基于双模板协同共组装新策略的纳米仿生骨材料的可控制备研究

华中科技大学

博士学位论文

基于双模板协同共组装新策略的纳米仿生骨材料的可控制备研

究

姓名：王江林

申请学位级别：博士

专业：生物材料与组织工程

指导教师：张胜民

2010-06

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摘 要

自然界经过长期的演化产生了许多结构完美、性能优异的天然生物材料。如坚硬的鲍鱼壳、坚韧的蜘蛛丝、锋利的鼠牙以及兼有高强度和高韧性的天然骨材料等等。探讨和揭示这些天然生物材料的形成机理和组装结构已成为仿生材料合成的关键所在。随着对生物矿化本质的发现和认识，即有机分子介导无机成分的矿化沉积。因此，模板自组装介导合成仿生材料的策略是近年来研究热点问题。通过这种模板介导法合成的材料不仅仅局限于成分上仿生，而更加注重的是结构仿生。由于天然材料的各种优异性能都与其多级结构密切相关，因此通过对其多级组装结构的模拟和仿生必定能大大提高仿生材料的特殊性能。

本课题在现有单模板介导机制的基础上提出了基于双模板协同共组装介导纳米仿生骨材料的受控制备。这是对当前单模板介导仿生策略的一个重要突破。天然骨材料多模板协同共组装的结果，因此双模板机制更加接近天然骨的形成方式。但是随着模板数量的增加，其模板的活性中心也在增加，多活性中心的存在易扰乱晶体的成核生长。

本论文首先选择结构和介导效应相似、功能互补的胶原蛋白(Collagen)和丝素蛋白(Silk fibroin)作为协同共组装的两个起始模板，藉以实现纳米仿生纳米仿生骨替代材料体系的制备。利用圆二色谱和SDS-PAGE对模板蛋白结构进行表征结果证明，胶原蛋白和丝素蛋白作为两种纤维状分子具有很好的协同效应，且形成的新协同共组装模板其二级结构更加稳定。

基于胶原和丝素蛋白协同共组装的新策略，我们合成了胶原-丝素/羟基磷灰石的纳米仿生复合材料，并以单模板介导的材料（胶原-羟基磷灰石；丝素-羟基磷灰石）为对照。通过对该共组装双模板介导的材料进行了系列表征后，结果表明，获得无机晶体是纳米级针状羟基磷灰石，形貌与性能与天然骨中的无机成分非常类似。此外，通过对无机晶体的TEM 和SAED分析证明了无机晶体是沿纤维性蛋白的C轴方向取向生长的，再结合FTIR、XRD和DLS的综合分析结果，论文提出了

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一个关于纤维性双模板蛋白分子介导晶体生长的可能分子机制及成核过程模式。

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells）是目前骨组织工程最具应用潜力的种子细胞之一。本文进一步利用骨髓间充质干细胞对这种新型的基于双模板协同共组装的纳米仿生骨材料进行生物相容性评价。体外细胞实验结果表明，该材料具有良好的生物相容性，能够很好的支持骨髓间充质干细胞的黏附、增殖以及分化。

此外，还研究了骨髓间充质干细胞在该仿生材料上的成骨分化。通过在细胞和分子两个水平对成骨分化进行了定性和定量分析。定性染色结果表明，成骨分化早期和晚期的两个特异性的标志，碱性磷酸酶和钙结节染色均为阳性染色结果。RT-PCR结果更进一步的表明，成骨分化的一些特异性基因在各个不同时期均有表达，其中I型胶原蛋白基因为组成性表达，且在分化各个时期均高效稳定表达。碱性磷酸酶基因在成骨分化早期表达量高，晚期表达量低。而骨钙素和骨粘素则在分化晚期高效表达。

最后，通过动物实验进一步研究了该类仿生材料的体内生物相容性。结果表明，细胞-仿生材料复合体在植入体内8周，无任何明显的急性免疫反应，具有良好的生物相容性，并且具有良好的新骨形成能力。骨内植入实验表明。该细胞-仿生材料复合体具有良好的骨修复性能。

关键词：双模板；共组装；仿生骨；生物相容性；成骨分化

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Abstract

Many natural biomaterials with perfect structures and unique properties have been created by nature through a long evolution, such as hard abalone shell, tough spider silk, sharp mouse teeth and high mechanical natural bone etc. Nowadays, the vital issue is to focus on the formation mechanism and assembled structure of these natural biomaterials. With the discovery on the nature of biomineralization, that is organic molecules direct mineralized deposit of inorganic crystals. Therefore, it becomes a very hotpot thesis to synthesize biomimetic materials based on template self-assembled strategy. This novel template-directed route is able to fabricate the materials not only on the bionic component, but on the bionic structure. The outstanding properties of natural materials are highly related to hierarchical structure. Thus, it should greatly enhance the specific properties of biomimetic materials via the bionics of hierarchical structure.

In this study, a novel bi-template co-assembly strategy is firstly proposesd to synthesize a new biomimetic bone-like material. This route is a vital breakthrough based on the current basis of single-template. It is well known that the natural bone is outcome of multi-template co-assembly. Therefore, the bi-template strategy may be highly close to simulate the formation nature of the natural bone in comparison with single-template method. However, the number of active center is increased with the increase of number of template. Nucleation and growth of crystal may be distorted by such many active centers.

In this dissertation, we firstly selected collagen and silk fibroin as co-assembled initial template to come true the synthesized system of biomimetic nanobone substitute. The two proteins are selected due to their similar structure, compensative properties and common directed function. The structural characterization and component analysis of the template protein were investigated by CD and SDS-PAGE. The results indicated that

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collagen and silk fibroin as two fibrous protein molecules exhibited great cooperative effect. In addition, collagen and silk fibroin are able to form a more stable secondary structure of co-assembly bi-template

Collagen-silk fibroin/hydroxyapatite biomimetic nanocomposite was prepared via bi-template co-assembled strategy. As a control, collagen-hydroxyapatite and silk fibroin-hydroxyapatite were prepared by single-template directed method. The results of characterization indicated the inorganic crystal was nano-scale and needle-like hydroxyapatite, which was very similar to the natural bone on the morphology and properties. Furthermore, TEM and SAED results suggested that the inorganic crystal was an oriented growth along the c axis of fibrous template. We also proposed a possible growth model about crystal growth directed by fibrous bi-template.

Currently, bone marrow mesenchymal stem cells are one of the most potential seeded cells in the bone tissue engineering. The biocompatibility of the new biomimetic nano-scale bone materials, which were prepared based on bi-template co-assembly strategy, were further evaluated by the bone marrow mesenchymal stem cells. The results of cell assay indicated that this new material had good biocompatibility and were capable of supporting the adhesion, proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

In addition, the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells on the bi-template-induced biomimetic materials was investigated on the qualitative analysis of the cell level and the quantitive analysis of the molecular level. The qualitative staining results indicated that both the alkaline phosphatase (ALP) and the calcium nodule as two specific markers in the early and later stage displaced the positive staining results. The results of RT-PCR further confirmed that some specific genes could express in the different staged on the process of osteogenic differentiation. Type I collagen as a constitutive expression gene expressed highly and steadily at every stage of osteogenic differentiation. Alkaline phosphatase as a specific gene expressed highly in the early

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stage, but lowly in the later stage. Moreover, osteocalcin and osteonectin as a specific gene expressed lowly in the early stage, but highly in the later stage.

Lastly, the animal assay was further investigated to estimated the biocompatibility of the novel bi-template-induced materials in vivo. The results suggested that there was good biocompatibility and also no obvious acute immunity reaction. H&E staining results confirmed that this cell-material composites exhibited good ability of new bone formation in vivo and also were a great bone repaired substitute.

Key words: Bi-template; Co-assembly; Biomimetic bone; Biocompatibility; Osteogenic differentiation

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独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：

日期：年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□，在_____年解密后适用本授权书。

本论文属于

不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者签名：指导教师签名：

日期：年月日日期：年月日

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第一章 绪论

1.1骨组织工程研究现状

人体各种组织、器官的功能障碍或丧失业已成为危害人类健康的头号大敌，也是人类疾病和死亡的最直接原因。针对因遗传、创伤、疾病等因素所造成的组织或器官损伤，当前临床上主要是通过自体或异体组织移植的治疗手段，以恢复组织结构完整性，重建组织功能。但是，自体组织移植是一种以创伤治疗创伤的传统治疗模式，如皮肤移植、自体骨移植等，存在着牺牲自体正常组织，对供体造成新的创伤等缺点。同种异体组织或器官移植，由于其组织或器官来源有限，且病人需长期甚至终身应用免疫抑制剂来控制排异反应，此外还存在物种之间致病原传播的风险，在实际临床应用上还存在较大争论。因此，寻找和制造新的组织或器官的替代物以克服组织、器官移植过程中存在的上述问题，成为现代医学发展的主要方向之一[1,2]。

组织工程(Tissue Engineering)一词最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出，1988年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科[3]。它的出现标志着现代医学将走出组织、器官移植范畴，步入组织、器官制造的新时代。与传统组织移植相比，组织工程的优点在于：①通过构建结构完整、功能齐全、具有生命力的健康活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的全面重建；②植入体内的组织工程化的组织在体内可以和机体正常组织整合良好，可对体内各种生物学效应刺激产生应答，达到永久性替代的目标；

③可用少量的组织细胞（如利用组织穿刺的方法取得），经过体外扩增培养后，修复体积较大的组织缺损，达到无损伤修复创伤和真正意义上的功能重建；④可根据组织、器官缺损情况，通过先进制造和三维重建等新技术构建相应形态与结构的组

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织，达到完美的形态修复。

自从组织工程概念被提出以来，组织工程产业已获得飞速发展。其中以骨组织工程的发展最为瞩目，也是目前公认的是能最快获得实际应用的领域。现代骨组织工程主要是基于支架生物材料，种子细胞和生长因子三个要素，其中支架生物材料一方面作为种子细胞和生长因子的载体将其运送至缺损部位，另一方面给组织生长提供一个三维空间和力学支撑，是骨组织工程研究的关键所在，同时也是全世界研究力量投入最多的地方。Hollister SJ在其最近的综述报告中提出了关于骨组织工程支架材料设计的4F准则：既，形状诉求(Form)、性能诉求(Function)、再生诉求(Formation)、可植入性诉求(Fixation)[4]。形状诉求是指支架材料的设计必须要完全满足缺损部位的复杂的三维缺陷，并且提供足够的空间来诱导再生组织填充整个缺陷；性能诉求是指支架材料必需拥有相应的性能（主要是机械性能和生物相容性），可以在缺损组织得到修复之前暂时起到缺失组织的替代作用来满足日常活动的需求；再生诉求是指支架材料能够通过释放生长因子和提供合适的环境来促进新组织再生，以达到快速修复的目的；可植入性指的是支架材料在外科手术中具有可植入性，并且可以牢固的固定在缺损部位，不会发生脱落、移位等现象。

骨组织工程种子细胞的应用是现代组织工程区别于传统的生物材料替换的重要标志之一。理想的骨组织工程种子细胞应具备取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖能力强；植入体内后能耐受机体免疫，且无致瘤性等[5]。近年来骨组织工程种子细胞的研究进展迅速，不同的种子细胞表现出不一样的生物学特性，按细胞来源来分，可分为自体细胞、异种细胞以及干细胞等，每一种来源的细胞都有其自身的优缺点[6]。最佳的细胞来源是病人的自体细胞，将其进行体外扩增培养后通过组织工程的方法来修复自体，体内移植后无任何免疫排斥反应，因此受到广泛青睐，也是目前组织工程研究中应用最为广泛的一种细胞来源。但是，自体细胞也存在一些局限性问题有待进一步解决，如细胞来源有限，体外难以大量扩增，并且存在去分化现象等。另一种子细胞是来源于动物的异种细胞，由于人体许多组织都缺乏自身细胞供应（如，心肌细胞，神经细胞等），因此科研人员希望通过对异种细胞进行修饰，使其免疫原性大大降低且不影响其正常的生物功能，这样修饰后的异种细

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胞来作为种子细胞。然而，除了免疫原性问题外异种细胞进行体内移植的难度也是十分巨大。鉴于自体细胞和动物异体细胞作为种子细胞来源存在众多难以克服的限制性因素，因此，近来年的种子细胞的研究方向开始集中在干细胞的研究领域，其中组织干细胞的研究已经取得了突破性进展[7-9]。与自体细胞和动物异体细胞相比，干细胞具有以下的特点：1.取材简便，对机体损伤小；2.具有强大的增殖能力，在体外短时间可大量扩增；3.具有全能或多能分化潜能，其中胚胎干细胞具有全能性，可以分化所有的组织功能细胞，组织干细胞也具有多能性，可以分化定向多种祖源细胞；4.干细胞还具备低免疫原性和免疫调节活性，移植后的排斥反应小甚至没有等。

生长因子在骨形成中的作用也日益受到重视。多种生长因子参与骨组织形成与功能重建过程。生长因子通过调节细胞增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，因此，在骨组织工程中存在广泛的应用前景[10]。目前应用于骨组织工程的生长因子，主要包括以下几种：BMP（骨形态形成/发生蛋白）、bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、VEGF（血管内皮生长因子）、PDGF（血小板衍化生长因子）、IGF（胰岛素样生长因子）、TGF-β（转化生长因子）、ANG（血管生长素）等。这些生长因子的结构不同，靶细胞也不同，但彼此之间互相影响[11-13]。

1.2 骨的成份、结构及性能

世界上每年由于疾病，意外事故和人口老龄化等原因所导致的骨损伤病人日趋增多，对骨修复及骨替代材料的需求也日趋增大，由此大力推动了人工骨修复及替代材料的研究和发展[14-19]。研究表明，人工骨修复材料是最具应用前景的组织工程产品之一。天然骨材料利用简单的有机和无机成分通过多级组装的策略从而获得诸多优异的性能，不仅为人体提供力学支撑，而且还具有一定的自我修复和更新功能[20-22]。多年来的研究表明，天然骨的这些优异性能是与其多级组装的结构密切相关的，而这种自组装的结构是受其成分的调节和控制，因此了解和掌握骨的组成、结构和性能是研究骨修复材料的前提条件和重要环节。

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1.2.1 骨的成份

天然骨主要是有无机成分和有机成分两大部分组成，其中无机成份主要是羟基磷灰石(hydroxyapatite)，有机成分则比较复杂，但主要是有蛋白、多糖和脂类构成，不同类型的骨组织以及发育的不同时期的骨组织差别较大[23-25]。例如在硬骨组织中，其胶原蛋白(collagen)成分中I型胶原蛋白占85-90%，而在软骨组织中，主要是II型胶原蛋白，I型胶原蛋白含量较少，并且在硬骨和软骨形成过程中，其I型胶原蛋白的结构也有差别，Cameron认为软骨中I型胶原蛋白较窄，其直径只有10-20nm，且排列较为疏松，有序性不高[26]。Bonucci研究发现在硬骨中I型胶原蛋白的平均直径是78nm，并且这些胶原都是高度有序排列的[27]。因此我们可以看出，有机成分的差异是导致软骨和硬骨机械性能差别的第一要素。

胶原蛋白是细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的主要成分，目前至少发现有20种胶原蛋白，其总含量占体内蛋白的总量的25%左右。胶原蛋白的一级结构具有重复性的三肽序列，即-(Gly-X-Y)n-,其中的X和Y位点上多为脯氨酸和羟基脯氨酸[28-30]。这两种氨基酸在胶原蛋白中的含量约占14%。胶原分子中甘氨酸残基位于三股螺旋的中心，羟脯氨酸残基对于氢键的形成及三股螺旋的的稳定性起重大左右[31,32]。具有三股螺旋结构的前胶原分子通过组装形成胶原纤维，胶原纤维进一步装配成胶原束，最后矿物质在这些胶原束上矿化沉积形成骨组织。

羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）分子式为Ca10(PO4)6(OH)2，其晶体为六方晶系，结构为六角柱体。羟基磷灰石是动物骨骼和牙齿的主要无机成分，在人骨中其质量分数达到60%左右，其最显著特点是它具有人体骨组织相似的无机成分，含有人体组织所必需的钙磷元素，并具有优异的生物相容性以及良好的骨诱导性。植入体内后，在体液的作用下，钙和磷元素会游离出材料表面，被机体组织所吸收，并能与人体骨组织形成化学键合，诱导生长出新的组织[33]。

天然骨中的羟基磷灰石的高度钙化赋予了骨的优异的机械性能，羟基磷灰石沿着胶原纤维的长轴方向定向矿化，包埋在胶原纤维内并通过多级自组装形成骨组织[34,35]。天然骨中羟基磷灰石是具备纳米尺寸的短棒状晶体形貌，在TEM观察下其

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长度约为30-50nm，宽约为15-30nm，厚度为2-10nm[36-38]。而近年来，Hassenkam 的研究结果表明在AFM观察下其长度和宽度约在30-200nm，AFM的结果比TEM 要长一些，原因是TEM观察是由于超声分散导致部分晶体被破坏[39]。XRD结果表明天然骨中的无机成分主要是弱结晶化的羟基磷灰石，并且有部分是被碳酸根（4-6%），金属钠离子（0.9%）和镁离子（0.5%）所取代[33, 40, 41]。骨无机质具有坚硬的性质，赋予骨的刚性特点。

1.2.2 骨的结构和性能

天然骨具有一些明显的特性：强而不脆，硬而柔软，质轻却足以支撑组织，强度高却呈多孔形貌，稳定却在不断再生等等。骨的这些完美结构和优异性能是通过多级自组装而形成的，目前对骨形成过程中的多级自组装进行了大量深入且细致的研究，以人类的密质骨为例，一般公认Weiner的七级分级结构（见图1-1）这种模型很好的阐明天然骨的多级自组装过程[21]。

骨具有复杂的分级结构，从图1-1可以看到，骨组织的每一级结构都是由更微观、更有序的下一级结构组成[21]。

第一级：1nm，构成骨的主要成分，包括有机胶原蛋白纤维和无机羟基磷灰石纳米晶体。

第二级：100nm，胶原纤维蛋白自组装和纳米晶体在其间的定向矿化的细装体

第三级：1 μm，矿化胶原纤维束

第四级：10μm，矿化胶原纤维束的排列方式

第五级：1mm，胶原纤维束/骨细胞（骨单位）的同心层状结构，骨单位组成的各种显微结构

第六级：>1mm，密质骨的宏观结构

第七级：10cm，整个骨的结构

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图1-1. 人类密质骨的分级结构示意图[21]

Figure 1-1. Hierarchical structure of human compact bone

除天然人骨之外，类似的分级结构还广泛存在于其他多种天然的生物材料中，如斑马鱼的鱼骨、象牙等都具有多级分级结构[43, 44]。

清华大学崔福斋等人报道了斑马鱼的鱼脊椎骨多级结构分类图。与人体骨一样也大致可以分为七个等级：

第一级，基本单元，无机成分的羟基磷灰石晶体和有机成分的三股螺旋胶原分子； 第二级，羟基磷灰石在自组装胶原分子的三维空间中形成矿化的胶原纤维； 第三级，矿化的胶原通过周期性的横过条痕定向排列成60-70nm ；

第四级，斑马鱼骨中两种胶原的阵列的排列方式；

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7第五级，脊椎骨上的薄片结构；

第六级，脊椎骨；

第七级，骨架

图1-2. 斑马鱼骨的多级组装示意图[43]

Figure 1-2. Hierarchical assembly structure of the bone of Zebra fish

象牙的多级组装结构也是相当复杂，它具有与天然骨、牙类似的分级结构（图

1.3），（a ）第五级，象的长牙，外围层部分是牙骨质，内层部分是象牙；（b ）第四级，象牙具有左旋和右旋两个方向层交织网络结构；（c ）第三级，矿化胶原束的定向有序排列；（d ）第二级，由单个胶原分子逐级组装成定向有序排列的胶原束；（e ）第一级，单个具有三股螺旋结构胶原纤维分子。不同之处是象牙中胶原纤维的直径比其他矿化组织中的小。另外，象牙中胶原纤维的位向也不同于其他硬组织的“格

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板”模型，象牙中的矿化胶原纤维是在两个方向分布的网格上交织形成的。象牙是由胶原纤维束的层结构组成，层厚为0.3-0.4nm，左旋和右旋两个不同方向的层相互交织形成网络结构。两层之间胶原纤维位向是逐渐变化的，这种结构特性对于象牙的力学性能至关重要[44]。

图1-3. 象牙的多级结构示意图[44]

Figure 1-3. Hierarchical assembly structure of ivory

1.3 骨形成的生物矿化过程

天然骨具有如此完美的结构和诸多优异的性能主要取决于骨形成的生物矿化过程[45, 46]。生物矿化从周围环境中选择性吸取必要元素，并在严格的生物控制下将其组装成功能化的结构的过程。生物矿化区别于自然界中形成的一般矿化（无生物参与），具有如下的特性：矿化结构高度有序：极高的强度和极好的韧性；生物矿化一般是具有择优的晶体生长取向；有机质与矿物质的具有明显相互作用；矿物质是基于整个生物代谢过程中形成，并参与代谢[47-49]。

总体来看，生物矿化的过程大致可以分为四个阶段：首先是有机生物大分子预组装构造有序的反应环境；其次是有机-无机界面的分子识别；再次是有机分子对无

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机矿化质的生长调节，使晶体初级组装形成亚单位；最后通过细胞加工，亚单位组装形成多级组装结构[50, 51]。

有机基质对生物矿化的调节和控制作用是当前研究的热点问题之一。一般来说，当有机基质表面结构与晶体的某一晶面的晶格参数相匹配时，可以降低晶体的成核活化能[52-54]。诱导晶体沿该晶面择优取向生长，形成大小均一，取向一致的晶体。有机基质分子提供了一个有效的活性中心，使晶体在这个中心内定向生长，同时又对晶体生长的空间给予约束和限制，使晶体在结构、形态及尺寸上得到可控[55-58]。

生物矿化区别于其他自然矿化就在于整个过程有生物及细胞的参与，细胞在代谢过程中分泌的一些有机大分子必然对矿化过程起到调控作用[59-62]。细胞外基质(extracellular matrix) 按其成分来分，包括胶原蛋白、非胶原蛋白、糖类、脂类以及水。其中胶原蛋白种类繁多，目前发现的已有20多种，胶原蛋白是细胞外基质的最主要成分。非胶原蛋白主要包括一些弹性蛋白(elastin)、粘性蛋白(如纤粘蛋白，fibronectin；层粘蛋白，laminin) 等。糖类包括粘多糖(Glycosaminoglycans)和蛋白聚糖(Proteoglycans)[63-68]。

细胞外基质的功能包括两个方面，一是对细胞本身作用，二是作为有机大分子对晶体生长介导作用。前者具有调控细胞的生长和分化，对细胞提供三维力学保护，作为细胞与外环境的桥梁和媒介。后者主要针对各种细胞外基质的有机成分在生物矿化过程中的调控功能。胶原蛋白的矿化调控作用研究最多也最为深入；此外，还包括细胞基质分泌的其他一些蛋白，如骨钙素(osteocalcin)、牙釉质蛋白1(dentin matrix protein 1)、碱性磷酸酶等等(Alkaline phosphatase)等介导的生物矿化[69-71]。

通过对天然生物材料中的矿化组织结构和矿化机制的研究和掌握，可以为我们仿生设计和合成具有特定结构和功能的材料和器件提供理论依据。我们以天然骨为例来阐述生物矿化的过程以及有机大分子是如何调控无机晶体生长的。目前研究表明，骨中的I型胶原蛋白对无机纳米羟基磷灰石的调控起主要作用[72, 73]。I型胶原分子(collagen)首先通过逐级组装形成胶原束(collagen fibres)，然后羟基磷灰石沿胶原束的长轴方向定向成核生长形成矿化胶原(mineralized collagen)，最后这些矿化胶

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原在定向排列形成微米级的骨亚单位，进而形成宏观的骨结构[74-76]。从天然骨的矿化过程中可以看出，纳米级的胶原束分子作为矿化模板分子(template molecule)对沿其生长的羟基磷灰石具有调控作用，具体表现为，一是限制羟基磷灰石的尺寸，要保证其在纳米级的范围内；二是调控晶体生长的取向，以获得优异的机械性能。因此，这种天然骨的形成机制对我们仿生合成类骨替代材料提供了很好的理论基础。

1.4 仿生生物材料的研究进展

天然材料经过数亿万年的进化，形成了完美特殊的结构和优异的性能。天然材料几乎都是复合材料，包括不同材质、不同结构、不同功能的复合使天然生物材料的性能远远超过单一材料。生物系统的准确与精巧更令科学家们折服，并促使科学家从中得到灵感和启迪，他们希望能从生物体那里获得启示并设法解开这一自然界隐藏深久的奥秘：简单的原材料，经过活的有机体加工后，其性能竟远远优于当今利用任何高科技生产出的高级人工合成材料[77,78]。因此，受到自然界得启发，科研人员迫切需要揭示天然生物材料的结构特征和形成机制，进而应用于现代材料的设计与制备。

例如，深海中海鳗的发电器瞬间可以发出800伏的电压,其电量足以电死一头大象,然而它的发电器却不是金属等导电器材,而是蛋白质的分子集合体;深海里的一些软体动物,其体表无疑也是由细胞材料所构成,然而却可以承受海水的高压力而自由地生存。这些例子表明,许多天然生物材料组成和结构是我们不完全知道的,这些材料大多数是通过常温常压的条件所形成,并能发挥出特殊的性能。当人们对这些生物现象的本质有了充分的理解之后,就可以把它们应用于材料科学技术的各个方面,这就形成了仿生材料学。因此,仿生材料学的研究内容就是以阐明和揭示生物体的材料构造与形成过程为目标,用生物材料的观点来思考人工材料,从生物功能的角度来考虑材料的设计与制作。仿生材料也正是指模仿天然材料的各种特点以及特性而研制开发的材料。通常通过模拟生命系统的运行模式和生物材料的结构规律而设计制造的人工材料称为仿生材料（biomimetic materials）。自然界在长期的进

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化演变过程中，形成了众多具有完美结构形态和独特优异性能的生物材料[79-81]。通过对这些天然生物材料中的结构成分以及形成机理的研究，为人类仿生设计与合成特定结构和性能的仿生材料奠定了良好的理论基础。

研究发现贝壳珍珠层的成分组成中95%是碳酸钙，可是其断裂韧性强度却是普通的单相碳酸钙的一千倍。究其原因是由贝壳珍珠层碳酸钙特殊的排列结构决定的。贝壳的结构可以分为三层，从外向内依次是角质层、棱柱层和珍珠层，其中以珍珠层部分最为强韧。珍珠层的成分包括文石晶体（正交结构的碳酸钙）、有机基质和少量的水。尽管在珍珠层中有机基质虽然仅占5%左右，但这些有机基质对文石晶体成核、定向、尺寸和空间形态等方面的调控作用使其在纳米水平上表现出非凡的有序性和强度。精细结构表征的结果显示，位于珍珠层类的文石晶体（Aragonite）与其间的有机介质交替叠层排列产生韧化效应从而造成贝壳具有偏转裂纹的特殊功能。有鉴于此，人们通过仿生学的原理和方法来模拟和设计这种有机－无机交替排列的策略来增加韧性防止断裂。例如，Saridaya就以铝金属为软物质相，以碳化硼硬物质相，仿生合成了类珍珠层复合陶瓷材料，其断裂韧性提高了30％；而Clegg 则以石墨为软物质相，以碳化硅为陶瓷基硬物质相，叠层热压成型，制成的SiC/石墨增韧复合材料，其断裂韧性提高了100倍[82,83]。

蛛丝作为作为一种特殊的天然生物材料归因于其优异的机械性能和良好的力学强度，其拉伸强度远远高于普通的涤纶等纺织材料，并且其断裂能是所有目前纤维中最好的。它的优点不仅仅局限于机械强度，还具备人工纤维所无法比拟的高韧性和高弹性，因为我们说蛛丝是当今世界上最优异的纤维。进一步对蛛丝进行精细结构解析表明，在蛛丝中存在两种差异极大的区域即结晶区和非结晶。结晶区的蛛丝蛋白主要以β-sheet二级结构为主，氨基酸组成为聚丙氨酸链段，结晶区的二级结构分子链沿着纤维轴方向呈反向平行排列。非结晶区主要由侧链基团较大的氨基酸组成，且大部分含有活性基团，这些活性基团之间相互影响使之无法规则排列而最终形成了非结晶区。非结晶区的二级结构主要是β-turn为主。当施加外力压缩时，结晶区因沿轴线方向抵消了大部分外力作用，使之表现出良好的强度性能。当施加外力拉伸时，非结晶区则产生作用而起到良好的弹性性能。人们从蛛丝的结晶区和

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非结晶区中获得无限灵感，许多学者纷纷对其进行深入研究，期望可以揭开蛛丝高强度高弹性的神秘面纱。美国康乃尔大学的学者研究发现，蛛丝的强度与其氨基酸的组成有密切关系，并且还提出了与蛛丝氨基酸组成相似的蛋白均具备与其相近的机械性能[84,85]。

竹子是长纤维增强复合材料的典型代表，其增强体-维管束的分布是不均匀的，外层致密，内层则逐步散开，而其内层变成另一种细密结构。研究表明，竹材的拉伸强度、杨氏模量、压缩强度等的变化趋势是由外（表皮）至内（髓环）逐渐减小[86]。对竹材的精细结构进一步研究表明，竹纤维包括多层相同的薄厚一样纤维层，每一层中纤维丝则以不等的角度呈上升分布，纤维丝与纤维层的夹角取决于层的薄厚度，通常薄层夹角较大为30-45゜；厚层夹角较小为3-5゜。不同层面的界面内的升角逐渐的变化，这样就意味着可以用来抵制物理和几何的突变，因而相邻层面的结合也可以大为提高[87]。同时，外层厚度的增加使竹材正向刚度有所降低，但切向刚度则会大幅度提高。竹材这种外密内疏的结构特性对合成高强度高韧性的复合材料有重要的指导意义。

天然骨基质是由无机物矿物和生物大分子排列所组成的复合材料，前者主要为纳米级羟基磷灰石，后者是胶原蛋白分子，两者极为均匀一致，有序结合在一起。仿生骨基质材料就是设计一种具有和天然骨基质类似的结构（结构仿生）和功能（功能仿生）的骨基质材料。这种仿生骨基质材料应在体内可降解，无毒性以及其它不良反应，而且通过它降解可以诱导矿化的形成等[88]。动物长骨具备两端粗大，中间细小且较长的哑铃外型特点。这种特殊的结构可以用来抵御外界压力的直接冲击，有利于应力的传递，因为比较出；良好的机械性能。人们从骨的外型形状中得到灵感，提出了一种基于哑铃形的短纤维的设计理念，获得了端球半径和纤维长度的最佳比值，实际结果也证实了，这种具备哑铃形的纤维比普通纤维的增强效果好[89]。

以上仅仅是仿生材料界几个典型的代表事例，人类经过万年的文明至今，在材料设计和合成等众多领域均取得了非凡的成就，例如在高分子化学世界里,我们已经成功合成出了聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸脂、聚酰胺等人工材料,具有多种多样的功能；在金属材料领域，我们已经制造出多种高强度、高韧性、耐高温、抗腐蚀

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和耐磨损的金属材料以及铝、镁和钛等合金材料；在无机非金属材料领域，已经合成高性能的陶瓷材料、人工晶体材料和功能化玻璃材料等等。但是,人类所创造的这些先进材料与自然界生物材料相比不能在结构层次还是在功能方面仍存在很大的差距。因此，当前基于仿生材料合成与制造业已成为材料领域取得突破性进展的一个新策略。

1.5 分子自组装的研究进展

1.5.1 分子自组装的定义、原理及分类

分子自组装是指分子与分子在一定条件下，依赖非共价键分子间作用力自发连接形成结构稳定的分子聚集体的过程。通过分子自组装技术可以合成一些具有新奇的光、电、催化及其它功能和特殊性能的自组装新型材料[90]。分子自组装在生物工程技术中的建模、表面工程、分子器件以及纳米材料领域已经有广泛的应用。

分子自组装的原理是利用分子与分子中某一片段与另一片段之间的分子识别，相互之间通过非共价作用形成具有特定排列顺序的分子聚合体。并不是所有的分子都能够形成自组装过程，它的产生需要两个条件：一个条件是自组装的动力。自组装的动力是指分子间的弱相互作用力的协同作用，它为分子自组装提供能量。分子自发地通过无数非共价键的弱相互作用力作为自组装的动力，这些弱相互作用力包括氢键、疏水作用力、范德化力、静电力、π-π堆积作用、阳离子-π吸附作用等。非共价键的弱相互作用力是维持自组装体系的结构稳定性和完整性。另一个则是导向作用。自组装的导向作用是指分子在空间的互补性，也就是说要保证分子自组装发生就必须在空间的尺寸和方向上达到分子重排要求[91-93]。

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图1-4. 两性肽分子自组装的示意图[93]

Figure 1-4. Self-assembly of peptide-amphiphile molecule

分子自组装的分类方法也是多种多样的，我们按照分子自组装组分不同而将分子自组装分为表面活性剂自组装、纳米粒子自组装以及大分子自组装。

表面活性剂两亲分子在材料表面上、在膜中的排列或在胶体聚集体中是高度有序排列的。通过改变和设计两亲高分子的排列分式，我们可以得到各种高性能的多功能材料。许多重要的生化反应和高技术含量的处理过程均是发生基于自组装而产生的隔膜、囊泡、单层膜或胶束上[94-96]。

纳米粒子所表现奇特功能可以通过修饰其尺度和几何外观来实现。因此，功能性纳米粒子的可控分级有序自组装是目前乃至将来很长一段时间里纳米科技发展的重要方向。纳米粒子自组装可分为一维、二维或三维有序结构后可以获得新颖的整体协同特性，并且通过控制纳米粒子间的相互作用来调节它们的特性[97]。目前，

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