Vero细胞的微载体培养_放大过程中的接种工艺

Vol.24No.6

1998212华　东　理　工　大　学　学　报　　　　　JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology　　　　　 659

Vero细胞的微载体培养

——放大过程中的接种工艺

张　立3　严　春　范卫民　张元兴　俞俊棠

(华东理工大学生物化工研究所,上海200237)

提要:概述了用微载体系统培养贴壁细胞放大过程中的接种方法,研究了球转球

的工艺条件,并建立了球转球的动力学模型。用此方法成功地在国产50L生物反应

器中培养Vero细胞,细胞密度达1.1×107cells mL。

关键词:细胞培养;Vero细胞;接种技术;微载体;放大培养

中图分类号:Q951.6,R978.19

,[1],但这些病毒1967年VanWezelAL[2]成功地

R利用DEAE22,让贴壁依赖性细胞贴附在微体上在生

、最有效的模式[3]。80年代,开发了多种有效的微载体,如PharmL(Swede)的Cytodex21、Cytodex23,90年代开发了巨孔载体及相应的生物反应器[4]。同时,科研人员对培养工艺也进行了研究。

当培养规模较小(如1.5L,2.5L)时,游离的种子细胞可从方瓶或滚瓶中获得;当培养规模较大,就需要一级甚至多级种子反应器,这时的细胞就不是游离细胞,而是贴在微载体上的,这就使得放大培养产生困难。为了解决此困难,可以将贴在微载体上的种子细胞用胰蛋白酶消化下来,再重新接到更多的微载体上[5],该方法在理论上可行,但在实际生产中,细胞经过消化,活性受到一定伤害,消化后的微载体部分被破坏,不能被细胞再贴附,即使没有被完全破坏,其贴壁率也明显下降,影响细胞的生长,不适合大规模培养。另一种方法是通过球转球方法(beads2to2beads),让老的微载体上的细胞通过球间架桥,转移到新的微载体上,使细胞在新的微载体上生长[6,7]。这种方法操作步骤简单,污染机会相对较少,细胞活性高,微载体损失少,可以连续使用,但至今很少见到报道微载体培养过程中球转球的具体工艺条件,多数是凭经验。本文研究了球转球的工艺条件,并建立了球转球的动力学模型,为大规模生产奠定了基础。1　材料和方法

1.1　材料

细胞:非洲绿猴肾Vero细胞(ATCC):150～180代。

培养基:DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,GIBCOL),加5%～10%小牛血收稿日期:1998202218

660 　　　华　东　理　工　大　学　学　报第24卷清,用碳酸氢钠或盐酸调至pH7.0～7.2。

小牛血清:由华东理工大学生工所制备,0.1Λm膜除菌过滤,使用前将血清置于56°C恒温水浴中灭活30min。

抗生素:硫酸庆大霉素(上海第三制药厂)。

微载体:CT23微载体(由华东理工大学研制)。

转瓶:500mL转瓶(Wheaton,USA)装液200mL。

反应器:1.5L、5LCelliGen细胞培养反应器(http://www.77cn.com.cnA),50LCellCul250A细胞培养生物反应器(华东理工大学研制)。

1.2　实验方法

(1)微载体的预处理和灭菌见参考文献[8]。

(2)用500mL转瓶,CT23微载体浓度为3g L,用补加10%小牛血清的DMEM培养

5Vero细胞,细胞接种密度为2.0×10cells mL。当微载体上细胞长到一定程度后2g L,最终微载体浓度为5g L。新球与老球的比例为2∶3,,,每隔45min转动2min,3h后正常运行,(3)用CelliGen1.5L,补加一定的微载体,31、3∶1、4∶1,进行球转球实验,。

(4,当细胞生长到一定密度时,将细CellCul250A细胞培养反应器中,进行球转球操作,然后进入正常培养阶段[7,温度控制在37±0.1°C,溶解氧为50%空气饱和度,转速为20～32r min。

1.3　分析方法

细胞计数:柠檬酸结晶紫染色法[9]。葡萄糖浓度:用生化分析仪分析(YellowCo.2700型,

[7]USA)。乳酸浓度:用生化分析仪分析。NH4含量测定:尿素氮试剂盒。病毒鉴定:病毒滴度+

(LD50)用小鼠接种法测定[10]。电镜照片:有细胞贴附的微载体离心后,用磷酸缓冲液(PBS)洗三次,再用戊二醛固定,样品由华东理工大学分析测试中心电镜室处理后拍照。

2　结果与讨论

2.1　细胞生长状态对球转球的影响

转瓶中微载体浓度为3g L,当微载体上细胞分别长到:①微载体上没有完全被细胞贴满,②微载体上已被细胞贴满,③微载体上的细胞已长成多层时,补加新的微载体2g L,以后每天取样计数光球数和满球率,结果如表1。从表1可以看出,当微载体上细胞已长到致密单层时补加微载体,可使新的微载体上较快地有细胞贴附,贴壁率很快达到100%,其他两种情况需要较长时间贴壁率才能达到100%。这可能由于球间转移方式是通过细胞粘附搭桥生长或单个细胞迁居生长[6]。当细胞生长旺盛时,细胞搭桥生长或迁居生长能力强;当微载体上细胞长满时,细胞向外生长的趋势明显,因而更易进行球转球(见图1)。因此,当微载体上已被细胞贴满时,补加适量微载体进行球转球时机最好。

第6期张　立等:Vero细胞的微载体培养　　　 661

2.2　新老球比例对球转球表1　不同细胞生长状态对球转球的影响

Table1　Theinfluenceofcellgrowthstatesonbeads2to2beads

Theplatingrateafteraddingmicrocarriers(%)

1d

Microcarrierswithnotfullcells722d913d1004d100的影响在CelliGen1.5L生物反应器中,微载体浓度分别为2g L和3g L,补加一定

98100100100量的微载体,进行球转球实Microcarrierswithfullcells

7990100100Microcarrierswithmultilayercells验,以后每天取样,观察计算

3Underthemicroscope,1000microcarrierswerenumberedrandomlyand贴壁率,结果如表2。从表中platingratewasdefinitedas:可以看出,当新球比例增加×100%platingrate=1000时,细胞贴壁率降低,同时贴the

壁率达到100%的时间也相

表2　新老球比例对球转球的影响应加长。为了增加放大规模,同时

有较高的细胞贴壁率和较短的贴　　　Table2　Theinfluencethenewomoon

beads壁时间,根据本实验结果,新老球

pmicrocarriers(%)的比例以3∶1为优。　　用球转球方法,以CelliGen

5L子罐,l2胞培

ero细

胞,,培养New23∶33∶22∶1

3∶1

4∶11d3d4d5d989896918469100100100969176100100100100978710010010010010097 100988d,细胞密度达1.1×

107cells

mL(见图2),然后接种狂犬病

毒,连续培养10d,病毒滴度超过国家标准。

2.3　球转球动力学模型的建立

关于游离细胞在微载体上的贴壁动力学研究已有不少报道[11,12],但关于球转球动力学的研究较少,以下对球转球动力学进行初步探讨。假设:(1)由于微载体浓度较小(新球和老球的

图1　球转球的电镜照片

Fig.1　Thephotoofbeads2to2beads图2　Vero细胞在CellCul250A生物反应器中的培养Fig.2　ThecultureofVerocellinCellCul250Abioreactor

662 　　　华　东　理　工　大　学　学　报第24卷最大浓度为5g L),可假设瞬间球与球随机碰撞时,只有两个球相撞。(2)满球与满球接触时,不发生球间转移作用,只有当满球与空球接触时细胞发生球间转移作用。

根据文献报道[13～15],该过程符合一级反应,即

-dC dt=kC

式中:C—没有细胞生长的微载体的浓度(g L);k—

反应速度常数,与环境温度,转速,微载体浓度,新

老球比例等因素有关。

上式积分,得

ktlnC C0=-kt或C C0=e

当t=0时,C=C0

式中:C0—补加新球的微载体浓度(g L)。

定义新球的转球率为7:7=(C0-C) C0=

-1-C C0=1-ekt图计算机拟合表2的数据,有较好的相容性,见.3p22after

图3。同时拟合文献[6]献

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～200AnimalBiotechnology.London:AcademicPress,1992.5:189

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第6期

～982Bioeng.1988,32:975张　立等:Vero细胞的微载体培养　　　 663

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18(3):213～219

InoculumTechnologyinLarge-scale

CellCultureonMicrocarriers

ZhangLi,YanChun,FanWeimin,ZhangYuanxingandYuJuntang3

(InstituteofBiochemicalEngineeringECUST,Shanghai200237)Abstract:Theinoculummethodsofanchoragedcelllarge2scalecultureweresummarized.Thetechnologicalconditionsof2tothekineticmodelofbeads2to2beadswasestablished.B,culturein

7domesticCellCul250Abioreactorwasldreach1.1×10

cells mL.

Keywordslumtechnology;microcarriers;large2scale

()

Synthesisof2,3,4-Trifluoronitrobenzenefrom

2,3-Dichloronitrobenzene

ZhuZhihua,XuPeiruo,YanZhiguang3

(DepartmentofChemicalEngineeringECUST,Shanghai200237)

ZhangMing

(ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,AcademicSinica,Shanghai200232)

Abstract:Amethodisgivenforsynthesisof2,3,42trifluoronitrobenzenefrom2,32dichloronitrobenzenebyfluorination,chlorination,nitration,etc.Thesuitabletechnological

.conditionswereinvestigatedforeachstepsInordertoincreasetheyieldoffluorination

whichwasthekeystep,somephase2transfercatalystswereusedandresearched.Theresultshowedthattheyieldoffluorinationwasincreasedabout10%moreinphase2transfercatalyststhaninsolvents.Ascomparedwiththeothermethodsforpreparing2,3,42trifluoronitrobenzene,thissynthesisroutehasmanyadvantageswithrespecttolowcosts,mildconditions,easyoperations,etc.Ithasbeenprovedthatthisisanewpracticalsynthesismethodintechnologyandeconomy.

Keywords:2,3,42trifluoronitrobenzene;synthesis;fluorination;chlorination;nitration

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3hyl.html