐要铺厚一些。 ③加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。

(4)温度：温度影响菌丝的生长和代谢，如温度过低，则菌丝生长缓慢，不能进入豆腐块的深层；温度高，菌丝易老化和死亡，影响腐乳的品质。

(5)发酵时间：发酵时间影响生化反应速度及生化产物的量。 2．泡菜制作的注意事项分析 (1)材料的选择及用量：

①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。

②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。

(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。 (3)氧气需求：

①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。 ②泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。

(4)温度：发酵过程温度控制在室温即可，最好控制在26～36℃。温度过高则易滋生杂菌，温度过低则发酵时间延长。

[针对练习]

高考命题常从以下角度设置陷阱 (1)结合流程图，考查腐乳和泡菜制作过程。 (2)结合实验操作，考查亚硝酸盐含量的测定。

2．泡菜是指我国农村地区所盛行的一种利用乳酸菌发酵产生的美食。下列相关叙述正确的是( )

A．整个发酵过程中亚硝酸盐的含量变化趋势为先增加后减少

B．发酵时乳酸菌包括乳酸杆菌和乳酸链球菌，因此俗称乳酸菌是一个种群 C．亚硝酸盐是一种强致癌物，在酸性条件下转化为亚硝胺后致癌能力下降

D．在发酵过程中泡菜坛边沿水槽中注满水后就不要再动

解析：选A 发酵初期乳酸菌和乳酸的量少，硝酸盐还原菌使亚硝酸盐的含量增加，中期乳酸的量增多，硝酸盐还原菌的活动受到抑制，同时形成的亚硝酸盐被分解，含量下降；乳酸菌是一类生物，而不是一个种群；亚硝酸盐在特定条件下转化为亚硝胺，有致癌作用；在发酵用的泡菜坛边沿水槽中注满水，且要注意经常补充水，以保证坛内的无氧环境。

[课堂对点练]

题组一 果酒和果醋的制作

1．(2013·江苏高考)某研究性学习小组以樱桃番茄为材料进行果酒、果醋发酵实验。下列相关叙述正确的是( )

A．酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度较高 B．先供氧进行果醋发酵，然后隔绝空气进行果酒发酵 C．与人工接种的发酵相比，自然发酵获得的产品品质更好 D．适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖

解析：选D 果醋发酵的最适温度高于果酒；应先进行果酒发酵，再进行果醋发酵；人工接种的菌种品质更好，且不易有杂菌污染，故其比自然发酵的产品品质更好；适当增加接种量可缩短达到一定数量菌种所需的时间，并且在与其他杂菌的竞争中占优势，故能够提高发酵速率、抑制杂菌的生长繁殖。

2．(2012·江苏高考)下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，合理的是(多选)( ) A．在果酒发酵后期拧开瓶盖的间隔时间可延长 B．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸 C．果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小

D．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量

解析：选ABC 在果酒发酵的后期，酵母菌无氧呼吸产生的CO2量较前期有氧呼吸产生的CO2量少；当O2、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；果酒发酵过程中葡萄糖逐渐被分解并释放CO2，发酵液密度会逐渐减小；腐乳制作过程中应随层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面要铺厚一些。

3．(2011·江苏高考)下列与果酒、果醋和腐乳制作相关的叙述，正确的是( ) A．腐乳制作所需要的适宜温度最高 B．果醋发酵包括无氧发酵和有氧发酵 C．使用的菌种分别是酵母菌、醋酸菌、乳酸菌 D．使用的菌种都具有细胞壁、核糖体、DNA和RNA

解析：选D 果酒制作用的是酵母菌，酵母菌发酵时，最适温度在18～25℃；制果醋时

用到的醋酸菌是一种好氧菌，最适生长温度为30～35℃；制腐乳时主要用的菌种是毛霉，其最适温度在15～18℃；酵母菌、醋酸菌和毛霉都具有细胞壁、核糖体、DNA和RNA。

4．(2010·广东高考)小李尝试制作果酒，他将葡萄汁放入已灭菌的发酵装置中进行实验(如图)，恰当的做法是( )

A．加入适量的酵母菌 B．一直打开阀b通气

C．一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒钟 D．把发酵装置放到4℃冰箱中进行实验

解析：选AC 果酒发酵利用的是酵母菌的无氧呼吸，向葡萄汁中加入适量的酵母菌作为菌种，但不能通入空气，故阀a要一直关紧。因酵母菌细胞呼吸中能产生二氧化碳，故阀b每隔一定时间要打开几秒钟，以便释放二氧化碳。酵母菌酒精发酵的适宜温度是18～25℃，故不能把发酵装臵放到4℃冰箱中进行实验。

题组二 腐乳和泡菜的制作

5．(2012·海南高考)回答下列关于腐乳制作的问题：

(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为________和________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。

(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________生长。

(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。

解析：(1)腐乳制作发酵过程中起作用的微生物有多种，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，毛霉产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，产生的脂肪酶能够将豆腐中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。

(2)发酵过程中加盐腌制，不仅可以调制风味，而且能够抑制杂菌等其他微生物的生长。 (3)腐乳制作后期加入卤汤，卤汤不仅可以防腐，还可以使腐乳具有独特的风味(或香味)。 答案：(1)毛霉 (小分子的)肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸 (2)(其他)微生物 (3)风味

6．(2013·新课标卷Ⅰ)回答下列有关泡菜制作的问题：

(1)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是____________________________________。 为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作

用是________________________________________________________________________。

(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行______的过程。该过程发生在乳酸菌细胞的______中。

(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有______、________和________等。 (4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是______________________________________________________，

原因是_______________________________________________________________。 解析：(1)细菌分布广泛，制作泡菜时，需要利用乳酸菌进行发酵，为防止杂菌污染，所用盐水需要煮沸；加入陈泡菜液，可以增加乳酸菌数量，加速乳酸产生。(2)乳酸菌为原核生物，可进行无氧呼吸将葡萄糖分解为乳酸，其无氧呼吸的过程发生在乳酸菌的细胞质中。(3)在泡菜制作过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量等。(4)由于乳酸菌比杂菌更为耐酸，所以在酸性环境中，乳酸菌能够正常地增殖，而其他杂菌繁殖将受到抑制，所以在此过程中，乳酸菌数量增多，杂菌数量减少。

答案：(1)杀灭杂菌 增加乳酸菌数量 (2)无氧呼吸 细胞质 (3)温度 腌制时间 食盐用量 (4)乳酸菌数量增多，杂菌数量减少 乳酸菌比杂菌更为耐酸

[课下提能练]

一、选择题

1．下列关于传统发酵技术的说法中，错误的是( )

A．果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌属于兼性厌氧微生物，在有氧条件下能大量繁殖 B．制作果醋需要醋酸菌，它是一种严格厌氧的微生物，可将葡萄汁中的糖分解为醋酸 C．多种微生物参与了腐乳的发酵，如青霉、毛霉、曲霉等，它们都是真核生物 D．乳酸菌是一种厌氧微生物，可以参与泡菜和酸奶的制作

解析：选B 制作果酒利用的是酵母菌进行无氧呼吸产生酒精的原理，在发酵初期通入无菌空气可以使酵母菌进行有氧呼吸并大量繁殖；醋酸菌是好氧微生物，在果醋发酵过程中必须持续通入无菌空气；参与腐乳发酵的青霉、毛霉、曲霉等都属于真核生物；泡菜、酸奶制作过程中使用的乳酸菌 是一种厌氧细菌。

2．(2014·成都七中月考)下列对葡萄酒和葡萄醋发酵条件控制的相关叙述，错误的是

( )

A．葡萄汁装入发酵瓶时，要留有约1/3的空间 B．用清水冲洗葡萄除去污物时，应反复多次冲洗 C．制葡萄酒的过程中，需将时间控制在10～12 d左右

D．制葡萄醋的温度要比制葡萄酒的温度高些，但时间一般控制在7～8 d左右 解析：选B 葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间，既有利于酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，又可防止果酒发酵时产生的大量二氧化碳造成果汁溢出；制作葡萄酒所用的

菌种来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌，所以，对选择的葡萄应冲洗1～2次，清除污物即可；酵母菌的最适发酵温度为18～25℃，发酵10～12 d左右即可完成；醋酸菌的最适生长温度为30～35℃，时间一般控制在7～8 d左右。

3．下列评价果酒和果醋制作是否成功的方法中，不合理的是( ) A．通过观察相关微生物的存在或数量变化进行鉴定 B．通过向果酒发酵液中加入重铬酸钾试剂进行鉴定 C．通过检测果醋发酵前后发酵液的pH变化进行鉴定 D．通过检测果酒发酵前后发酵液的温度变化进行鉴定

解析：选D 果酒和果醋制作是否成功的评价方法有多种，可以通过观察相关微生物的存在或数量变化进行鉴定，也可以通过向果酒发酵液中加入重铬酸钾试剂进行鉴定，还可以通过检测果醋发酵前后发酵液的pH变化进行鉴定，但是通过检测果酒发酵前后发酵液的温度变化无法鉴定果酒制作是否成功。

4．(2014·马鞍山模考)下列有关腐乳制作过程相关的操作，叙述错误的是( ) A．为了有利于毛霉的生长，豆腐块应整齐排放，豆腐块之间应保持适当的距离 B．豆腐块装瓶时，为了避免影响口味，逐层加盐量应大致相等 C．装瓶时，将瓶口通过酒精灯火焰，迅速用胶条密封保存 D．加入胡椒、花椒、八角、桂皮、姜、辣椒等香辛料，调节口味

解析：选B 腐乳制作过程中，豆腐块装瓶时，要分层摆放并逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量。

5．某人利用乳酸菌制作泡菜，因操作不当使泡菜腐烂。下列原因分析合理的是( ) ①罐口完全密闭，缺氧抑制了乳酸菌的生长繁殖 ②罐口封闭不严，氧气抑制了乳酸菌的生长繁殖 ③罐口封闭不严，氧气抑制了其他腐生菌的生长繁殖 ④罐口封闭不严，促进了需氧腐生菌的生长繁殖

A．①③ C．②③

B．②④ D．①④

解析：选B 乳酸菌是厌氧型细菌，罐口封闭不严，导致乳酸菌的生长繁殖受到抑制，同时促进了其他需氧腐生菌的生长繁殖，使泡菜腐烂。

6．下图为泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化的曲线，正确的是( )

解析：选C 泡菜的制作过程中亚硝酸盐的含量先增加后减少。

7．人们利用某些微生物制作食品时，需要分析微生物的特点，控制微生物的发酵条件。下列与此有关的各项内容都正确的是( )

食品 主要 微生物 制作装置或操作步骤 A 果酒 酵母菌 B 果醋 醋酸菌 C 腐乳 毛霉 D 泡菜 醋酸菌 解析：选B 制果酒时是利用酵母菌的无氧呼吸来生产酒精的，A中瓶内发酵液淹没了排气管的管口，在排气时液体容易溢出。制腐乳时应该先接种毛霉，让其生长，再加盐。制泡菜时用乳酸菌，而不是用醋酸菌。

8．(2014·清华附中模考)下图装置可用于生物技术实践的相关实验，有关叙述不正确的是．

( )

A．两种装置都可先用于果酒的制作，后用于果醋的制作 B．利用装置甲制作腐乳时，应随着豆腐块层数的加高而增加盐量 C．用装置乙制作果酒时温度应控制在30℃左右，制作果醋时应适当降温 D．装置乙的排气口通过一个长而弯曲的胶管，可防止空气中微生物的污染

解析：选C 两种装臵都可先用于果酒的制作，后用于果醋的制作；利用装臵甲制作腐乳时，应随着豆腐块层数的加高而增加盐量；用装臵乙制作果酒时温度应控制在18～25℃，制作果醋时温度应控制在30～35℃；装臵乙的排气口通过一个长而弯曲的胶管，可防止空气中微生物的污染。

二、非选择题

9．鸭梨醋饮属绿色健康饮品，既保存了鸭梨中的多种氨基酸、维生素、矿物质、有机酸等营养成分，又兼具果醋醒酒护肝、助消化、降低血脂、软化血管等的养生保健功能，深受广大消费者的青睐。下图为鸭梨醋饮的制作流程图，请据图回答问题：

―→果酒――→果醋―→鸭梨醋饮 新鲜的鸭梨汁―

(1)果酒的酿造原理是先使酵母菌进行________，以增加酵母菌的数量，然后再通过________获得果酒。

(2)在果酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在________上的野生型酵母菌。 (3)酒精发酵时一般将温度控制在18～25℃，温度过高时，酵母菌代谢减慢甚至死亡，原因是________________________________________________________________________。

①

②

(4)果醋发酵过程中，适宜的温度为________，较高的酒精度通常不适宜进行醋酸发酵，原因是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。 (5)酒精发酵后转入醋酸发酵前，除改变温度外，还需调整的发酵条件是_________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌在氧气充足时进行有氧呼吸，在无氧条件下，进行无氧呼吸产生酒精，在发酵过程中首先让酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，然后再让其无氧呼吸产生酒精。(2)在果酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在水果皮上的野生型酵母菌。(3)温度主要影响酶的活性。(4)醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。酒精浓度过高会抑制醋酸菌的生长和代谢，影响产酸量。(5)醋酸菌是需氧型细菌，发酵时需要通入无菌空气。

答案：(1)有氧呼吸 无氧呼吸 (2)鸭梨皮 (3)温度过高，影响酶的活性 (4)30～35℃ 较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸量下降 (5)通入无菌空气

10．腐乳是我国古代劳动人民创造的一种经过微生物发酵的大豆食品。腐乳味道鲜美，易于消化吸收，所以一直受到人们的喜爱。请结合腐乳制作的原理及流程示意图回答下列问题：

(1)图中a、b分别表示的是________，它们的来源是____________，作用是______________ ________________________________________________________________________。 (2)过程一中，为保证产品的质量，应采取的措施是_____________________________ ________________________________________________________________________。 (3)过程二具体的操作应该是_________________________________________________ ________________________________________________________________________。 这样既不使豆腐快过早酥烂，又能避免豆腐块腐败变质。

(4)过程三中卤汤配制所需要的材料有____________________________________。 (5)过程四应如何操作才能取得最佳效果？______________________________________ ________________________________________________________________________。 解析：(1)腐乳制作过程主要利用的微生物是毛霉，在毛霉等多种微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶的作用下，蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪被分解成甘油和脂肪酸。(2)在接种过程中为保证产品的质量，应在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种接种在豆腐上。(3)在加盐腌制的过程中要将豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，并逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些，以防杂菌从瓶口进入。(4)卤汤主要由盐水、酒和香辛料配制而成。加酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味，香辛料可以调

制腐乳的风味，也具有防腐和杀菌的作用。(5)密封时，为防止杂菌污染，应将瓶口通过酒精灯的火焰，再用胶条密封瓶口。

答案：(1)蛋白酶、脂肪酶 毛霉等微生物 将蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸，将脂肪水解为甘油和脂肪酸 (2)在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种接种在豆腐上 (3)将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，并逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些 (4)盐水、12%左右的酒和香辛料(如胡椒、花椒、八角、桂皮、姜、辣椒等) (5)密封时，将瓶口通过酒精灯的火焰，再用胶条密封瓶口

11．“每天喝一点，健康多一点”，这是“宁夏红”率先提出的消费理念，将积淀了千百年的枸杞药食文化和中国红文化完美结合起来，更增添了品牌的文化魅力和优势。

下图为“宁夏红”枸杞果酒生产工艺流程简图，据图回答问题： 选料→“？”→粉碎→灭菌→接种→发酵→？→果酒 (1)流程中？处的内容依次应为________、________。

(2)制作果酒时，温度应该控制在________，果酒酿造过程中如果果汁灭菌不合格，含有醋酸杆菌，在酒精发酵旺盛时，醋酸杆菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸？说明理由。________，________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。 (3)果酒制作离不开酵母菌，与醋酸杆菌相比，酵母菌在结构上的主要特点是________________________________________________________________________。

(4)枸杞果酒制作过程中，接种完成后要先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，目的是________________________________________________________________________。

(5)果酒制作是否成功，需发酵后用______________来鉴定，在__________条件下，该物质与酒精反应呈现________色。

解析：(1)果酒生产的工艺流程为：选料→冲洗→粉碎→灭菌→接种→发酵→过滤→果酒。 (2)醋酸杆菌的最适生长温度为30～35℃。如果果汁灭菌不合格，含有醋酸杆菌，由于果酒发酵旺盛时是无氧环境，且温度为18～25℃，不适合醋酸杆菌生存，故醋酸杆菌不能将果汁中的糖发酵为醋酸。

(3)醋酸杆菌是原核生物，无细胞核，酵母菌是真核生物，有细胞核及多种细胞器。 (4)枸杞果酒制作过程中，接种完成后要先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，在有氧条件下，使酵母菌迅速繁殖，增加数量，有利于后期发酵。

(5)酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。 答案：(1)冲洗 过滤

(2)18～25℃ 不能 因醋酸杆菌是好氧型细菌，而果酒发酵是无氧环境(或因醋酸杆菌需要在有氧且温度是30～35℃条件下，才能将糖转化为醋酸，而此时发酵罐中的条件是无氧且温度是18～25℃)

(3)有成形的细胞核

(4)在有氧条件下，使酵母菌迅速繁殖，增加数量 (5)重铬酸钾溶液 酸性 灰绿

12．下面是泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，请据图回答下面的问题：

(1)制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜，原因是______________________________________。 (2)为了保证既无杂菌污染，又能使发酵菌发挥正常作用，应如何处理所用盐水？ ____________________________________________________________________。 (3)在泡菜腌制过程中，坛口边缘的水槽中保持水分充足的目的是__________________。 (4)测定亚硝酸盐含量的方法是________，在泡菜腌制过程中定期测定亚硝酸盐含量的目的是________________________________________________________________________。

(5)同样的材料和腌制条件，不同坛中各时期测得的亚硝酸盐含量不同，最可能的原因是________________________________________________________________________。

(6)在果醋的制作过程中酒精浓度较高时，通常不适宜进行醋酸发酵，原因是________________________________________________________________________。

(7)在制作腐乳、果醋、泡菜的过程中，需要氧气的是________的制作。其中在腐乳制作过程中，要加盐腌制，其目的是__________________________________________________。

要制作出色香味俱佳的腐乳，关键在于________的配制。

解析：(1)新鲜的蔬菜中亚硝酸盐的含量低，所以制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜。(2)盐水煮沸可以杀灭杂菌，然后冷却至室温时再使用可以防止发酵菌被杀灭。(3)在泡菜腌制过程中，经常向坛口边缘的水槽中补充水分可以防止外界氧气进入坛内。(4)测定亚硝酸盐含量的方法是比色法。(5)同样的材料和腌制条件，不同坛中各时期测得的亚硝酸盐含量不同，最可能的原因是各坛中微生物的种类和数量不同。(6)在果醋的制作过程中酒精浓度较高时，较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸量下降。(7)制作腐乳需要的微生物主要是毛霉，毛霉为需氧型微生物，制作果醋需要的醋酸菌为需氧型微生物，制作泡菜需要的乳酸菌为厌氧型微生物；腐乳制作时，要加盐腌制，加盐时，放入一层豆腐，加一次盐，随着层数的加高而增加盐量，这是为了防止豆腐受到微生物的污染，另外加盐腌制还能析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；要制作出色香味俱佳的腐乳，关键在于卤汤的配制。

答案：(1)新鲜蔬菜中亚硝酸盐的含量低 (2)先将盐水煮沸以杀灭杂菌，然后将盐水冷却至室温时再使用 (3)提供发酵过程中所需的无氧环境 (4)比色法 把握取食的最佳时间 (5)各坛中微生物的种类和数量不同 (6)较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸

量下降 (7)腐乳、果醋 析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，同时抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质 卤汤

第二讲

微生物的培养与利用

知识点一 微生物的实验室培养 1．培养基的成分和分类

(1)

??固体培养基：含凝固剂

(2)分类?

??液体培养基：不含凝固剂

2．连线无菌技术的类型、方法及对象

3．纯化大肠杆菌

(1)制备固体培养基的流程：

计算

称量溶化

灭菌倒平板 ??平板划线法

(2)纯化方法?

?稀释涂布平板法?

知识点二 土壤中分解尿素细菌的分离和计数

(1)菌种筛选：使用尿素是唯一氮源的选择培养基培养。

(2)统计菌落数目：常用方法有稀释涂布平板法、显微镜直接计数法。

(3)细菌分离与计数的实验流程：土壤取样→配制培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。

知识点三 分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素酶

(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。 (2)作用：纤维素――→纤维二糖――→葡萄糖。 C酶苷酶

X

C1酶葡萄糖

2．筛选方法

(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 (2)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。 3．实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量 梯度稀释

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈

一、理解运用能力 判断下列叙述的正误。

(1)根据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型(×) (2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分(√)

(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求(√) (4)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)

(5)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√) (6)统计样品中的活菌一般用平板划线法(×)

(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌(×)

(8)刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物(√) (9)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶(×)

(10)筛选分解纤维素的微生物的培养基中是以纤维素为唯一碳源的选择培养基(√) 二、图表分析能力

下表为筛选分解尿素细菌的培养基，据此回答问题：

KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 1.4 g 2．1 g 0．2 g 葡萄糖 尿素 琼脂 10．0 g 1．0 g 15．0 g 将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL (1)在该培养基中尿素的作用是什么？琼脂的作用是什么？ 答案：尿素作唯一氮源，起选择作用；琼脂作为凝固剂，用于制备固体培养基。 (2)对筛选出的细菌要进行进一步的鉴定，如何鉴定？

答案：在培养基中再加入酚红指示剂，培养细菌后，pH升高，指示剂将变红。

[理清脉络]

考点一|培养基及微生物的纯化培养技术

1．培养基的种类 (1)按物理状态分类： 培养基种类 液体培养基 固体培养基 (2)按功能分类： 种类 制备方法 原理 依据某些微 选择培 养基 培养基中 加入某些 化学物质 生物对某些 物质的特殊 需求或抗性 而设计 用途 从众多微 生物中分 离所需的 微生物 举例 加入青霉 素分离得 到酵母菌 和霉菌 特点 不加凝固剂 加凝固剂 (如琼脂) 用途 工业生产 微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏 培养基中 鉴别培 养基 加入某种 指示剂或 化学药品 2.微生物的纯化培养 方法 平板划线法 (1)接种环的灼烧： 产生特定的 颜色或其他 变化 鉴别不同 种类的微 生物 用伊红— 美蓝培养 基鉴别大 肠杆菌 稀释涂布平板法 (1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处 (2)涂布平板时： ①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃 ②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精 ③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体 ①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物 ②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端 ③划线结束后：杀死残留菌种，避免注意事项 污染环境和感染操作者 (2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种 (3)划线时最后一区域不要与第一区域相连 (4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破 [典例1] (2014·扬州测试)下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是( )

A．在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌 B．划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上

C．接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的 D．第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数

[解析] 在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。

[答案] C

1．消毒和灭菌的辨析

条件 结果 常用方法 煮沸消毒法 较为温和的消毒 物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 化学药剂 消毒法 灼烧灭菌法 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 干热灭菌法 高压蒸汽 灭菌法 2．并非所有生物所需的营养物质都相同 (1)微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。

(2)在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。 (3)在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。 [针对练习]

高考命题常从以下角度设置陷阱

(1)从各种相近的选项中直接筛选消毒或灭菌的方法。 (2)给定操作对象，据此选择合适的消毒、灭菌方法。 1．除了高温加热以外，其他灭菌方法还有( ) A．紫外线照射 C．用保鲜膜密闭

B．真空包装 D．添加防腐剂

巴氏消毒法 应用范围 日常用品 不耐高温的液体 用酒精擦拭 双手，用氯 气消毒水源 接种工具 玻璃器皿、 金属工具 培养基及容 器的灭菌 灭菌 解析：选A 灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。真空包装、添加防腐剂、用保鲜膜密闭都只起到了抑菌作用，而紫外线照射使细菌的蛋白质变性，核酸受破坏，是灭菌方法。

2．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )

A．接种环、手、培养基

B．高压锅、手、接种环 D．接种环、手、高压锅

C．培养基、手、接种环

解析：选C 一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的

病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。

考点二|微生物的筛选与计数

1．筛选菌株

(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 (2)菌株筛选原理的比较：

土壤中分解尿素的细菌 ①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源 ②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂， 若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素 2.统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法：

①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。 ③缺点：不能区分死菌与活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法)：

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。

[典例2] (2014·广州质检)利用农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是( )

―→反应罐水解――→压滤出渣――→ 秸秆秸秆碎屑― ―→真空分馏 酒精发酵―

A．可用刚果红染色法筛选过程①所需的纤维素分解菌 B．过程①加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶

④

①

②

③

分解纤维素的微生物 ①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源 ②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 C．酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵 D．酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌

[解析] 筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。

[答案] B

1．分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。 2．平板划线法只适合用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

3．分离能分解纤维素的微生物时，有时需要进行选择培养，选择培养的目的是增大选择对象在样液中的浓度，以确保用刚果红染色法鉴别时确实能得到所需菌种。

选择培养基的应用

(1)选择培养基在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。目的是培养、分离出特定微生物。

(2)选择培养基应用实例：

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 ②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺乏氮源时，可以分离得到固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

[针对练习]

3．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出( )

①大肠杆菌 ②霉菌 ③放线菌 ④固氮细菌 A．④②③ C．①③④

B．①②③ D．只有③④

解析：选A 缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，故能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。

[课堂对点练]

题组一 微生物的培养和纯化

1．(2013·江苏高考)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是( )

A．培养基分装到培养皿后进行灭菌 B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线 C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养 D．培养过程中每隔一周观察一次

解析：选B 培养微生物过程中应先灭菌再倒平板；每一次划线前都要进行接种环的灼烧灭菌；接种后的培养皿应在恒温培养箱中进行培养，光照会影响温度等条件；培养过程中观察间隔的时间一般不超过24 h。

2．(2012·北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( )

A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中 B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上 C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

解析：选C 将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培养材料一旦被微生物(如细菌)污染，将严重影响实验结果；选择培养基中已经加入了某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，另外土壤浸出液本身也含有一定量的微生物，因此将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上时不进行严格的无菌操作，对实验结果影响不大。

题组二 微生物的筛选与计数

3．(2013·安徽高考)下图为通过DNA分子杂交鉴定含有某特定DNA的细菌克隆示意图。下列叙述正确的是( )

A．根据培养皿中菌落数可以准确计算样品中含有的活菌实际数目 B．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 C．重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接 D．放射自显影结果可以显示原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位置

解析：选D 读图可知，接种该微生物所用的方法是稀释涂布平板法，而通过该方法只能估算样品中含有的活菌数；外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达，而不是复制；重组质粒与探针之间的杂交原理是碱基互补配对；放射自显影结果显示的杂交链位臵与原培养皿中含有特定DNA的细菌菌落位臵相同。

4．(2013·课标卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：

(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用________法或________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。

(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明__________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。

(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素________。

解析：(1)微生物的常用接种方法为划线法和稀释涂布法。(2)能够使菌落均匀生长、布满平板的接种方法为涂布法。(3)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。

答案：(1)划线 稀释涂布(或涂布) (2)涂布 (3)敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A的弱 耐药菌 (4)A

[课下提能练]

一、选择题

1．下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是( ) ．

A．灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 B．消毒和灭菌的条件、结果、方法是相同的 C．接种环用灼烧法灭菌

D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等

解析：选B 灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死部分微生物，不能杀死芽孢和孢子。

2．能够测定样品活菌数的方法是( ) A．稀释涂布平板法 C．质量法

B．直接计数法 D．比浊法

解析：选A 直接计数法是利用特定的计数板，在显微镜下计算一定容积量样品中微生物的数量，不能区分死菌与活菌；质量法是用于微生物生长测定的一种方法，有湿重法和干重法，也可以通过测蛋白质和DNA含量反映细胞的物质质量；比浊法是在一定范围内，悬液中细胞浓度与浑浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大；活菌在适宜培养基和良好生长条件下通过生长形成菌落，此法又称活菌计数法，可采用稀释涂布平板法接种。

3．下列关于分离纤维素分解菌的实验操作有误的是( ) A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少

C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量 D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到不含纤维素的培养基上

解析：选A 经选择培养后，需经稀释后才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

4．(2014·宿州质检)分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )

选项 A B C D

注：“＋”表示加入，“－”表示不加。

解析：选C 分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且尿素作为唯一的氮源，不能添加硝酸盐。

尿素 ＋ － ＋ ＋ 琼脂糖 ＋ － ＋ － 葡萄糖 ＋ － ＋ － 硝酸盐 ＋ － － ＋

5．下列关于微生物培养基的叙述，错误的是( ) A．制备固体培养基，可以在液体培养基中加入凝固剂琼脂 B．微生物在固体培养基表面生长形成的菌落，可以用肉眼观察到 C．所有培养基都含有相同的水、碳源、氮源和无机盐等四类物质 D．培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素

解析：选C 微生物在固体培养基上生长，可以形成肉眼可见的菌落；培养不同的微生物，所需配方存在差异；培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素。

6．使用液体选择培养基培养纤维素分解菌的目的是( )

①用液体选择培养基可获得大量纤维素分解菌 ②用液体培养基便于稀释涂布平板 ③纤维素分解菌只能在液体培养基中生长 ④用液体培养基可鉴别纤维素分解菌

A．①② C．②④

B．①③ D．③④

解析：选A 使用液体选择培养基培养纤维素分解菌，一方面可以获得大量纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。纤维素分解菌也可以在固体培养基上生长；鉴别纤维素分解菌使用的是固体培养基。

7．研究者从冰川土样中分离获得了具有较高脂肪酶活性的青霉菌菌株，为了在此基础上获得脂肪酶活性更高的菌株，最可行的做法是( )

A．用紫外线照射青霉菌菌株，再进行筛选

B．将青霉菌菌株与能高效水解蛋白质的菌株混合培养，再进行筛选 C．将能高效水解蛋白质的菌株的基因导入青霉菌菌株，再进行筛选

D．设置培养基中各种营养成分的浓度梯度，对青霉菌菌株分别培养，再进行筛选 解析：选A 基因突变是不定向的，紫外线处理后再进行筛选有可能获得脂肪酶活性更高的菌株。

8．大多数微生物的扩大培养，利用的都是牛肉膏蛋白胨固体培养基。下表所示牛肉膏蛋白胨培养基的成分及含量。相关叙述错误的是( )

成分 含量 牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g 氯化钠 5 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1 000 mL (定容体积) A．该培养基为微生物提供维生素的有牛肉膏、蛋白胨 B．该培养基为微生物提供氮源的有牛肉膏、蛋白胨 C．该培养基为微生物提供碳源的有牛肉膏、蛋白胨 D．该培养基能为微生物提供无机盐的只有NaCl

解析：选D 牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、维生素以及磷酸盐等，其中磷酸盐属于无机盐。

二、非选择题

9．(2014·深圳模考)下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基配方： KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g 尿素 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 定容至 1 000 mL 请根据以上配方，回答下列问题： (1)该培养基含有微生物所需要的________类营养物质。其中最主要的碳源是________，氮源是________。

(2)该培养基按物理性质划分是________培养基；按培养基的作用划分是________培养基。

(3)该培养基具有选择作用的原因是___________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)在该培养基中，可通过检测pH的变化来判断尿素是否被分解，依据的原理是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 所用方法是在培养基中加入________指示剂，如果尿素被分解，则培养基变成________色。

解析：(1)该培养基中含有碳源、氮源、水和无机盐四类营养物质，葡萄糖是最主要的碳源，尿素是氮源。(2)由于有凝固剂琼脂的存在，该培养基属于固体培养基。(3)由于尿素是该培养基的唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生长，因此该培养基属于选择培养基。(4)尿素被分解可产生氨，氨能使酚红指示剂变成红色，据此可推测培养基中的尿素是否被分解。

答案：(1)4 葡萄糖 尿素 (2)固体 选择 (3)该培养基中唯一的氮源是尿素，只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长和繁殖 (4)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 酚红 红

10．(2014·安庆一模)下面的甲图表示酵母菌、硝化细菌和乳酸菌在半固体培养基中的生长情况，乙图表示这三种菌的增殖速度与氧气浓度之间的关系，请据图回答：

(1)乙图中a、b、c三条曲线依次表示甲图________号试管中微生物在不同氧气浓度中的增殖速度。

(2)研究发现，青霉素能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。如果培养

基中混杂了这三类微生物，请设计实验，利用改变培养基成分等培养条件，将酵母菌和硝化细菌分离出来。

①主要步骤：

a．分别配制不含________的培养基(A)和加入________的培养基(B)，分别灭菌。 b．分别接种混合液放在适宜条件下培养。 c．观察结果。

②结果：在A培养基上生存的是________，在B培养基上生存的是________。 (3)微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是________________________________。 (4)若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________________。

解析：从甲图试管中微生物的分布和数量分析，乳酸菌分布在缺氧的下层，酵母菌在缺氧的底部和氧含量高的上层均匀分布，而硝化细菌主要分布在上层，因此可以判断出a、b、c曲线表示3、2、1号试管中的微生物增殖速度。青霉素破坏细菌的细胞壁，而酵母菌属于真菌，青霉素不能起到杀灭的作用，硝化细菌属于自养生物，不需要添加葡萄糖作为能源物质和碳源。

答案：(1)3、2、1 (2)①有机碳源 青霉素 ②硝化细菌 酵母菌 (3)防止杂菌污染(无菌技术) (4)稀释涂布平板法

11．根据有关微生物的知识，分析回答问题：

(1)当水体过于纯净时，硝化细菌会形成休眠体，这种休眠体被称为________。

(2)对于混有硝化细菌、蓝细菌和大肠杆菌的悬浮液，可利用选择培养基进行微生物筛选。筛选硝化细菌的培养基成分包括____________________(供选：葡萄糖、纤维素、牛肉膏、(NH4)2SO4、KNO3、无机盐、琼脂、伊红美蓝染料、H2O)，制备培养基时，灭菌与调pH的先后顺序是____________________。

(3)如利用上述培养基筛选大肠杆菌菌落，则应另外添加的成分是__________________，菌落特征为________。

(4)将采自养殖池中的水样1 mL稀释100倍，然后吸取稀释后的水样1 mL，接种于上述硝化细菌选择培养基上培养，接种所使用的工具是________。一段时间后观察菌落并计数，实验重复三次结果如图所示。该养殖池每毫升水含有硝化细菌________个。

解析：硝化细菌属于自养生物，能通过化能合成作用合成糖类，因此不用添加碳源葡萄糖和纤维素。制备培养基时，要先调节pH，再灭菌。大肠杆菌属于异养生物，培养基中需要添加葡萄糖，还应添加伊红美蓝染料染色。稀释100倍后的三次实验的培养基中菌落的平均

数是8，因此在稀释前的每毫升水中含有800个硝化细菌。

答案：(1)芽孢 (2)(NH4)2SO4、无机盐、琼脂、H2O 先调pH再灭菌 (3)葡萄糖、伊红美蓝染料 呈现黑色 (4)涂布器 800

12．(2013·四川高考)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。

(1)图甲中，过程①需要的酶有______________________。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以__________作为唯一碳源。②、③过程需重复几次，目的是_________________。

(2)某同学尝试过程③的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是________________________________________________________________

____________________；推测该同学接种时可能的操作失误是_____________________。 (3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种______________菌的发酵罐需要先排气，其原因是__________________________________

____________________________。

(4)用凝胶色谱法分离α-淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较________。

解析：(1)由题目所给信息可以直接看出，工程酵母菌比普通酵母菌利用淀粉的能力强。在以淀粉为唯一碳源的培养基上，工程酵母菌可以正常增殖，而普通酵母菌不能正常增殖。(2)微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，根据图乙菌落分布情况可确定该同学的接种方法是后者；由图乙中菌落过于集中可推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀。(3)在以淀粉为原料的培养液中，普通酵母菌繁殖慢，产生气体少；工程酵母菌繁殖快，产生气体多。(4)当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的蛋白质不易进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。

答案：(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 淀粉 进一步筛选纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌

(2)稀释涂布平板法 涂布不均匀

(3)工程酵母 工程酵母菌分解淀粉产生葡萄糖的能力强，导致酒精发酵产生CO2的速率更快 (4)小

第三讲固定化酶、蛋白质的分离及PCR技术

知识点一 酵母细胞的固定化

(1)概念：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

(2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)实验操作：

酵母细胞的活化

配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液

配制海藻酸钠溶液

海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

固定化酵母细胞

知识点二 多聚酶链式反应扩增DNA片段 [动漫演示更形象 见课件光盘] 1．PCR原理

DNA热变性原理，即： 双链DNA

加热，双螺旋结构解体

缓慢冷却，分离的DNA链又重新结合

单链DNA

2．PCR反应过程

(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。

(2)复性：温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 (3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

知识点三 血红蛋白的提取和分离 1．方法及原理

方法 凝胶色谱法 原理 根据相对分子质量的大小分离蛋白质

电泳法 2.实验操作程序 各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同 样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液

粗分离：用透析法除去样品中相对分子质量较小的杂质

纯化：用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化

纯度鉴定：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白

进行纯度鉴定

一、理解运用能力 判断下列叙述的正误。

(1)固定化酶常采用化学结合法和包埋法(×) (2)固定化细胞常采用包埋法(√)

(3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小(2012·江苏卷T17A)(√) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌(2012·江苏卷T17D)(√) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液(×) (接下页右栏)

(6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物(×) (7)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来(×)

(8)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关(×)

(9)在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移速率完全取决于分子的大小(√) (10)DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头开始合成DNA(√) (11)在PCR技术中，DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸(×) 二、读图析图能力

(接下页右栏)

据酶的固定方式示意图回答问题：

(1)图1、图2、图3各表示酶固定的哪些方式？ 答案：包埋法 化学结合法 物理吸附法

(2)固定化酶和固定化细胞一般常采用什么方法？请分析原因。

答案：酶多适合用化学结合和物理吸附法固定，而细胞外采用包埋法固定。因为细胞个大，难以被吸附或结合；而酶分子很小，容易从包埋材料中漏出。

[理清脉络]

考点一| 固定化酶与固定化细胞技术

1．制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵

酵母细胞的活化(使处于休眠状态的酵母细胞重新恢重正常的生活状态：称取1 g干酵 母，放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL，用玻璃棒搅拌，使 酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1 h左右，使其活化)

配制物质的量浓度为

0.05 mol/L的CaCl2溶液 ?称取0.83 g无水CaCl2溶于150 mL蒸馏水中?

配制海藻酸钠溶液?称取0.7 g海藻酸钠，放入50 mL小烧杯中，加入10 mL水，用酒精灯 小火间断加热，边加热边搅拌，至完全溶化，定容至10 mL?

海藻酸钠溶液与酵母?混合之前海藻酸钠溶液要冷却至室温，加入已活化的酵母细胞后进 细胞混合

行充分搅拌，混合均匀后，再转移至注射器中?

固定化酵母细胞?将混合液滴在CaCl2溶液中，形成凝胶珠，将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸

泡30 min?

冲洗[将固定好的酵母细胞?凝胶珠?用蒸馏水冲洗2～3次]

发酵?将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200 mL的锥形瓶中，再加入固定好

的酵母细胞，置于25 ℃下发酵24 h?

2．注意事项

(1)细胞的固定化要在严格无菌条件下进行；对制备的海藻酸钠溶液、CaCl2溶液以及注身器等器材进行严格灭菌。

(2)溶化海藻酸钠时采用小火间断加热法，防止海藻酸钠焦糊。

(3)海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；浓度过低，凝胶珠；浓度过低，凝胶珠所包埋的酵母细胞数量少。

[典例1] (2014·安庆模拟)下列有关固定化酵母细胞中的有机物( ) A．实验中需要先利用蒸馏水消耗酵母细胞中的有机物

B．固定酵母细胞的常用方法是吸附法，这种方法对酵母细胞活性影响最小 C．实验中使用CaCl2溶液处理的目的是使酵母细胞处于感受态，提高发酵效率 D．若最终凝胶珠的颜色泛白，可能是由于海藻酸钠溶液的浓度偏低

[解析] 固定化酶母细胞的过程为：活化酶母细胞(利用蒸馏水使干酵母菌恢复正常生活状态)→海藻酸钠、CaCl2溶液的配制(在溶解海藻酸钠的过程中使用小火或间断加热，防止溶液焦糊)→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合(注意冷却海藻酸钠溶液至室温，防止高温破坏酵母菌的活性)→固定化酵母细胞。实验中CaCl2溶液的作用是使凝胶珠形成稳定的结构。若海藻酸钠溶液的浓度过低，会导致固定的细胞数目较少，观察到的凝胶珠颜色浅。

[答案] D

混淆固定化酶与固定化细胞

1．固定化酶和固定化细胞技术的比较

名称 包埋法 化学结 合法 物理吸 附法 原理 将酶或细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中 利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上 通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在纤维素、琼脂糖、多孔玻璃或离子交换树脂等载体上 图示 2．固定化酶与固定化细胞的比较 固定酶的种类 适用方法 优点 特点 缺点 实例 [针对练习]

固定化酶 一种 化学结合法、物理吸附法 酶与反应物结合，又与产物分离，固定在载体上的酶可反复利用 一种酶只能催化一种或一类化学反应 固定化葡萄糖异构酶 固定化细胞 一系列 包埋法 成本低，操作更容易 可能导致反应效果下降 固定化酵母细胞 高考命题常从以下角度设置陷阱

高考对此类问题常结合酵母细胞的固定化，考查固定化酶与固定化细胞技术的区别和联系。

1．(2014·长沙模考)下列说法不正确的是( ) ．

A．固定化酶和固定化细胞的技术方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法 B．固定化酶更适合采用化学结合法和物理吸附法

C．由于细胞个大，而酶分子很小，因此细胞多采用物理吸附法固定 D．反应物是大分子物质时应采用固定化酶

解析：选C 由于细胞个大，酶分子很小，个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。因此，细胞多采用包埋法固定，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定。

考点二| 蛋白质的分离

1．常用的蛋白质分离方法 (1)凝胶色谱法： 蛋白质 比较 凝胶内部 运动方式 运动路程 洗脱次序 (2)电泳法原理： ①在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

相对分子质量大 被排阻在凝胶颗粒外面，迅速通过 垂直向下 较短 先流出 相对分子质量小 进入凝胶颗粒内部，被滞留 垂直向下和无规则扩散运动 较长 后流出 ②由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

2．血红蛋白的提取和分离

红细胞洗涤——离心去除血清?? ↓

(1)样品的处理?释放血红蛋白——蒸馏水涨破

?? ↓分离血红蛋白—离心处理?2?精分离——透析?去除小分子杂质

(3)纯化——凝胶色谱法进行分离和纯化

(4)纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

[典例2] 下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。我们通常选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_____________________________________________。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶认，则A是________；乙装置中，C溶液的作用是________。 (3)甲装置用于________，目的是__________________________________________。 用乙装置分离蛋白质的方法叫________，是根据____________________________ 分离蛋白质的有效方法。在操作中加样(下图)的正确顺序是________。

(4)最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行________。

[解析] 本题考查血红蛋白的提取和分离的过程和方法。(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，柠

檬酸钠具有防止血液凝固的作用。(2)甲装臵中，B是血红蛋白溶注，则A是磷酸缓冲液；乙装臵中，C溶液的作用是洗脱血红蛋白。(3)甲装臵用于透析(粗分离)，目的是去除样品中分子量较小的杂质。用乙装臵分离蛋白质的方法叫凝胶谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。(4)分离的蛋白质可经SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

[答案] (1)运输 防止血液凝固 (2)磷酸缓部液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中分子量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 ④①②③

(4)纯度鉴定

“血红蛋白的提取和分离实验”中的注意事项

(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要抵速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

(2)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且能除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的气泡。

(3)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 (4)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。 [针对练习]

2．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述中，错误的是( ) A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质 B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质 C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜

D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法

解析：选A 猪是哺乳动物，其成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，故不能从中提取出DNA。

考点三| PCR技术的原理及应用

1． 细胞内DNA复制与PCR技术的比较

解旋 不 同 点 酶 引物 温度 DNA解旋酶、DNA聚合酶 RNA 体内温和条件 细胞内DNA复制 在解旋酶作用下，边解旋边复制 PCR 90℃以上高温解旋，双链完全分开 Taq DNA聚合酶 DNA或RNA 高温 相 同 点 ①需提供DNA复制的模板； ②四种脱氧核苷酸为原料； ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端 2.PCR反应的过程 (1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：

(2)复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

(3)延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

[典例3] 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题：

(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将____________________________________ ________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。

(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到______________________，

它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫________________________________________________________________。

(3)PCR的每次循环可以分为______________________________________________ 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约朋________个这样的DNA片段。

(4)请用简图表示出一个DNA片段PCR反应中第二轮的产物。 (5)简述PCR技术的主要应用。

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

[解析] (1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3′-羟基上，与DNA母链结合的引物就提供这个羟基。

(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。

(3)DNA复制时两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。

(4)新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链不带有引物。

(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。

[答案] (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的TaqDNA聚合酶选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32

(4)如图所示：

(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定(要求3项以上)

1．DNA分子复制的人工控制

(1)解开螺旋：在80～100 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。 (2)恢复螺旋：在50 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。 (3)复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。 (4)反应场所：PCR仪。 2．PCR技术中的引物

(1)含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。 (2)作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。 (3)种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。 (4)数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。

(5)与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。 [针对练习]

3．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的．是

( )

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

解析：选C PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其延伸过程中需要DNA聚合

酶、ATP和四种脱氧核苷酸。

[课堂对点练]

题组一 酶的制备及应用

1．(2013·江苏高考)下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是 ( ) A．可用包埋法制备固定化酵母细胞 B．反应产物对固定化酶的活性没有影响 C．葡萄糖异构酶固定前后专一性不同

D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应

解析：选A 本题考查酶或细胞的固定化技术，意在考查对固定化酶和固定化细胞在方法选择和催化反应等方面异同的比较辨别能力。细胞难以被吸附或结合，固定化细胞多采用包埋法，A项正确；反应产物积累能影响酶的结构，从而使酶的活性下降，B项错误；葡萄糖异构酶在固定前后专一性不变，C项错误；固定化细胞固定的是一系列的酶，可以催化一系列的反应，但不能催化各种反应底物的一系列反应，D项错误。

2．(2012·江苏高考)下列关于酶和固定化酵母细胞的研究与应用的叙述，错误的是

( )

A．从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药

C．尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用 D．将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌

解析：选D 酶的固定方式有包埋法、化学结合法和物理吸附法，物理吸附法是利用吸附剂本身的表面张力对附近的分子产生吸附，与化学结合法相比，不会使被吸附物质的性质发生改变，所以吸附法对酶活性影响较小，A项说法正确；消化酶在人体消化道内发挥作用，蛋白酶制剂一般在最外面加上糖衣后通过口服方式给药，B项说法正确；尿糖试纸是一种由葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色的化合物固定于滤纸上制成的酶试纸，不能反复利用，C项说法错误；制作固定化酵母细胞时，将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗的目的是洗去CaCl2和杂菌，防止凝胶珠硬度过大和杂菌污染，D项说法正确。

3．(2011·江苏高考)下列有关酶的制备和应用的叙述，正确的是( ) A．酶解法和吸水涨破法常用于制备微生物的胞内酶 B．透析、电泳和酸解等方法常用于酶的分离与纯化 C．棉织物不能使用添加纤维素酶的洗衣粉进行洗涤 D．多酶片中的胃蛋白酶位于片剂的核心层

解析：选A 酶解法可去除微生物的细胞壁，再通过吸水涨破法使细胞内的物质释放出来，提取分离其中的胞内酶；透析和电泳可用于酶的分离和纯化，但酸解会破坏酶的结构；棉织物的主要成分是纤维素，可用含纤维素酶的洗衣粉洗涤，因为纤维素酶使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果；多酶片中的胃蛋白酶应在片剂的糖衣外层，而片剂的核心层应是在小肠中发挥作用的胰蛋白酶等。

题组二 PCR技术与蛋白质的分离

4．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是( ) ．A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测

D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢

解析：选D 生理盐水和红细胞内的溶液为等渗溶液，A正确；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞内，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少，B正确；血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测，C正确；凝胶色谱法分离蛋白质，分子量较小的易进入凝胶内部，移动速度比较慢，故血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动快，D错误。

5．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述多次循环：95 ℃下使模板DNA变性、解链→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中正确的是( )

A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基之间的磷酸二酯键

B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D．PCR与细胞内DNA复制所需要酶的最适温度是相同的

解析：选B 变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键；延伸过程中需要的原料是脱氧核糖核苷酸；PCR过程中所需的DNA聚合酶是耐高温的，与细胞内DNA复制所需酶的最适温度不相同。

6．PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3im.html