分析化学实验指导书 - 图文

分析化学实验

指导书

（供全日制本科中药学、药学类专业用）

甘肃中医学院《分析化学实验》课程组编

（2004年10月）

前 言

《分析化学》是关于研究物质的组成、含量、结构、和形态等化学信息的分析方法及理论的一门科学，即是一门独立的化学信息科学。分析化学实验是分析化学课程的重要组成部分。它是通过实验的方法，使学生加深理解和巩固在分析化学课堂中所学的理论知识，并使学生正确熟练地掌握化学分析和仪器分析的基本操作和技能。通过实验可使学生学会正确合理地选择实验条件和实验仪器，善于观察实验现象和进行实验记录，正确处理数据和表达实验结果；培养学生良好的实验习惯、实事求是的科学态度和严谨细致的工作作风，以及独立思考、分析问题、解决问题的能力；以使学生逐步地掌握科学研究的技能和方法，为学习后续课程和将来工作奠定良好的实践基础。

本课程实验内容包括分析天平的称量练习、重量分析实验、滴定分析实验、电化学实验、高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱、紫外分光光度法实验，还包括自拟和自选实验。

实验内容总表：

一、化学分析实验： 序号 实验项目名称 学时数 项目 类别 实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 分析天平的称量练习 器皿的洗涤，使用，容器的校准 （3学时） （6学时） 基础 基础 基础 基础 基础 基础 基础 基础 项目 类型 必做 选做 必做 必做 选做 选做 必做 必做 氢氧化钠标准溶液（0.1 mol/L）的配制与标定 （3学时） 草酸含量测定 混合酸的测定 （3学时） （3学时） EDTA标准溶液（0.05 mol/L）的配制与标定 （3学时） 水的硬度测定 硫代硫酸钠标准溶液的配制与标定、碘标准溶液的配制与标定和维生素C片的含量测定 （3学时） （6学时） 实验九 实验十 0.02mol/LKMnO4标准溶液的配制与标定 H2O2含量的测定 （3学时） （3学时） 基础 基础 必做 必做 总学时

二、仪器分析实验：

序号 选六个18 实验项目名称 学时数 项目 类别 项目类型 选做 必做 实验十一 实验十二 饮用水中氟含量的测定 可见分光光度计性能检验 药物中铁含量的测定 （4学时） （5学时） 基础 基础 实验十三 双波长分光光度法测定安钠咖注射液中的咖啡因 （3学时） 基础 必做 实验十四 导数光谱法测定安钠咖注射液中的咖啡因 （3学时） 基础 选做 实验十五 维生素B12吸收光谱的绘制及其注射液的鉴别和测定 （3学时） 基础 选做 实验十六 实验十七 实验十八 实验十九 系数倍率法测定槐米中芦丁含量 生物碱成分薄层层析 菠菜叶色素的分离 (综合性实验) 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸 （3学时） （3学时） （3学时） （3学时） 基础 基础 基础 基础 选做 必做 选做 必做 实验二十 原子吸收法测定感冒冲剂中的铜 （3学时） （4学时） 基础 基础 选做 必做 实验二十一 气相色谱的载气流速与理论塔板高度的关系 实验二十二 苯甲酸、山梨酸的酯化衍生物及高相液相色谱测定 总学时 （4学时） 基础 必做 选30学时 这些实验的安排为学生将来参加药物新品种、新工艺、新技术的研究与开发及中药质量控制等打下坚实基础，为将来从事药学研究提供一个实践基础。

实验时数：

按2004年制订的本科专业学分制教学计划要求，规定中药学本科“分析分析实验”的计划学时数为48学时，可选做实验目录中的16个实验；药物制剂与中草药栽培与鉴定本科“分析化学实验”的计划学时数为66学时，可选做实验目录中的22个实验。

实验要求：

分析化学实验是一门实践性很强的学科，实验教学最重要的任务是发展学生查阅、动手、思维、想象和表达能力，重点是培养学生观察问题、分析问题和解决问题的能力，加强学生对“量”的概念的认识。是在老师指导下所进行的一种特殊形式的科学实践活动，是学生走向社会独立进行科学实践的预演。通过分析化学实验课的学习，学生应对具体的实验过程首先应该有一个直观、感性的认识，在此基础上再通过认真、严格、细致的操作练习，在获取实验数据的过程中培养良好的科学作风和独立从事科学实践的能力。具体要求如下：

1.开设实验课前，由指导老师制定实验教学进度，每个实验提前一周备课，明确实验的目的、要求和有关注意事项，做好记录。

2.每次实验，指导老师提前10—15分钟进入实验室，检查实验设施，熟悉药品摆放情况准备试剂、试样。

3．实验过程中，教师不得擅自离开实验室。注意巡视观察，认真辅导，随时纠正个别学生不规范的操作。实验结束后，检查学生的数据记录和实验台卫生情况，提醒学生检查水、电、气、门窗、钥匙柜是否关好。然后告知实验室值班人员，经检查合格后方可允许学生离开。

4.要求学生 课前必须认真预习。理解实验原理，了解实验步骤，探寻影响实验结果的关键环节，做好必要的预习笔记。未预习者不得进行实验。

5．教师在实验前先检查学生的预习报告，结合当次实验内容中涉及的操作要点进行简要讲解，然后指导学生做好实验准备工作。

6．学生实验开始后，要求学生仔细观察和详细、忠实记录实验中发生的各种实验现象，记录的原始数据不能删改（不能用铅笔记）。数据记录在专用的、预先编好页码的实验记录本上。如有疑问可与同组学生进行现场讨论，也可与指导老师探讨，必要时可重做实验，最后经指导老师认可，方能结束实验。

7．认真、及时写好实验报告。撰写实验报告是仪器分析实验的重要环节，实验数据的处理与分析都要在报告中体现出来。报告的内容除了实验名称、实验日期、实验仪器型号、实验操作条件等常规内容外，还要包括对该实验的总结与讨论，对少数实验异常现象进行解释分析，老师将批改实验报告并给出报告成绩。

8．所有实验结束后，要以口试、操作技能考核等多种方式进行期末考核，考核结果计入总成绩。

9.要求学生遵守实验室的各项规章制度。了解“消防设施”和“安全通道”的位置。树立环境保护意识，尽量降低化学物质（特别是有毒有害试剂以及洗液、洗衣粉等）的消耗。

10.要求学生保持室内安静，保持实验台面清洁整齐。爱护仪器和公共设施，树立良好的公共道德。 目录 化学分析部分

实验1 分析天平与称量

实验2 滴定分析器皿及其使用 实验3 容量器皿的校准 实验4 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液的配制与标定 实验5 草酸含量测定

实验6 混合酸（碱）测定方法的设计 (设计性实验) 实验7 0.05mol/LEDTA标准溶液的配制与标定 实验8 水硬度测定

实验9 硫代硫酸钠标准溶液的配制与标定、

碘标准溶液的配制与标定和维生素C片的含量测定

实验10 0.02mol/LKMnO4标准溶液的配制与标定 实验11 H2O2含量的测定

实验12 饮用水中氟含量的测定 实验13 分光光度计的性能检验 实验14 药物中微量铁的测定

实验15 吸收曲线的测绘及吸收系数的测定 实验16 标准曲线法测定芦丁含量

实验17 维生素B12注射液的定性鉴别、定量分析

实验18 双波长分光光度法测定安钠咖注射液中咖啡因的含量 实验19 导数光谱法测定安钠咖注射液中咖啡因的含量 实验20 银黄口服液中黄芩苷和绿原酸的含量测定 实验21 原子吸收法测定感冒冲剂中的铜

实验22 气相色谱的载气流速与理论塔板高度的关系 实验23 气相色谱法测定醇的同系物

实验24 苯甲酸、山梨酸的酯化衍生物及高相液相色谱测定 实验25 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸

实验26 柱色谱法测定氧化铝活度 实验27 纸色谱法分离氨基酸 实验28 薄层色谱法测定甜叶菊苷含量 实验29 双波长薄层色谱扫描法测定甲基红含量 实验30 菠菜叶色素的分离 (综合性实验)

实验31 槐花米中芦丁的色谱分离和鉴定（综合性实验） 实验32 金银花中绿原酸的TLC鉴别(设计性实验) 附录

实验1 分析天平与称量

一、实验目的

1．了解分析天平的结构，熟悉砝码的组合；

2．学会正确使用天平； 3．掌握直接称量和递减称量法。

二、基本原理

分析天平是定量分析中最重要的仪器之一，每一项定量分析工作都直接或间接地需要

使用天平，常用的分析天平有阻尼天平、半自动电光天平、全自动电光天平、单盘电光天平和电子天平等。这些天平的构造和使用方法虽有些不同，但基本原理是相同的。 (一) 分析天平的原理

各类分析天平都是根据杠杆原理设计制造的。 下图为半自动电光分析天平的结构示意图。

1．天平梁：是天平的主要部件。多用质轻坚固、膨胀系数小的铝铜合金制成，起平衡和承载物体的作用。梁上装有三个棱形的玛瑙刀，其中一个装在正中的称为支点刀，刀口向下；另外两个与支点刀等距离的分别安装在梁的两端，称为承重刀，刀口向下。三个刀口必须完全平行且位于同一水平面上。

2．支柱与水平泡：支柱是金属做的中空金属圆柱，下端固定在天平底座中央，支撑着天平梁。在支柱上装有水平泡，借螺旋垫脚调节天平放置水平。

3．指针和感量螺丝：指针固定在梁的正中，下端的后面有一块刻有分度的标牌，借以观察天平梁的倾斜程度。指针上装有感量螺丝，用来调节梁的重心，以改变天平的灵敏度。

4．吊耳和称量盘：吊耳挂在两个边刀上，下面挂有称量盘。通常左盘放称量物，右盘放砝码。

5．空气阻尼器：由两个特制的金属圆筒构成，外筒固定在支柱上，内筒比外筒略小，悬于吊耳钩下，两筒间隙均匀，没有摩擦。当梁摆动时，左右阻尼器的内筒也随之上下移动，使筒内外的空气压力一致，便产生抵制膨胀和压缩的力。这样利用筒内空气的阻力使之很快停摆达到平衡，以加快称量速度。

1—升降旋钮； 2—称量盘； 3—投影屏； 4—空气阻尼器； 5—玛瑙刀；

6—天平梁 ；7—平衡螺丝； 8—机械加码器； 9—指针； 10—立柱； 11—金属拉杆；

6．平衡螺丝：在梁的上部左右两端各装有一个螺丝，用来调节天平的零点。 7．升降枢：

8．天平箱：起保护天平的作用，在称量时，减少外界温度、空气流动、人的呼吸等的影响。

9．砝码：每台天平均附有一套砝码。1g以上的砝码用铜合金或不锈钢制成；1g以下的称为圈码。

(二) 天平的灵敏度

天平的灵敏度是指天平盘上增加1mg所引起的指针在读数标牌上偏移的格数，灵敏度(E)的单位为分度/mg，在实际工作中，常用灵敏度的倒数来表示天平的灵敏程度，即

S?1(mg/分度) ES称为天平的分度值，也称为感量。分度值越小的天平，其灵敏度越高。 (三) 称量的一般程序和方法

1．取下天平罩，叠好后放在天平箱后面或天平箱顶上。检查天平是否处于水平状态，盘上有无污垢，用软毛刷拭去灰尘。

2．检查、调整天平的零点：接通电源，慢慢开启天平，在不载重的情况下，检查投影屏

上的标尺的位置，若零点与投影屏上的标线不重合，可拨动升降旋钮下的扳手，挪动投影屏的位置，使其重合；若相差较大，可借平衡螺丝调整使其重合，即为天平的零点。 3．在台秤上粗称被称量物的质量。

4．将被称量物放入称量盘并关好侧门，在砝码盘上放置粗称得到的相应质量的砝码，开启天平，试称。根据砝码与称量物的质量关系，按照“由大到小，减半加入”的原则增减砝码，直至天平平衡。 (四) 称量方法

1．固定质量称量法 要求试样本身不吸水并在空气中性质稳定。

先称量容器(如表面皿)的质量，并记录平衡点。再称试样，如指定称取0.3000g时，在砝码盘上增加0.3000g砝码，在称量盘上加入略少于0.3g的试样，然后用药匙轻轻振动，使试样慢慢落入容器中，直至平衡点与称量容器时的平衡点刚好一致。

这种方法的优点是称量计算简便，结果计算方便。

2．递减称量法 这种方法称出的样品的质量不要求固定的数值，只需在一定范围内即

可。适应于易吸水、易氧化或易与CO2反应的物质。将此类物质盛在带盖的称量瓶中进行称量，既可以防止吸潮，又便于称量操作。

先在称量瓶中装入适量的试样(如果试样曾经烘干，应放在干燥器内冷却到室温)，用洁净的小纸条套在称量瓶上，先在台秤上粗称其质量，再将称量瓶放在分析天平上精确称出其质量，设为m1g。将称量瓶取出，用称量瓶盖轻轻敲瓶的上部，使试样慢慢落在容器内，然后慢慢将瓶竖起，用瓶盖敲瓶口上部，使粘在瓶口的试样落回瓶中，盖好瓶盖。再将称量瓶放回天平盘上称量，如此重复操作，直到倾出的试样质量达到要求为止。设倒出第一份试样后称量瓶与试样的质量为m2g，则第一份试样的质量为(m1?m2)g。 同上操作，逐次称量，即可称出多份样品。例如：

称量瓶＋样品(1)称量瓶＋样品(2)称量瓶＋样品(3)(4) 称量瓶＋样品21.2350g0.2222g21.0128g0.2212g20.7916g20.5701g0.2215g

三、仪器、试剂及其他 (一) 仪 器

分析天平 称量瓶 小烧杯(50mL) (二) 试 剂

氯化钠

四、实验内容

采用递减称量法称取两份氯化钠试样。每份0.2~0.3g。

五、注意事项

1．旋转升降柄时必须缓慢，轻开轻关。取放物体、增减砝码时，必须关闭天平，以免损

坏，玛瑙刀口。

2．称量时，应关好两个侧门。化学试剂和试样不能直接放在天平盘上称量，而应放在干净的称量瓶或坩锅内；具有腐蚀性的气体或吸湿性物质，必须放在称量瓶内或其它适当的密闭的容器内称量；称量的物体必须与天平箱内温度一致，不得把热的或冷的物体放进天平箱内称量。

3．绝不能使天平载重超过最大负载。为了减小称量误差，在作同一实验时，应使用同一台天平和配套的砝码，并注意相同面值的两个砝码的区别，确定其中一个是优先使用的。 4．天平的各部件尽可能不要用手接触，如必须接触时(调节调平螺丝)，必须将手指擦干净，最好是带手套或手指套。

5．称量的数据应及时写在笔记本上，不得记录在纸片上。

6．称量完毕，取出物体，检查天平内外清洁，关好天平门，将指数盘拨回零位，切断电源，最后，罩上天平罩。

六、思 考 题

1．为什么不允许在开启天平的状态下增减砝码或取放称量物？ 2．什么是天平的零点和停点？

实验2 滴定分析器皿及其使用

一.预习。学习如何为酸式滴定管的旋塞涂抹凡士林和试漏；学习如何为碱式滴定管排气泡和试漏。学习如何用所配的溶液润洗滴定管和移液管，如何调零和读数。

二．实验目的要求

1．滴定操作是容量分析的重要基本功之一。要求掌握临近终点时，加入半滴滴定剂即可使指示剂改变颜色，到达终点。

2．逐个检查学生的预习报告和迟到情况。 三．本次实验的内容：

1．总结上一次实验的情况（包括纪律、卫生等）。再次强调天平的操作规程和操作中出现的问题。

2．介绍化学试剂级别和中英文缩写名。 3．提问式演示讲解滴定分析操作的下列环节： （1）配制0．1mol/L NaOH和0．1mol/L HCl溶液。

告诫：永远是将相对较浓的NaOH和 HCl溶液倒入水中，尤其不能将水倒入酸中！ NaOH和 HCl溶液稀释后一定要摇匀；试剂瓶磨口处不能沾有浓溶液！

（2）演示如何用所配的溶液倒入、润洗滴定管和移液管的方法（不允许学生通过烧杯二次转移倒入）；如何调零和读数（要读准0。01ml的方法）。每次润洗滴定管的溶液体积应在10mL 左右。

（3）滴定姿势要站正。

（4）左手五个手指掌握酸式滴定管、碱式滴定管的方法。 （5）摇瓶操作和边滴边摇操作。 （6）酸、碱管气泡排除的方法。

（7）滴定速度的控制和“见滴成线”的滴定方法。 （8）半滴的控制和吹洗的方法。

（9）终点颜色变化的观察，主要对甲基橙的“红—橙—黄” 颜色要很清楚的能够区别。 （10）交待用移液管移取溶液的操作，润洗移液管的溶液，每次为3mL左右。移液管取放溶液时，注意尖部紧贴盛放溶液的器皿壁，且呈一定角度。溶液放完后，等候15秒方可取

出移液管。若用滤纸片擦去移液管外壁的溶液，则必须先擦，再调零。

（11）要求每位学生独立完成0．1mol/L HC1溶液的配制（根据稀释前后物质的量相等的原则：C1V1=C2V2）；0．1mol/L NaOH溶液的配制（按公式m=CVM计算应取的NaOH质量）。并用酸滴碱或碱滴酸各做三份。

（12）滴定过程中，注意逐个检查滴定操作的掌握情况，有无错误操作、滴定记录中有效数字的表达以及相对标准偏差的计算等。

（13）实验完成后，教师应全面检查实验室卫生，包括窗台、实验台、清扫擦洗地面，检查开关、水、电、门窗是否关好。分析天平应逐台检查，毛刷、手套、记录本有无丢失，应对实验室安全进行检查。最后须经老师允许后方能离开。

滴定操作是容量分析的重要基本功之一。要求同学们利用一切可能的机会练习滴定操作。 （14）按要求正确填写滴定记录表格。

实验3 容量仪器的校准

一．预习相关资料。 二．实验目的要求

学习了解实验仪器校准的意义、容量仪器校准的方法，初步掌握滴定管的校准、容量瓶的校准及移液管和容量瓶的相对校准。

三．本次实验的内容：

1．本次实验因时间关系，只对25mL 移液管做绝对校准以及25mL 移液管与100m量瓶之间的相对校准（不必做标记）。

2．提醒学生首先检查100mL 容量瓶是否干燥，否则用4－5ml乙醇润洗后，晾干。 3．称量校准时应使用万分之一分析天平，可连续称量两次25mL。注意磨口处如不 慎沾水，一定要用滤纸擦干，且根据具体情况考虑是否重新移取溶液。

问题：具塞磨口锥形瓶是否要干燥？为什么具塞磨口锥形瓶必须盖盖儿，才能称量？在移液管的校准中，需要测量水温。这一过程是在实验室进行，还是在天平室进行？

注：通常实验1.2 与实验1.3节合为一个实验。滴定练习的“体积比”数据通过后，进行玻璃仪器的校准。请教师安排好时间。

提示：从此次实验开始，每次实验结束前，将称量瓶和100mL烧杯及表皿洗干净、晾干（称量瓶开盖放在培养皿中晾干），为下次实验做准备。

实验4 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液的配制与标定

一、实验目的

1．学会配制标准溶液和基准物质标定标准溶液浓度的方法。

2．基本掌握滴定操作和滴定终点的判断。

二、实验原理

氢氧化钠容易吸收空气中的CO2而使配得的溶液中含有少量碳酸钠，经过标

定的含碳酸盐的标准碱溶液用来测定酸含量时，若使用与标定时相同的指示剂，则对测量结果无影响；若标定与测定不是用相同的指示剂，则将发生一定的误差。因此，应配制不含碳酸盐的标准碱溶液进行滴定。

配制不含碳酸钠的标准氢氧化钠溶液的方法很多，最常见的是用氢氧化钠饱和水溶液（120：100）配制。碳酸钠在饱和氢氧化钠溶液中不溶解，待碳酸钠沉淀后，量取上层澄清液，再稀释至所需浓度，即得到不含碳酸钠的氢氧化钠溶液。

饱和氢氧化钠溶液含量约为52%（g/g），比重约为1.56。用来配制氢氧化钠溶液的水应加热煮沸，放冷除取其中的CO2。

标定碱溶液用的基准物质很多，如：草酸、苯甲酸、氨基磺酸、邻苯二甲酸氢钾等，目前常用的是邻苯二甲酸氢钾，其滴定反应如下：

COOHCOOK+COONaNaOHCOOK+H2 O

计量点时由于弱酸盐的水解，溶液呈微碱性，应用酚酞为指示剂。

三、试 剂

氢氧化钠：A.R.或C.P.；邻苯二甲酸氢钾：基准试剂，于105～110℃干燥至恒重；

酚酞指示剂：1%

四、实验内容

(一) 氢氧化钠溶液的配制 量取氢氧化钠饱和溶液5.6ml，加新煮沸过的冷蒸馏水至1000ml，摇匀，即得0.1M氢氧化钠溶液。

(二) 0.1M氢氧化钠溶液的标定 精密称取干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾4.5～5.0g，置小烧杯中溶解后定量转移至250ml容量瓶，稀释至刻度。精密量取25ml溶液，置250ml容量瓶中，加25ml水，酚酞1滴，用0.1M氢氧化钠溶液滴定至溶液呈淡粉红色保持30s不褪即为终点。记录所耗用的氢氧化钠溶液的体积，作三次平行测定。

c邻?W邻?1000M邻?250.0 M邻=204.2

c氢氧化钠?c邻?V邻V氢氧化钠

五、思考题

1．本实验中，氢氧化钠和邻苯二甲酸氢钾两种标准溶液的配制方法有何不同？为什么？

2．本实验中哪些数据需要精确测定？各用什么仪器？

实验5 草酸含量测定

一、实验目的

1．掌握用中和法测定草酸含量的原理和操作。

2．掌握指示剂的滴定终点。

二、实验原理

草酸是无色透明的白色粉末，由水中结晶获得的试剂含2分子结晶水。草酸易溶于水，

在水中可解离出H，其离解常数为Ka1=5.4×10,Ka2=5.4×10,因此，可用标准碱溶液直接滴定。由于Ka1 和Ka2比较接近，引而并不出现两个突跃而被一次滴定。

+

－2

－5

H2C2O4+NaOHNa2C2O4+H 2O

计量点时由于弱酸盐的水解，溶液呈微碱性，应用酚酞为指示剂。

三、试 剂

0.1mol/L NaOH标准溶液 0.2%酚酞乙醇溶液 四、实验内容

精密称取草酸样品0.15g，置于250mL锥形瓶中，加50mL水使完全溶解，加酚酞指示

液3滴，用0.1mol/L的NaOH标准溶液滴定至溶液呈淡粉红色，经振荡不再消失即为终点。作三次平行测定。 五、思考题

1．为什么草酸可用NaOH直接滴定？

2．操作步骤中，每份样品中约0.15g是怎样求得的？

实验6 混合酸（碱）测定方法的设计

实验设计是一项带创造性的工作，需以有关的基础理论知识为指导，并再通过实验来

验证理论。实验方案的设计，为今后开展科学研究和从事实际工作打下良好的基础。 在设计实验时，可能会遇到许多问题，其中有些问题是可以通过查阅文献资料解决的，

有些则需要在实践中探索。我们介绍的混合酸（碱）测定方法的设计，为学生独立地完成混合物分析的实验设计提供了一些思路。

一、摘 要

给出了若干种混合酸（碱）体系，让学生选择其中一种，进行滴定分析。要求学生自己独立完成从设计分析方案，到通过实际测定给出定量分析结果的全过程。

二、讨 论

在实际工作中，常常会遇到混合酸（碱）体系的测定问题。如何才能设计出一个既准确又简便的分析方案来呢？

例如，要用滴定分析的方法，测定磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合体系中各组分的含量，涉及分析方案时要如何入手？要考虑些什么问题呢？

首先，必须判断各组分能否用酸（或碱）标准溶液进行滴定。根据磷酸的离解平衡，查出三级离解平衡酸（或碱）常数（pKa1=2.12 ，pKa2=7.20，pKa3=12.36；pKb1=1.64 ，pKb2=6.80，pKb3=11.88）。应用弱酸、弱碱能否被准确滴定的判式：cK≥10判断。显然，磷酸二氢钠可用氢氧化钠标准溶液直接滴定到HPO4。而HPO4继续用氢氧化钠滴定则不可能，但是可用盐酸标准溶液来直接滴定它；也可以先加入适量氯化钙固体，定量置换出氢离子，再用氢氧化钠标准溶液滴定：

2Na 2HPO4 + 3CaCl 2=== Ca3(PO4) 2↓+ 4NaCl + 2HCl

如果要采用直接滴定的方式，滴定的方法也不是唯一的。例如，可用上述方法，在同一份试液中分别用NaOH和HCl标准溶液进行两次滴定；也可以取两分等量的试液，分别用NaOH和HCl标准溶液进行滴定。

至于指示剂，一般是根据滴定反应达计量点时产物溶液的pH值来选择的。如果等量点时产物为HPO4，其溶液的pH=9.7，则可选用酚酞（变色范围为pH=8.2～10.0）或百里酚酞（变色范围为pH=9.4～10.6）为指示剂；当产物为H2PO4时，其溶液的pH=4.7，则可选用甲基红（变色范围为pH=4.2～6.2）或溴甲酚绿（变色范围为pH=3.8～5.4）为指示剂。

总之，设计混合酸（碱）组分的测定方法时，应本着求实的精神，去比较、研究实验中的问题。例如，所选用的方法有什么优点？滴定的误差是多少？哪种指示剂较好？等等。下面给出设计时主要应考虑的几个问题： 1） 各组分能否被准确滴定？

2） 设计方法的原理是什么？可用哪几种方法进行测定？ 3） 采用什么滴定剂？如何配制和标定？

-2－

2-2--8

4） 等量点时产物是什么？这时溶液的pH值是多少？可供选择的指示剂有哪些？哪种最

好？

5） 滴定终点一般采用指示剂法检测。不过在滴定较弱的酸（碱）组分时，用电位法指示滴

定终点则较为准确。理论证明，当两组分终点的?pH≤3时，用电位法指示终点尤为重要，例如对HAc—NaHSO4体系滴定终点的测定。

6） 酸碱滴定中，滴定剂和被滴物质的浓度一般设计为0.1mol/L，据此可确定各有关组分的

取用量。

7） 被测组分和标准物质之间的计量关系如何表述？各组分含量的计算公式是什么？含量

以什么单位表示？计算用的有关常数是否齐备？

在酸碱滴定法理论课学完后，下面体系示例可让学生选择进行设计，并测定各组分含量：磷酸氢二钾--磷酸二氢钾混合液；硫酸--磷酸混合液；盐酸--氯化铵混合液（氯化铵可用甲醛强化）；氨水--氯化铵混合液；盐酸—硼酸混合液（硼酸可用甘油或甘露醇强化）；氢氧化钠--磷酸钠混合液；醋酸--硫酸混合液；混合碱固体试样。

本实验要求学生按给定的酸（碱）混合样先自行查阅有关资料，并设计好实验程序，经实验指导老师审阅后再进行实验。

一、实验设计的主要内容

1） 实验原理。应将方法、原理和有关计算公式详细写出。 2） 实验用品。

3） 实验步骤。包括溶液的标定和各组分含量测定的步骤。

4） 实验结果。包括测得的数据及数据处理结果（分析结果和偏差）的表格。 5） 问题讨论。包括分析误差和总结心得体会等。

二、问题与讨论

1） 对于有色溶液的酸碱滴定，应选用何种方法指示等量点？

2） 对磷酸氢二钾--磷酸二氢钾混合体系，可看作是混合碱，又可看作混合酸，还可看作是

酸、碱混合物，为什么？

实验7 0.05mol/LEDTA标准溶液的配制与标定

一、实验目的

1．掌握EDTA标准溶液配制和标定的方法；

2．了解金属指示剂变色原理及使用注意事项。

二、实验原理

EDTA标准溶液常用乙二酸四乙酸二钠(EDTA－2Na·2H2O)配制。EDTA－2Na·2H2O为白

色结晶粉末，因不易制得纯品，标准溶液常用间接法配制，以ZnO为基准物质标定其浓度。滴定条件：pH＝10，以铬黑T为指示剂，终点由紫红色变为纯蓝色。滴定过程中的反应为： 滴定前： Zn 终点时：

2++HIn2?ZnHIn2?+2?H+

2?ZnHIn+H2YZnY+HIn+H+

纯蓝色

三、试 剂

EDTA－2Na·2H2O ：A.R.

ZnO：基准试剂

铬黑T指示剂：铬黑T 0.1g与研细的NaCl 10g混匀

氨－氯化铵缓冲溶液(pH＝10)：取20gNH4Cl溶于少量水中，加入100mL浓氨水，用水稀释至1000mL。

氨试液：取浓氨水400mL，加水使成1000mL。

四、实验内容

(一) 0.05mol/LEDTA溶液的配制 取EDTA－2Na·2H2O9.5g，加100mL蒸馏水温热使溶

液，稀释至500mL，摇匀，贮存于聚乙烯瓶中。

(二) 0.05mol/LEDTA溶液的标定 精密称取已在800℃灼烧至恒重的基准ZnO约0.12g，加稀HCl3mL使之溶解，加蒸馏水25mL，甲基红指示剂的乙醇溶液溶液(0.025→100)1滴，滴加氨试液至溶液呈微黄色。再加蒸馏水25mL，氨－氯化铵缓冲溶液10mL，铬黑T指示剂适量，用EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色即为滴定终点。作三次平行测定。

五、注意事项

1．甲基红的乙醇溶液只需加1滴，如多加了几滴，在滴加氨试液后溶液呈较深的黄色，

致使终点颜色发绿。

2．滴加氨试液至溶液呈微黄色，应边加边摇，若出现Zn(OH)2↓。遇此情况，可用稀HCl调回，使沉淀溶解。

3．配位反应为分子反应，反应速度不如离子反应快，近终点时，滴定速度不宜太快。

六、思考题

1．酸度对配位反应有何影响？为什么要加氨－氯化铵缓冲溶液？

2．选择金属指示剂的原则是什么？

实验8 水硬度的测定

一、实验目的

1．了解配位滴定法测定水硬度的原理和方法。

2．掌握水硬度的计算。

二、实验原理

常水中较多的钙盐和镁盐，所以称为硬水，其中钙、镁离子含量用硬度表示。水的硬度包括永久硬度和暂时硬度。在水中以碳酸氢盐存在的钙、镁盐，加热后被分解，析出沉淀而除去。这类盐形成的硬度成为暂时硬度。

Ca(HCO3)2加热CaCO3+H 2O+CO2

而钙 镁的硫酸盐或氯化物等所形成的硬度称为永久硬度。

常水用作锅炉用水，经常要进行硬度分析，测定水的总度就是测定水中钙 镁的总量。 在pH=10时，以铬黑T为指示剂，用0.01mol/L的 EDTA标准溶液直接滴定水中的Ca、Mg。

2+

2+

Ca滴定前

2+Mg终点时+HIn2+CaInMgIn2?+2?H+

MgIn+H2YMgY+HIn2?+H+

表示硬度常用两种方法：

(1) 将测得的Ca、Mg以每升溶液中含CaO的毫克数表示硬度，1mgCaO/L可写作1ppm。 (2) 将测得的Ca、Mg折算为CaO的质量。以每升水中含10mgCaO为1?(德国度)表示

2+

2+

2+

2+

硬度。

三、试 剂

0.05mol/LEDTA溶液的配制：精密移取0.05mol/LEDTA标准溶液20mL，稀释至100mL

容量瓶中，摇匀。

铬黑T指示剂 氨－氯化铵缓冲溶液

四、实验内容

量取水样100mL于锥形瓶中，加氨－氯化铵缓冲溶液5mL，铬黑T指示剂少许(约0.1g)，

用0.01mol/LEDTA标准溶液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，即为终点。作为三次平行测定。

五、注意事项

滴定时，因反应速度较慢，在接近终点时，标准溶液慢慢加入，并充分摇动。 六、思考题

1．什么叫水的硬度？硬度有哪几种表示方法？

2．为什么测定水的硬度时，要用0.01mol/L的EDTA溶液？

实验9硫代硫酸钠标准溶液的配制与标定、 碘标准溶液的配制与标定和维生素C片的含量测定

一、实验目的： ① 掌握直接碘量法测定维生素C的原理和方法；② 掌握Na2S2O3

标准溶液的配制和标定方法；③掌握I2标准溶液的配制和标定方法④熟悉淀粉指示剂的应用和终点判断。

二、内容提要：在酸性条件下，维生素C被碘氧化。一分子的维生素C与一分

子的I2相当，一个I2分子得到两个电子，所以一个维生素C相当于失去两个电子。用基准物质重铬酸钾标定硫代硫酸钠，用标定的硫代硫酸钠标定碘。以此测定维生素C的含量。

三、实验关键：① 注意防止I2挥发损失和I— 被空气氧化；② 控制滴定速度，

把握加入淀粉指示剂的时间。

四、思考题：

① 标定碘溶液时可以用硫代硫酸钠，标定硫代硫酸钠溶液时是否可以用碘液，指示剂应何时加入？为什么？

② 测定维生素C含量时，维生素C本身就是一个酸，为什么测定时还要加酸？ ③ 配制碘液时为什么要加KI和少量的水充分搅拌？

请认真阅读实验教材的预备知识 、测定原理和实验步骤，作好预习报告。

实验10 0.02mol/LKMnO4标准溶液的配制与标定

一、实验目的

1．掌握KMnO4标准溶液的配制方法和保存方法。

2．掌握用Na2C2O4标定KMnO4标准溶液浓度的方法和注意事项。

二、实验原理

KMnO4是一强氧化剂，在酸性溶液中半电池反应为：

MnO4?8H+?5eMn2+?4H 2O

通常滴定溶液的酸度要保持在1～2mol/L。

市售KMnO4中常含少量MnO2杂质，在配成溶液后，有MnO2混在里面起催化剂作用，使KMnO4逐渐分解，所以必须过滤除去。配制溶液的水，也不应含有有机还原剂。

光照促使KMnO4逐渐分解。在空气中KMnO4容易还原，故配好的溶液应放在棕色玻璃瓶中，密闭保存。

Na2C2O4与KMnO4反应方程式为：

2?+?5MnO4C2O4?16H2Mn2+?10CO2?8H 2O

由于Na2C2O4与KMnO4的反应较慢，开始滴定时加入的KMnO4不会立即褪色，但一经反应生成Mn后，Mn对反应有催化作用，反应速度加快，在滴定时加热溶液也可以加快反应速度。

2＋

2＋

三、试 剂

KMnO4：AR

Na2C2O4：基准试剂 浓硫酸

四、实验内容

(一) 0.02mol/LKMnO4标准溶液的配制 称取KMnO41.6～1.9g，溶于500mL新煮沸并放冷的蒸馏水中，混匀，置于棕色玻璃瓶中，于暗处放置7～10天，用玻璃垂熔漏斗过滤，存于另一棕色玻璃瓶中，密塞。

(二) 0.02mol/LKMnO4标准溶液的标定 精密称取于105℃干燥至恒重的Na2C2O4基准试剂0.18～0.2g，置于锥形瓶中，加新蒸馏水100mL、浓H2SO43～5mL，搅拌使溶解。迅速自滴定

管中加入0.02mol/LKMnO4标准溶液20mL待褪色后，加热至65℃继续滴定至溶液呈淡粉红色并保持30s不褪即为滴定终点。平行测定三次。

五、注意事项

1．当滴定完成时，溶液的温度不低于55℃。

2．加热可以使反应速度加快，但不能加热至沸腾，否则可能引起部分H2C2O4分解。

六、思考题

1．为什么用硫酸使溶液呈酸性？能不能用盐酸或硝酸？

2．用KMnO4滴定时滴定速度应如何控制？为什么？

实验11 H2O2含量的测定

一、实验目的

1．掌握KMnO4法测定H2O2含量的方法。

2．进一步掌握KMnO4法的操作。

二、实验原理

在酸性溶液中H2O2遇到氧化性更强的KMnO4，发生如下反应：

2MnO4?5H2O2?6H+2＋

2Mn2+?5O2?8H 2O

滴定开始时反应较慢，一经反应生成Mn后，反应速度加快。

三、试剂

3%(V/V) H2O2样品溶液

1mol/L的H2SO4溶液

四、实验内容

精密量取3%(V/V) H2O2样品1mL于锥形瓶中，置于贮有20mL蒸馏水的锥形瓶中，加

1mol/L的H2SO4溶液20mL，用0.02mol/L KMnO4标准溶液滴定至溶液呈淡粉红色30s不褪，即为终点。作为三次平行测定。

五、思考题

除KMnO4法外，还有什么方法能测定H2O2含量？应注意哪些事项？

实验12 饮用水中氟含量的测定

一．实验目的和要求：

1．掌握直接电位法测定离子活度的原理与方法，学会正确使用数字式离子计。 2．测定氟离子选择电极的检测下限和实际斜率，了解氟离子选择电极的性能。

二．实验原理：

饮用水中氟含量的高低，对人体健康有一定影响，含量太低时易得龋齿病，含量高时又产生氟中毒现象，一般比较适宜的含量为0.5~1mg/ml，离子选择电极电位法测定氟含量操作简便，干扰少，不必进行预处理，故而已成为氟的常规分析方法。

氟离子选择电极是一种均相晶体膜电极，当它与甘汞参比电极组成电池：

HgHgCl2,KCl(饱和)LaF3单晶膜NaF,NaCl,AgClAg试液氟电极甘汞电极 时整个电池的电动势为：E电池= EFˉE参 (1)

甘汞电极电位在测定中保持不变，氟离子选择电极在测定中要随氟离子活度的变化而变化，加入TISAB后：

EFˉ=φ - (2.303RT/F)㏑a Fˉ （2） 将（2）代入(1)，并将常数项合并，可得：

E电池= EFˉE参 =K-(2.303RT/F)㏑a Fˉ （K为常数） （3）

由（3）可见，在一定条件下，电池电动势与试液中的氟离子活度的对数呈线性关系。氟离子选择电极可测定溶液中1~10mol/L的F。

测定氟含量时，温度、pH值、离子强度、共存离子均要影响测定的准确度。因此，需向标准溶液和待测试样中加入TISAB。其中含柠檬酸/柠檬酸钠盐离子强度以缓冲pH值于6.5。柠檬酸盐还可以消除等对F干扰。KNO3保持离子强度不变。本实验采用标准曲线法。

--6

-

三，仪器与试剂：

PXJ-2离子计、氟离子选择电极、甘汞电极、电磁搅拌器、容量瓶、移液管、吸耳球、小烧杯

氟化钠标准溶液：0.1000mol/L；TISAB：即总离子强度调节缓冲溶液（溶解58.8g柠檬酸钠和20.2g KNO3于少量水中，加水800mL，用HCl或NaOH调节pH值至6.5，稀释至1L。）；自来水样。

四、实验内容与步骤：

1. 氟离子选择电极的准备：氟离子选择电极在使用前于10mol/L的NaF溶液中浸泡活化1

—2小时，用蒸馏水清洗电极（其在蒸馏水中的电位值约-300mV）。 2. 预热仪器20分钟，置离子计于mV档，接入氟离子选择电极与参比电极。

-3

3. 标准曲线的绘制：由10mol/L标准NaF溶液配制一系列NaF标准溶液各25 mL，其中各

含12.5 mL TISAB溶液和10mol/L；10mol/L；10mol/L；10mol/L；10mol/L；10mol/L的F；将上述溶液分别倒入一个50mL的烧杯中，放入洁净的搅拌子，插入事先擦干的电极，在离子计上按由稀到浓的顺序依次测定其电位值，记下读数（每次先搅拌2分钟，再静置2分钟，待读数稳定后记录）。一测得的电位值为纵坐标，以F浓度为横坐标作标准曲线。

4. 自来水中F活度的测定：于干净的烧杯中准确移取12.5mL自来水样，加入12.5mL TISAB

溶液，在离子计上测定其电位值，重复三次。

5. 清洗电极：测定结束后，用蒸馏水清洗电极多次，收入电极盒保存。 五，数据处理：

1. 在标准曲线的线性区间，计算其斜率k,截距b,相关系数r。 2. 计算自来水中F活度的平均值x mol/L，及标准偏差。

3. 常可利用氟离子选择电极测定不含F溶液中的La、Al的浓度，试分析其原因，并导出

电极对La的电位响应公式。

实验

一、目的要求

1．掌握分光光度计的重现性、波长精度检查等性能检验方法。 2．熟悉分光光度计的使用方法。 二、实验原理

1．分光光度计的性能好坏，直接影响到测定结果的准确性，因此新购仪器及使用一定时间后，均需进行检验调整。

2．利用镨钕滤光片的特征吸收峰值检验波长精度。

3．同种厚度的吸收池，由于材料及工艺等原因，往往造成透光率的不一致，从而影响测定结果，故在使用时需加以选择配对。

三、仪器与试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计（配镨钕滤光片） 2. 试剂：K2Cr2O7

3．试液：0.02mol/L K2Cr2O7溶液。 四、实验内容与步骤

1．吸收池的配对性 同种厚度的吸收池之间，透光率误差应小于0.5﹪。检查方法如

3+

-3+

3+

-----1

-2

-3

-4

-5

-6

-3

13 分光光度计的性能检验

下：将蒸馏水分别注入厚度相同的几个吸收池中。以其中任一个吸收池的溶液做空白，在440nm波长处分别测定其它各吸收池中溶液的透光率，然后选择相差小于0.5﹪的吸收池使用。

2．重现性 仪器在同一工作条件下，用同种溶液连续测定7次，其透光率最大读数与最小读数之差（极差）应小于0.5﹪。检查方法如下：以蒸馏水的透光率为100﹪，用同一K2Cr2O7溶液连续测定7次，求出极差，如小于0.5﹪，则符合要求。

3．波长精度的检查 为了检查分光系统的质量，可用仪器自带的镨钕滤光片在529nm和808nm处测定其特征吸收峰。检查方法如下：在透光率状态下，将镨钕滤光片（吸收池盒中，蓝色）放置在吸收池架中，移入光路，将波长调至约500nm（或780nm）处，一边缓缓转动波长旋钮，一边观察数字显示器，当显示读数为最小值时，即为镨钕滤光片的吸收峰，此时读出波长值，波长值应等于529±2nm（或808±2nm），说明该仪器符合使用要求。

五、注意事项

1．仪器预热时必须打开样品室盖，因样品室盖是光闸门的开关，打开时，光闸门处于关的位置，可避免光电倍增管照光，延长光电倍增管的使用寿命。

2．如果大幅度改变测试波长时，需要等数分钟后，才能正常工作。（因波长大幅移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一移光响应平衡时间。）

3．每台仪器所配套的吸收池不能与其它仪器上的吸收池单个调换。

4．仪器使用完毕后，用随机提供的塑料套罩住，在套子内应放数袋硅胶，以免灯室受潮。反射镜发霉或玷污会影响仪器能量。

5．吸收池每次使用完毕后，应立即用蒸馏水洗净，用吸水纸揩干，存于吸收池的盒内。 6．仪器工作一月左右或搬动后，要重新进行波长精确性等方面的检查，以确保仪器的使用和测定的精确。

六、数据处理

1. 根据测得的透光率计算极差，判断仪器的重现性是否符合要求。

2. 根据测得的透光率画出吸收曲线，找出特征吸收峰，判断仪器是否符合使用要求。 七、思考题

1．同种吸收池透光度的差异对测定有何影响？

2．检查分光光度计的波长精度及重现性对测定有什么实际意义？ 3．使用紫外-可见分光光度计时，应注意哪些问题？

实验14 药物中微量铁的测定

一、目的要求

1. 掌握紫外-可见分光光度计的使用。

2．了解分光光度法测定药物及水中铁含量的操作方法及原理。 二、基本原理

铁是药物和水中常见的一种杂质，含量大时易产生特殊气味，因此对药物和饮水中的铁要进行检查和测定。亚铁离子与邻二氮菲生成稳定的橙红色配合物。应用此反应可测定铁，当铁以Fe离子形式存在于溶液中时，可预先用还原剂（盐酸羟胺或对苯二酚等）将其还原为Fe离子。显色时溶液pH值应为2～9，若酸度过高（pH＜2）显色缓慢而色浅；若酸度过低，二价铁离子易水解。最大吸收波长为508nm，ε＝11000。

三、仪器及试剂

1. 仪器：紫外-可见分光光度计 石英吸收池 量瓶：50ml、100ml 移液管：5ml 、2ml 量筒

2. 试剂与试液：学生自拟 四、实验内容与步骤 1. 标准曲线的制备。 2. 水样测定。 五、注意事项

1. 吸收池应配对校正。

2. 吸收池内外应清洁透明，如有气泡或颗粒，应重新装液。 3. 吸收池用毕应充分洗净保存，关闭仪器，检查干燥剂及防尘措施。 六、数据处理

根据测得数据计算水中铁含量。 七、思考题

1. 标准曲线和标准对照法分别适用于何种情况？

2. 显色反应操作中，加入的各标准溶液与样品液的含酸量不同，对显色反应有无影响？

2＋

3＋

实验15 吸收曲线的测绘及吸收系数的测定

一、目的要求

1．掌握测定及绘制药物吸收曲线的方法。 2．了解吸收系数的测定。 二、实验原理

在紫外-可见光区，物质对光的吸收主要是分子中电子能级跃迁所致，同时伴随着分子的转动和振动能级的变化，因此电子吸收光谱一般比较简单、平缓。

紫外吸收光谱能表征化合物的显色基团和显色分子母核，作为化合物的定性依据，相同的化合物其紫外吸收光谱一定相同。

实验证明，若溶剂固定不变，化合物吸收曲线所出现的λ它们的数目也一定，从而为鉴别化合物提供了有力的依据。

根据药典规定，吸收系数是指当溶液浓度为1％，液层厚度为1cm时，指定波长的吸收度。

化合物对光的选择吸收的波长以及相应的吸收系数，是该化合物的物理常数，当已知某纯化合物在一定条件下的吸收系数后，即可由上式计算出该化合物的含量。

三、仪器及试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 量瓶：100ml，10ml 吸量管：5 ml，1 ml

2． 试剂：丹皮酚、乙醇（分析纯） 3． 试液：95％乙醇 四、实验内容与步骤

取丹皮酚纯品0.1g，精密称定至100.0ml量瓶，加95％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取5.00ml于100ml量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，制成丹皮酚储备液备用。

1．吸收曲线的绘制 吸取丹皮酚储备液1.00ml于10ml量瓶内，加95％乙醇稀释至刻度。将此溶液与空白溶液（95％乙醇）分别用两个相同的吸收池盛装后，放置在仪器的比色架上，按仪器使用方法进行操作。从仪器波长范围的上限（或下限）开始，每隔10nm测量一次，在吸收峰和吸收谷处，每隔1nm测量一次，每次测量均需用空白调节100％透光率，

max

、λ

min

或λ

sh

为一定值，且

然后读取测定溶液的透光率（或吸收度），记录不同波长处的测得值。

2．吸收系数的测定 利用上述溶液，在274nm波长处测定其吸收度。 五、注意事项

1.严格按仪器的操作要求进行。

2.每调整一次波长均需用空白重新调节100％透光率。

六、数据处理

1．以波长为横坐标，以吸收度为纵坐标绘制吸收曲线。 2．按照公式E1cm?七、思考题

1．单色光不纯对于测得的吸收曲线有什么影响？

2．利用测定的百分吸收系数与药典比较，讨论产生误差的原因？

1%A，计算百分吸收系数。 C?b实验16 标准曲线法测定芦丁含量

一、目的要求

1．掌握标准曲线制备的方法。

2．掌握标准曲线法测定中药有效成分的方法。 二、实验原理

显色反应需要具备良好的重现性与灵敏性,因此必须控制反应的条件,主要是溶剂种类、试剂用量、溶液酸碱度、反应时间和显色时间等。芦丁为黄酮苷,能与Al生成黄色配合物,在NaNO2的碱性溶液中呈红色,在510nm波长处有最大吸收。据此显色反应用光度法测定芦丁, 应注意控制反应时间、显色时间以及试剂用量。

3＋

OHHOOOHOgluOrha2+

OAl

O

显色法的定量方法可采用标准曲线法。 三、仪器与试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 量瓶：100ml、50ml、10ml 移液管：10 ml 吸量管：1ml、5ml 2．试剂：

亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇（均为分析纯），芦丁 3．试液：

5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，1mol/L氢氧化钠溶液，30%乙醇溶液，0.1mg/ml芦丁对照品，芦丁样品。

四、实验内容与步骤

1．对照品溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品100mg，置100ml量瓶中，加甲醇70ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密吸取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水芦丁0.1mg）。

2．标准曲线的制备 精密量取对照品溶液（0.1mg/ml）0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置于10ml量瓶中，各加30﹪乙醇使成5.0ml，各精密加入5﹪亚硝酸钠溶液0.3ml，充分摇匀，放置6min。各精密加入10﹪硝酸铝溶液0.3ml，充分摇匀，放置6min。各加1mol/L氢氧化钠溶液4.0ml，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，放置15min，于分光光度计上，在510nm波长下测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3．样品测定 精密量取芦丁样品液（0.1mg/ml）3.0ml，置10ml量瓶中，按标准曲线制备项下自“各加30﹪乙醇使成5.0ml，??”起依法操作直至测定出样品的吸收度。

五、注意事项

1．加入各种试剂的顺序应按操作方法进行。

2．本显色反应为配位反应，反应速度较慢，故每加入一种试剂后应充分振摇，以利反应完全。

六、数据处理

1．根据测得的对照品的数据，绘制A～C标准曲线或计算回归方程。

2．根据测得的样品的数据，从标准曲线上读出或由回归方程计算出样品溶液中芦丁的

重量(mg)，按下式计算：

无水芦丁（﹪）＝七、思考题

1．试述标准曲线法的优点。 2．影响显色反应有哪些因素？

标准曲线上读出的浓度(mg/ml)?10ml?100%

取样量(ml)?样品的标示浓度（mg/ml）实验17 维生素B12注射液的定性鉴别、定量分析

一、目的要求

1．熟悉紫外分光光度计的操作方法

2．掌握定性鉴别的方法和吸收系数法的定量方法。 3．了解含量测定、标示量的百分含量及稀释度等计算方法。 二、实验原理

维生素B12是一类含钴的卟啉类化合物，具有很强的生理作用，可用于治疗恶性贫血等疾病。维生素B12不是单一的一种化合物，共有七种。通常所说的维生素B12是指其中的氰钴素，为深红色吸湿性结晶，制成注射液的标示含量有每毫升含维生素B12 50、100或500?g等规格。

维生素B12的水溶液在278±1nm、361±1nm与550±1nm三波长处有最大吸收。药典规定在361nm波长处的吸收度与550nm波长处的吸收度比值在3.15～3.45范围内为定性鉴别

1%的依据。361nm处的吸收峰干扰因素少，药典规定以361±1nm处吸收峰的百分吸收系数E1cm值（207）为测定注射液实际含量的依据。

三、仪器与试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 石英吸收池 吸量管：5ml 量瓶：10ml

2．试剂：维生素B12注射液

3．试液：100?g/ml维生素B12注射液 四、实验内容与步骤

1．维生素B12注射液供试品溶液制备 精密吸取维生素B12注射液样品（100?g/ml）3.0ml，置于10ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2．测定 将样品稀释液装入1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在361nm波长处与550nm波长处分别测定吸收度。

五、注意事项

1. 在使用紫外-可见分光光度计前，应熟悉本仪器的结构、功能和操作注意事项。 2. 吸收池的光学面，必须清洁干净，不准用手触摸，只可用擦镜纸擦拭。 六、数据处理

1. 定性鉴别 根据测得的361nm波长处的吸收度与550nm波长处的吸收度数据，计算该两波长处的吸收度比值，并与标准值3.15～3.45相比较，进行维生素B12的鉴别。

2．吸收系数法 将361nm波长处测得的吸收度A值与48.31相乘，即得样品稀释液中每毫升含维生素B12的μg数。

按照百分吸收系数的定义，每100ml含1g维生素B12的溶液（1﹪）在361nm处的吸收度应为207。即：

á1cm（361nm）＝207（100ml/g﹒cm）＝207×10(ml /μg﹒cm )

－4

%C样 ＝ A样/b﹒E11cm ＝ A样×48.31 (μg/ml)

维生素B12标示量（％）＝七、思考题

C样(?g/ml)?样品稀释倍数标示量(100?g/ml)×100％

试比较用标准曲线法及吸收系数法定量的优缺点。

实验18 双波长分光光度法测定安钠咖注射液中

咖啡因的含量

一、目的要求

1．掌握双波长分光光度法测定二元混合物中待测组分含量的原理和方法。 2．掌握选择测定波长（λ1）和参比波长（λ2）的方法。 3．掌握在单波长分光光度计上进行双波长法的测定。 二、实验原理

安钠咖注射液由无水咖啡因和苯甲酸钠组成，其紫外吸收光谱如下：

吸收光谱表明咖啡因的吸收峰在272nm处，苯甲酸钠的吸收峰在230nm处。若测定咖啡因，从光谱上可知干扰组分苯甲酸钠272nm和253nm处的吸收度相等，则

咖?苯咖?苯 △A ＝ A272?Anm253nm

咖苯咖苯＝ A272nm?A272nm?A253nm?A253nm

咖咖苯苯 ＝ A272nm?A253nm(?A272nm?A253nm) 咖咖 ＝ E272nmC咖b?E253nmC咖b

咖咖＝ (E272nm?E253nm)C咖b

＝ ?E咖C咖b

式中：ΔA：混合物在272nm和253nm波长处的吸收度之差。272nm和253nm为干扰组分苯甲酸钠的等吸收波长。

咖咖。 E272nm、E253nm为被测组分在272nm和253nm波长处的吸收系数（用标准品测得）

C咖为被测组分的浓度；b为吸收池厚度。

ΔA仅与咖啡因浓度成正比,而与苯甲酸钠浓度无关，从而测得咖啡因的浓度。 三、仪器与试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 石英吸收池 量瓶：100ml 吸量管：10ml、1ml

2．试剂：咖啡因、苯甲酸钠、安钠咖

3．试液：安钠咖注射液（每1ml 中含无水咖啡因0.12g、苯甲酸钠0.13g） 四、实验内容与步骤

1．标准贮备液的制备：精密称取咖啡因和苯甲酸钠各0.1g，分别用蒸馏水溶解，定量转移至100ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.0mg/ml的贮备液，置于冰箱中保存。

2．咖啡因标准溶液的制备：精密量取咖啡因贮备液1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

3．苯甲酸钠标准溶液的制备：精密量取苯甲酸钠贮备液1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度。

4．供试品溶液的制备：精密量取安钠咖注射液（浓度为每1ml中含无水咖啡因0.012g，苯甲酸钠0.013g）1.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。从中精密量取10.0ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

5．咖啡因和苯甲酸钠标准溶液紫外吸收光谱的测定：在紫外-可见分光光度计上，分别取咖啡因和苯甲酸钠标准溶液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在200～400nm范围内，扫描出紫外吸收光谱。

6．干扰组分等吸收波长的选择：从苯甲酸钠吸收光谱图上找出等吸收波长λ其中λ1尽量与咖啡因的最大吸收波长一致。

7．咖啡因标准溶液的△A值测定：在紫外-可见分光光度计上，取咖啡因标准溶液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在λ1和λ2处分别测其吸收度。

8．安钠咖样品液的△A值测定：在紫外-可见分光光度计上，取安钠咖样品液于1cm石英吸收池中，以蒸馏水为空白，在λ1和λ2处分别测其吸收度。

五、注意事项

1. 在使用紫外-可见分光光度计前，应熟悉本仪器的结构、功能和操作注意事项。 2.在仪器扫描过程中，不要按动任何键，不要任意打开样品室盖子。 六、数据处理

ΔA ＝?ECb

1

和λ2，

?A样?A标??EC样b?EC标b?C样C标

咖啡因标示量% ＝

C样?稀释倍数标示量?100%

咖啡因标示量%应在95%~105%之间。 七、思考题

1．为什么双波长分光光度法可以不经分离直接测定二元混合物中待测组分的含量？ 2．选择等吸收波长的原则是什么？怎样从吸收光谱图上选择等吸收波长？

实验19 导数光谱法测定安钠咖注射液中咖啡因的含量

一、目的

1．学习导数吸收光谱的绘制。

2．利用导数光谱法直接测定二元混合物中组分的含量。

二、提要

1．一阶导数光谱是?A????图谱，??一般在1～4nm之间。

2．当二元组分各自零阶光谱完全重迭时，可选择一组分的一阶导数等于0处波长作为另一组分的测定波长，因导数具加和性，故在此波长下测定混合物的导数值?A??，即为另一组分的导数值。

3．导数值与浓度成正比

??????c?L ????三、仪器与试剂

1．可见—紫外分光光度计：

2．容量瓶： 100ml 3个、250mL1个、50ml6个、500ml1个； 3．刻度吸管；10ml 3支；

4．咖啡因标准液：精密称取咖啡因标准品0.1g，置于100ml容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度，再量取此液10ml于100ml容量瓶中用水稀释至刻度；

苯甲酸钠标准液：精密称取苯甲酸钠0.1g,置于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，再精密量取此液5mI于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度；

安钠咖注射液样品：每1ml中含无水咖啡因0.12g、苯甲酸钠0.13g,药典规定均应为标示量的93～107.0%。

四、步骤

(一) 样品液的制备 精密量取安钠咖注射液2.5ml于250ml容量瓶中，加水稀释至

刻度，精密量取此液5ml于50m1容量瓶中，加水至刻度。 (二) 测 定

1．苯甲酸钠一阶导数吸收光谱的绘制：取苯甲酸钠待测液于1cm石英吸收池中，以水为空白，在250—320nm波长范围内，每隔2nm测定一次吸光度，以相邻波长 △A对波长平均值作图，得一阶导数光谱，求出?A???0对应的波长。

2．咖啡因一阶导数工作曲线的绘制：精密量取待测溶液3、4、5、6、7ml分别置于50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，以1cm石英吸收池，用水作为空白，在苯甲酸钠?A制?A?????0波长处，分别测定各溶液的导数值 ?A?c工作曲线。

??(以??＝2nm为单位)，并绘

3．样品安钠咖注射液中咖啡因测定：将上述配制的安钠咖待测液，以1cm石英吸收池用水为空白，在上述波长下测定导数值?A工作曲线上求出待测液中咖啡因的浓度。

?? (以??＝2nm为单位)，然后从

五、思 考 题

应用导数光谱进行定量测定的特点是什么?

实验20 银黄口服液中黄芩苷和绿原酸的含量测定

一、目的要求

1．掌握紫外-可见分光光度计的定量操作方法。

2．掌握银黄口服液中黄芩苷和绿原酸含量测定的基本原理和定量计算方法。 二、实验原理

本品为金银花提取物与黄芩提取物制成的口服液，规格为每支10 ml。按我国药典(2000版一部)规定，该口服液每支含金银花提取物以绿原酸计不得少于0.108g，含黄芩提取物以黄芩苷计不得少于0.216g。

三、仪器及试剂

1．仪器：紫外-可见分光光度计 量瓶：100ml 移液管：2ml，1ml 吸耳球

2． 试剂：银黄口服液 HCl（分析纯）

3． 试液：0.2mol/mlHCl溶液 四、实验内容与步骤

精密量取本品1ml置50ml量瓶中，加 0.2mol/mlHCl溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取稀释液1ml，置于50ml量瓶中，加上述HCl溶液稀释至刻度，用1.0cm的石英吸收池，在278±2nm与318±2nm波长处分别测定吸收度。

五、注意事项 1．取样要准确。

2．仪器操作时应严格按照操作规程进行。 六、数据处理

根据测得的数据计算口服液中绿原酸和黄芩苷的含量

绿绿绿原酸 E318＝515.2， E278＝222.7

黄黄黄芩苷 E318＝369.5， E278＝631.2

按下式计算供试液中绿原酸和黄芩苷的浓度（mg/100ml）

C绿＝2.599A324－1.522A276 C黄＝2.121A276－0.9169A324

七、思考题

1．银黄口服液的质量控制都可以采用哪些方法？各有何特点？ 2．欲将吸收系数作定量依据，需要哪些实验条件？

实验21 原子吸收法测定感冒冲剂中的铜

一、

目的要求

1． 学习原子吸收光谱法的基本原理。

2． 了解原子吸收光谱仪的基本结构及其使用方法。 3． 掌握以标准曲线法测定感冒冲剂中的铜元素的方法。 二、

实验原理

原子吸收光谱法是基于被测元素的基态原子在蒸气状态下对特征电磁辐射吸收进行元素定量分析的方法。当光源发射的某一特征波长的光穿过一定厚度的原子蒸气时，被测元素基态原子中的外层电子将选则性地吸收特征波长的谱线，与比色分析法一样，符合Lambert-Beer定律，即有：

A=Klc

根据这一关系可以用标准曲线法或标准加入法测定样品中某元素的含量。 三、

仪器与试剂

1． 仪器

原子吸收分光光度计（铜元素空心阴极灯，波长324.8nm，灯电流3mA，火焰为乙炔-空气）、容量瓶、吸量管、烧杯。 2． 试剂

标准铜储备液（1mg/mL）：准确称取0.5000g金属铜于100mL烧杯中，盖上表面皿，加入1mL浓硝酸溶液溶解，然后把溶液转移到500mL容量瓶中，用1%硝酸稀释到刻度，摇匀备用；

铜标准液（20ug/mL）：准确吸取2mL上述标准铜储备液于100mL容量瓶中，用1%硝酸稀释到刻度，摇匀备用；

硝酸：浓度1%～2%。 四、

实验内容与步骤

1． 标准曲线的绘制

取5个10mL的容量瓶，分别加入浓度为20ug/mL的铜标准溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL，用1%HNO3稀释至刻度，同时作试剂空白，测定各标准溶液的A值，绘制A～C标准曲线。 2． 含量测定

用试样溶液（0.5～2mL）按上述仪器工作条件分别测定A值，并同时做试剂空白，由标准曲线上查得其浓度并计算百分含量。 五、

注意事项

1． 注意乙炔流量和压力的稳定性。

2． 乙炔为易燃、易爆气体，应严格按操作步骤进行，先通空气，后给乙炔气体；结束或暂

停实验时，要先关乙炔气体，再关闭空气，避免回火。 六、

数据处理

从标准曲线上，查出待测试样的浓度C值，单位：微克。

Cu%=(C·V/m)×100%

V：待测试样溶液体积（mL）；m：称取的试样重量（mg）。 也可用线性方程法计算试样中铜离子的含量。。 七、

思考题

1． 简述原子吸收光谱法的基本原理。

2． 原子吸收光谱分析为何要用待测元素的空心阴极灯作光源？能否用氢灯或钨灯代替，为

什么？

3． 本实验的主要干扰因素及其消除措施有哪些？ 4． 标准溶液及样品溶液的酸度对吸光度有什么影响?

实验22 气相色谱的载气流速与理论塔板高度的关系

一、目的要求：

1、

深入理解气相色谱的理论方程——范递姆特方程的意义及理论塔板高度的含义；

2、

掌握气相色谱仪热导检测器的原理与操作方法。

二、实验原理：

根据塔板理论，则有：

lH??nly2l ?2t16(R)216tRy（其中H—理论塔板高度；n—理论塔板数；tR—保留时间；y—峰底宽度；l—柱长） 采用已知试样测得保留时间就可算出理论塔板高度。根据范氏方程，理论塔板高度H与线速度u之间有关系：

H=A + B/u + C*u

在不同的线速度下测得已知试样的H，就可以验证上述过程。

在一定条件下，u?F0（F0为皂膜流量计测得的平均体积流速），所以，本实验以F0代替u对H作图来定性验证范氏方程。

三、仪器与试剂：

SP-2305E型气相色谱仪、热导池检测器（TCD）、氢气钢瓶、氮气钢瓶、空气压缩机、

秒表、微量注射器、填充101白色担体载5-10%PEG-6000的?4mm x 200mm不锈钢分离柱。

乙醇，正丁醇和异戊醇混合液。

四、实验步骤：

1、

确定实验条件：柱温90℃、气化室文度20℃、检测器温度150℃、桥流130mA、载气：氢气、记录仪纸速1200mm/小时、衰减1/4—1/8。

2、

打开实验室排气扇，在教师指导下检查仪器电炉连接是否正常，气路系统有无漏气。然后打开氢气瓶的高压阀（手柄逆时针转动为开，此时低压阀须处于关闭状态），再缓缓打开低压阀（顺时针转动为开）调节压力到2—3Kg/ cm，再调节针形阀使载气流速达到测定要求。

3、

接通总电源，开启控温箱电源开关、柱温控温开关、气化室开关、检测器开关，并将柱温、气化室温度、检测器温度调到所需的值上；打开热导池控温箱电源开关，将切换开关扳到“调零”位置、池平衡开关调到中间（顺传5圈）、桥流调到最小、衰减放到1/6档；再打开记录仪开关，将记录仪纸速调到1200mm/小时，待仪器稳定后将桥流加到150mA、衰减放到1/4档进行调零，记录仪调零后，将切换开关扳到“测量”档，等基线稳定后进行实验。

4、

进样2μL，在20mL/min、40mL/min、60mL/min、80mL/min、120mL/min几种不同的流速下测异戊醇的保留时间，并用皂角流量计准确测得相应的体积流速。

一、 数据处理：

以异戊醇的保留时间计算理论塔板高度，再以H~F0作图，并对此图加以讨论。

2

实验23 气相色谱法测定醇的同系物

一、目的要求：

1.熟悉色谱分析的原理及色谱工作站的使用方法。

2.用保留时间定性；用归一化法定量；用分辩率对实验数据进行评价。 二、实验原理

基于不同物质在相同条件下对同一色谱柱的保留时间Rt可能不同赖以定性；物质的量

与色谱峰面积呈Wi～?iAi 的关系用归一化公式定量：

wi?fisAAiAf1sAA1?f2AA?...?fs2nsAn×100%

三、实验内容：

本实验以前是用气相色谱对苯、甲苯、二甲苯、乙基苯及其混合试样用TCD检测、用

记录仪采谱、用秒表计时，让学生掌握用已知物对照定性、用归一化法测定混合物组分定量的实验。据文献报导，苯、甲苯等都是易挥发有毒且能致癌的物质，而TCD检测又使被测物质直接放空，这就必然影响到实验环境和师生的健康；另外，以前所使用的“手工测量”、“剪纸称重”等实验手段，功效之低、误差之大对现代仪器分析而言已经落伍到匪夷所思的地步。

基于以上原因，测定试剂改用乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇及其混合试样，检测器改用FID。和苯、甲苯、二甲苯、乙基苯相比，乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇的刺激气味和毒副作用要小得多，改TCD为FID，又避免了这些有机物的直接放空，从而大大减少了实验师生对有机蒸气的接触，增加了实验的“绿色”成分；同时，原色谱仪升级为色谱工作站，用色谱软件进行谱图处理和定量计算，以提高实验的功效和时效。

用乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇及其混合物为测定试剂，经大量实验优化筛选，此时用HMDS : PEG-20000 = 100 : 15为固定相，分析效果良好。将填充好的长2m内径2mm的色谱柱的进口端接入色谱仪，出口端放空，在0.3Mpa的载气和200 C的柱温下老化8h。老化好的色谱柱出口端接通FID。

将计算机、打印机、软件狗、色谱数据采集单元和原有的1001型、SP—2305型色谱仪各一用相应的信号线连好，将色谱数据处理程序装入计算机，打开信号采集单元开关，等指示灯不闪烁即可运行该程序进行实验。

1、打开1001气相色谱仪电源，调节 ① 柱温：135C ②离子化室温度：135C ③ 进样器温度：135C ④ 载气压力：0.4MP ⑤氢气压力：0.1MP ⑥ 空气压力：0.15MP ⑦ 灵敏度: 10 ⑧ 衰减: 4。

2、打开“HW-色谱工作站中文版”，从“参数表”中选择信号通道：A；采集时间：60分钟； 时间计量：绝对；起始峰宽水平：3；最小峰面积：20；噪声滤出强度：3；峰宽水平增速：10。

3、用1μL的进样器分别将纯的乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇进样0.2μL，在各自所得峰区域内用右键快捷菜单中的“自动填写时间表”和“自动填写组分表”，将各组分的保留时间和校正因子添入“时间表”和“组分表”，并键入相应组分的名称作为定性依据。 4、注进混合样0.8μL，采谱。

5、定性：根据“时间表”和“组分表”，程序自动给出混合样各峰相应组分的名称。 6、定量：在“定量方法”中选“归一”、“定量根据”选“峰面积”，单击“计算器”按钮，即得如下“定量结果表”（例值）： 序号 1 乙醇 名称 保留时间 1.819 12.33 2.43 1286739 81082 14.491 浓度 校正因子 峰面积 峰高 半高峰宽 峰分离度 1.8 10o

o

o

o

2 3 4 丙醇 丁醇 异戊醇 2.755 4.432 5.958 20.49 22.32 44.86 1.85 1.69 1.59 2138960 2329144 4681673 85172 63921 91981 22.497 34.535 46.320 2.1 1.3 7、混和试样的成功分离是气相色谱法定量分析的前提和基础，衡量一对色谱峰分离的程度可用分离度：R?tR1?tR21?(Y1?Y2)2，式中tR1、tR2和Y1、Y2分别指两组分的保留时间和峰底宽

度，R=1.5时两组分完全分离，实际中R=1.0(分离度98%)即可满足要求。

四、数据处理：

定性：程序可通过对储存在“组分表”中的纯物质的信息的对比、分析，自动给出混合样中相应组分的名称，使色谱定性简单、准确。

定量：归一化法是最简便、最常使用的色谱定量方法，归一法的条件要求是被测样品中的所有组分都必须出峰，要得到某组分的含量：wi?fisAAifA?fA?...?fAA1s1A2s2Ansn× 100%，就必须

Afis知道所有组分的峰面积Ai和相应的校正因子。

五、注意事项：

1.为加强学生的参与，计时仍然可用秒表；在打印谱图之后，定性、定量可由学生自己完成。 2.工作站各设备开、关次序。

3.注射器的正确使用：小心插针/快速注入/匀速拔出/及时归位。 4.掐表与注入的同步性。 5.氢气使用安全事宜。

实验24 苯甲酸、山梨酸的酯化衍生物及高相液相色谱测定

1. 内容提要：将苯甲酸和山梨酸在酸性介质中酯化，用液相色谱分离与测定。

2. 实验目的： ① 掌握苯甲酸和山梨酸的酯化方法及条件；② 熟悉液相色谱操作条件的选择，以达到化合物的良好分离效果；③ 将有机酸的酯化化学与仪器分析紧密结合，准确测定食品中两种酸的含量。

3. 实验关键： ① 样品中胶质、色素、糖要除干净，否则严重干扰后续反应与测定；② 酯化要完全，否则影响分析结果。

4. 思考题：① 在酯化过程中为什么要加入分子筛？② 对有机酸还可采用哪些方法进行酯化？酯化条件如何？③ 除内标法外，还可用什么方法测定其含量？

实验25 荧光分析法测定邻-羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸

一.目的要求

1.掌握荧光分析法的基本原理和操作。 2.用荧光分析法进行多组分含量的测定的

二.实验原理

邻-羟基苯甲酸（亦称水杨酸）和间-羟基苯甲酸分子组成相同，均含一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具有不同的荧光性质。在pH=12的碱性溶液中，二者在310nm附近紫外光的激发下均会发射荧光；在pH=5.5的近中性溶液中，间-羟基苯甲酸不发射荧光，邻-羟基苯甲酸由于分子内形成氢键增加了分子刚性而有较强的荧光，且荧光强度与pH=12时相同。利用这一性质，可在pH=5.5测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸的含量，间-羟基苯甲酸不干扰。另取同样量的混合物溶液，测定pH=12的荧光强度，减去pH=5.5时测得的邻-羟基苯甲酸的荧光强度，即可求出间-羟基苯甲酸的含量。

三.仪器与药品

WFY-28型荧光分光光度计；10ml比色管；分度吸量管；

邻-羟基苯甲酸标准溶液：60?g/ml(水溶液)；间-羟基苯甲酸标准溶液：60?g/ml(水溶液)；NaOH水溶液：0.1mol/L；

pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液：47gNaAc和6g冰醋酸溶于水并稀释至1L即得。

四.实验步骤

1. 标准系列溶液的配制：

（1）分别移取0.40，0.80，1.20，1.60，2.00ml邻-羟基苯甲酸标准溶液于已编号的10ml比色管中，各加入1.0ml pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

（2）分别移取0.40，0.80，1.20，1.60，2.00ml间-羟基苯甲酸标准溶液于已编号的10ml比色管中，各加入1.2ml0.1mol/L的NaOH水溶液，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。

（3）取未知溶液2.0ml于10ml比色管中，其中一份加入1.0ml pH=5.5的HAc-NaAc缓冲溶液，另一份加入1.2ml0.1mol/L的NaOH水溶液，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 2．荧光激发光谱和发射光谱的测定：测定（1）中第三份溶液和（2）中第三份溶液各自的激发光谱和发射光谱，先固定发射波长为400nm，在250-350nm区间进行激发波长扫描，获

max得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长?maxex；再固定激发波长?ex，在350-500nm区间进

行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长?max此时，在激发波长?maxem。ex处和发射波长?maxem处的荧光强度应基本相同。

x

3.荧光强度测定：根据上述激发光谱和发射光谱扫描结果，确定一组波长（?em和?em），

使之对二组分都有较高的灵敏度，并在此组波长下测定前述标准系列各溶液和未知溶液的荧光强度If。

五．仪器操作步骤：

注意：1、工作曲线的测定和未知液测定时应保持仪器设置参数的一致； 2、开机时先开氙灯再开计算机；关机时先关计算机再关主机电源。

六、结果处理：

以各标准溶液的If为纵坐标，分别以邻-羟基苯甲酸或间-羟基苯甲酸的浓度为横坐标制作工作曲线。根据pH=5.5的未知液的荧光强度，可以从邻-羟基苯甲酸的工作曲线上确定邻-羟基苯甲酸在未知液中的浓度；根据pH=12时未知液的荧光强度与pH=5.5时未知液的荧光强度的差值，可从间-羟基苯甲酸的工作曲线上确定未知液中间-羟基苯甲酸的浓度。

七、思考题：

maxmaxmax1、?maxex、?em各代表什么？为什么对某种组分其?ex和?em处的荧光强度应基本相同？

2、从实验可以总结出几条影响物质荧光强度的因素？

实验26 柱色谱法测定氧化铝活度

（一）目的要求

1、掌握吸附柱色谱制备、洗脱等一般操作方法。 2、熟悉用柱色谱法测定氧化铝的活度。 （二）实验原理

1、氧化铝的吸附能力等级测定方法较常用的为Brockmann法，观察氧化铝对多种偶氮染料的吸附情况衡量氧化铝的活度。所采用的染料按吸附性递增的排列顺序为：偶氮苯（1号）﹤对甲氧基偶氮苯（2号）﹤苏丹黄（3号）﹤苏丹红（4号）﹤对氨基偶氮苯（5号）﹤对羟基偶氮苯（6号）。他们的结构和溶液颜色如下：

NNNNOCH3

偶氮苯（淡黄色） 对甲氧基偶氮苯（淡黄色）

HOH3CNNNHNN

苏丹黄（橙色） 苏丹红（紫红色）

NNNH2NN

OH

对氨基偶氮苯（黄色） 对羟基偶氮苯（黄色）

2、根据上述染料的吸附情况，可将氧化铝的活度分为五级，吸附能力越小，活度级别越高。

活度级别 I 染料位置 II III IV V 柱上层 柱下层 流出液 2 1 3 2 1 4 3 2 5 4 3 6 5 4 （三）仪器与试剂

1、色谱柱（长10cm,内径1.5cm）2根 2、带橡皮套的玻璃棒1根 3、小漏斗1个 4、10mL量筒2个 5、脱脂棉及圆形滤纸若干

6、六种染料溶液 偶氮苯、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对氨基偶氮苯、对 羟基偶氮苯各20mg，分别溶于10mL纯的无水苯中，加入适量石油醚使成50mL。

7、苯和石油醚混合液（1︰4） 8、氧化铝样品（活度待测） （四）实验内容和步骤

1、色谱柱的制备 准备2根洁净干燥的高10cm，内径1.5cm的色谱管，于管底垫一

层脱脂棉（注意不要太紧），垂直夹在滴定台上，然后把待测氧化铝通过一干燥小漏斗，仔细装入色谱管中至高达6cm处（约6g），用一带橡皮套的玻璃棒轻轻地均匀地敲打至氧化铝高度达约5cm处，然后在其表面覆盖以圆形滤纸一层即得。

2、氧化铝活度的测定

①打开活塞，于1号色谱柱中加入1、2号染料溶液各5mL（预先混匀）等溶液全部通过后，立即以干燥的苯和石油醚混合液（1︰4）淋洗色谱柱，控制流速为20～30滴/min。

②于2号色谱柱中加入2、3号染料溶液各5mL（预先混匀），进行同样的实验。 ③观察和记录各色谱柱中染料的颜色和位置，判断氧化铝的活度级别。 （五）注意事项

1、用于配制染料溶液的石油醚及苯必须是无水的（可用无水硫酸铜检查）。若市售 商品含水量太大，则需预先处理，否则影响结果的准确性。

2、脱脂棉用量要少，要平整，但不要塞得太紧，以免流速太慢。

3、色谱柱必须均匀紧密，表面应力求水平，染料溶液应小心加入地，勿使氧化铝表 面受到扰动。

4、倒入染料液时，注意先把活塞打开，以利空气排出。 5、流出液用小烧杯收集，倒入回收瓶中。 6、整个实验必须无水操作 （六）思考题

1、根据各染料的结构，说明他们的极性顺序。

2、如1号色谱管流出液为淡黄色，柱下层为淡黄色；2号色谱管流出液为无色，柱 下层为淡黄色，柱上层为橙黄色。此氧化铝活度为几级？

实验27 纸色谱法分离氨基酸

（一）目的要求

1、掌握纸色谱的操作方法。

2、熟悉纸色谱法在分离鉴定方面的应用。 （二）实验原理

氨基酸为无色化合物，利用它们与水合茚三酮显现蓝紫色（脯氨酸显黄色除外），可将

分离的的氨基酸斑点显色，其反应机理如下：

OOOHO+H2OOHOO

茚三酮 水合茚三酮

OOOH+H2NOHCHCOOHRNCH2R+H2O+CO2OOOOONCH2RNCHRNH2+RCHOOOHONH2OOHOOHO+HON+H2OOHOOHO

（蓝紫色）

（三）仪器及试剂

1、玻璃展开筒 150×300mm

2、色谱用滤纸（纸条） 98×240 mm（可用定性滤纸代替） 3、毛细管 2μL 4、喷雾瓶 50 mL 5、空压机

6、展开剂 正丁醇︰甲酸︰水（60︰12︰8）

7、氨基酸标准液 将异亮氨酸、赖氨酸和谷氨酸分别配成的0.2%的水溶液 8、茚三酮试液 0.1%的乙醇溶液。 （四）实验内容和步骤

1、点样 取纸条于下端2.5cm处，用铅笔画一水平线，在线上画出1、2、3、4号四个点，1、2、3号分别用毛细管将三种氨基酸标液个2μL点出约2 mm直径大小的扩散圆点，再在4号点上分别点上三种标液各2μL。

2、展开（上行法） 展开缸内加入展开剂适量，放置至展开剂蒸汽饱和后，再下降悬钩，使色谱纸浸入展开剂约0.5cm，记录开始展开时间。当展开剂前沿上升至15cm左右时，取出色谱纸，画出溶剂前沿，记录展开停止时间，将滤纸晾干或烘干。

3、显色 展开剂晾干活烘干后，用喷雾器在色谱纸上均匀喷上0.1%茚三酮溶液，放入100℃烘箱中烘3~5min，至出现红色斑点为止。 （五）注意事项

1、色谱纸要平整，不得玷污，点样时可在下面垫一张白纸。 2、色谱纸要挂垂直。

3、不要用钢笔和圆珠笔在色谱纸上作剂号。 （六）思考题

1、纸色谱分离氨基酸时，为什么不应使用手直接接触滤纸？ 2、影响Rf值的因素有哪些？

3、色谱展开筒和色谱纸为什么要用张开剂饱和？

实验28 薄层色谱法测定甜叶菊苷含量

(一)目的要求

1、 初步掌握薄层板的制备、点样、展开、显色等一系列操作； 2、 了解薄层色谱的一种定量方法—斑点面积定量法。 (二)实验原理

在选育、种植甜叶菊的过程中及工业上提取、纯化甜叶菊苷的生产中，需要对甜叶菊苷进行定量测定。

甜叶菊苷的分子结构为：

COGlu-GluCH3HCO2-Glu分子量 804.90 熔点 197℃—198℃

由于甜叶菊苷分子量大、熔点高，用气相色谱法测定必须先经过降解，操作麻烦。用薄层色谱法测定，设备简单，换作方便，故在国内普遍采用。

本实验采用斑点面积定量法。根据斑点面积与组分质量的对应关系 ㏒W∽A 式中W 组分质量，单位为μg

A 组分面积，单位为mm2”

以标样的logW为横坐标，A为纵坐标绘制工作曲线，由工作曲线求未知样的含苷量。 (三)仪器及试剂 1、仪器 玻璃板

注射器（或定量毛细管） 10 μL 色谱缸 2、试剂

硅胶 色谱用180一20 0目 羧甲基纤维素

标样 准确称取250 mg甜叶菊苷于25mL容量瓶中，用少量乙醇溶解后，稀释至刻度。 试样 推确称取5g甜叶菊叶子干粉，用45mL乙醇浸泡24小时，过滤于50 mL容量瓶中，用少量乙醇洗滤渣，合并洗出液，滴加乙醇至刻度。

(四)实验内容及步骤

1、配制0.6%羧甲基纤维素(CMC)水溶液 称取0．6g羧甲基纤维素于100 mL蒸馏水中，加热至沸，使羧甲基纤维素溶解。放冷，静置数天，使不溶的羧甲基纤维素沉淀，小心倾出上层清液备用。

2、制备硅胶G板 称取180一200目的色谱用硅胶G6 g，加入13mL羧甲基纤维素溶液，在研钵中研成糊状，用角匙平均分配在二块7×13cm的玻璃板上，涂匀，然后在桌面上轻敲，使表面平滑，再放在校正水平的大玻板上晾干。最后，在110℃烘箱中活化半小时，放干燥器中备用。

3、点样 取一块已制好的硅胶板，在距底边2cm处，用小号打孔器每隔1cm轻轻压一下，再小心把圆圈中的硅胶刮掉。用同一打孔器打下数片圆形小滤纸，再用微量注射器分别吸取标样6、7、8、9、10μL测定样l0μL，点在小滤纸上，待溶剂挥发干后，把滤纸转移到硅胶板的小穴中，使滤纸边缘与小穴周围的硅胶吻接(见图)，为避免滤纸自硅胶板上落下，可用羧甲基纤维素粘接。

4、展开与显色 将点样后的硅胶板小心放入装有15mL展开剂的色谱缸中，待溶剂移行约10 cm后，取出晾干，用碘蒸气显色。

5、测定斑点面积 用铅笔画出斑点的轮廓，再把斑点描在透明纸上，用标准方格纸计算斑点面积。重复(3)一(5)的操作三次，取面积平均值。

（五）结果处理

计算标样质量的对数值logW，和斑点面积A的平方根，以logW为横坐标、A的平方

图 滤纸点样示意图

根为纵坐标绘制工作曲线。

根据试样的斑点面积A，在工作曲线上查得相应的logW, 再计算成叶子中甜叶菊苷的含量。

仪器条件具备时，也可使用薄层扫描仪定量。 （六）思考题

1.薄层色谱斑点面积定量法有什么优点？

2.本实验的误差来源主要在哪里？实验过程应注意什么？

实验29 双波长薄层色谱扫描法测定甲基红含量

(一)目的要求

1、 了解双波长薄层色谱扫描仪的原理、构造、性能和操作，掌握薄层色谱扫描法定 量分析方法；

2、 熟练掌握薄层色谱制板、点样、展开等基本操作。

（二）原理

薄层色谱技术是近年发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。它已广泛应用在分离分析中，尤其适用于小量试样(几十微克到几微克，甚至0.01微克)的分离分析。多年来由于缺乏较满意的检测手段，对薄层色谱法分离后斑点的定量分析，一直未能得到准确的结果，仅能提供半定量的数据。

本实验根据试样中甲基红、甲基橙和甲基黄有不同的极性，在硅胶板上用混合展开剂展开，可将它们分开。然后采用岛津CS—9301型双波长薄层色谱扫描仪，可直接在薄层板上对甲基红斑点进行定量分析，大大提高了测量结果的准确性。 （三）仪器和试剂

1、CS系列双波长薄层色谱扫描仪简介

双波长薄层色谱扫描仪 CS系列双波长薄层色谱扫描仪（CS—9301型或CS—930型）应用了分光光度技术，直接用光密度法测定斑点浓度。由于CS系列双波长薄层色谱扫描仪配有“校正曲线线性化器”和“背景校正”的装置，因此提高了分析的精密度和推确度，消除了吸收光谱法中光密度因浓度的增加而不呈线性的不利因素。此外，CS系列薄层扫描仪与常见光密度法不同之处在于它还备有“双波长法”和“锯齿扫描法”，可消除因基线波动和斑点不规则带来的测量误差。下面对这四种特有的装置和功能分别加以说明。

双波长法 选用双波长时，试样斑点最大吸收波长定为样品波长λs，样品斑点不吸收的波长为参比波长λR。波长的选择必须适当，否则灵敏度低，校正曲线的线性关系受到破坏。采用双波长法，可消除由于薄层板厚度不均匀和薄层板轻微损伤所造成的基线噪音增大，引起基线波动，用两个不同波长的光束来补偿，可得到平滑基线，因此对很小的峰也能测量，从而弥补了单波长法的不足。

锯齿扫描法 斑点在薄层板上展开后，通常不可能总是得到形状相同、大小相等以及浓

度分布均匀的理想的圆形斑点。对于一个理想的斑点，用线性扫描即可得到满意的结果；但对一个不规则的斑点，若用线性扫描法就不能给出准确的测量结果。锯齿扫描是采用一个窄光束（1.25mm×1.25mm）对x轴方向及y轴方向进行两维扫描，在这个光束内浓度的变化是可以忽略的，于是可得到斑点浓度的准确含量。光束摆幅最大为30 mm，因此对一个有紫外吸收的斑点，虽然不易被肉眼看见，但也能准确测定其含量。

校正曲线线性化 在薄层光密度法中，由于光束被薄层板上的吸附剂所散射，致使测定的吸光度不与物质含量成正比。不论使用反射法或透射法，均出现物质的含量越高，测定的吸光度偏离线性关系越远的现象。仪器根据Kubelka—Munk的理论方程式，采用“校正曲线线性化器”，将吸光度和物质含量关系以电学方法使其线性化。来自光电倍增管的信号先被一对数放大器转换为吸光度值，然后被校正曲线线性化器程序线性化，以便正比于物质的含量，线性化后的吸光度能读出，并且它的积分值能通过模拟积分器积分。

背景补偿 采用背景补偿可以使吸收光信号在积分起始点处稳定在基线水平位置。在积分范围内光束扫过斑点两端时，可连续补偿背景至基线水平，因此在测量斑点的吸光度时，可得到正确结果。

2、仪器

CS系列双波长薄层色谱扫描仪 玻璃板 10×20cm

微量注射器（或定量毛细管） 10 μL 展开缸 3、试剂

硅胶 色谱用180一200目 羧甲基纤维素

甲基红 分析纯 0.1％ (60%乙醇液)． 甲基橙 指示剂规格 0.06% (水溶液)。 甲基黄 指示剂规格 0.06% (95%乙醇液)。

试 样 内含甲基红0.1％，甲基橙0.06%和甲基黄0.06% 无水乙醇 分析纯。

展开剂 正丁醇(无水)：乙醇(无水)：环己烷(无水)(3︰1︰4) （四）实验内容和步骤 1、点样

取一块已制好的硅胶板(10 × 20 cm)，用微量注射器(或用定量毛细管)吸取甲基橙、 甲基红、甲基黄及试样各1μL，分别点在硅胶板上，如图所示。点样间距为1—1.5cm。注意每次吸取溶液前，微量注射器均应用无水乙醇及所取溶液分别洗涤三次。

2、展开

薄层色谱需在密闭容器中进行。本实验采用倾斜上行法展开斑点。取l0 mL展开剂放入展开缸中，将已点好样的硅胶板斜插人展开槽中，盖好玻璃板，展开槽应尽量放在水平位置。约半小时左右，观察待测组分的斑点是否已与其他组分分开，一般斑点间隔2cm左右即可方便地进行测量。取出硅胶板在通风柜中将展开剂挥发至干，方可进行测定。

3、测量

在薄层扫描仪上扫描测定，样品波长λs＝510nm，参比波长λR＝690nm，测量样品和 对照品斑点吸光度积分值，并计算含量。

（五）思考题

解释甲基橙、甲基红及甲基黄在硅胶板上以正丁醇、无水乙醇和环己烷混合物为展 开剂时，各组分的位置，并说明Rf值不同的原因。

实验30 菠菜叶色素的分离

(综合性实验)

（一）目的要求

1、进一步掌握柱色谱和薄层色谱的操作。 2、熟悉用色谱法对天然产物进行分离和提取。 （二）实验原理

植物绿叶中含有多种天然色素，最常用的有胡萝卜素、叶绿素的叶黄素等，其结构为：

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/3e6p.html