小青龙汤含药血清对内皮素1诱导的气道平滑肌细胞增殖作用的影响

?５９４?中华中医药杂志（原中国医药学报）２００６年第２１卷第１０期

另外，也有一部分患者因工作生活压力大，情志不遂等原因，出现了肝火亢盛的证候，治疗时则应注意平肝泻火。因此，临床上ＣＦＳ发病的中医病机包括虚实两方面，其中以虚为主。

当然，本项目作为探索性研究，针对２３７例ＣＦＳ患者进行调查，病例数偏少必然影响了一些变量表达和证候归纳的精确性，但是笔者看到ＣＦＳ的聚类分析结果与中医临床辨证还是基本吻合的。如果考虑到聚类分析等数理统计学方法在中医证候研究中的重要性和应用前景，笔者认为类似的研究对于促进中医研究现代化具有非常积极的作用。同时，也有必要在今后的前瞻陛临床研究中对证候识别模式加以修改、补充和完善。而开展多中心、大样本的中医临床流行病学调查，是提高研究质量，确保研究结论具有实际临床意义的关键。

参考文献

［１］黄小波，李宗信，陈文强．影响青年管理人员生活质

量的多因素分析．中国临床康复，２００５，９（８）：８６—

８７

［２］黄小波，李宗信，陈文强．不同地区企业青年管理的心理健康评估．中国临床康复，２００５，９（４０）：３８—３９［３］陈文强，李宗信，黄小波，等．慢性疲劳综合征的中西医研究进展．中国中医药信息杂志，２００５，１２（７）：

１００—１０２

［４］王辛秋，王伟钢，陈燕．慢性疲劳综合征中医药研究进展．中国医药学报，２００２，１７（２）：１１７—１１９

［５］王斌，洪永峰，吴建贤，等．慢性疲劳综合征的临床特征与研究进展．中国临床康复，２００４，８（３５）：８０７８

—８０７９

［６］王天芳，张翠珍，季绍良，等．１３０例慢性疲劳综合征患者证候规律探讨．中医杂志，２００４，４５（９）：６９４

—６９６

［７］李外，常章富，高云艳．中医对慢性疲劳综合征的认识与治疗．中国中医基础医学杂志，２００４，１０（２）：６３

—６５

（收稿日期２００６年２月１５日）

小青龙汤含药血清对内皮素一１诱导的

气道平滑肌细胞增殖作用的影响

薛汉荣洪广祥程光宇付向春兰智慧王丽华林色奇

（江西中医学院呼吸病研究所，南昌３３０００６）

?论著?

摘要：目的：观察小青龙汤含药血清对内皮素．１（Ⅱ：１）诱导的气道平滑肌细胞（枷ｃ）增殖作用的影响。

方法：实验分６组，正常组（１０％正常对照组血清）、模型组（ＥＴ－１加１０％正常对照组血清）、小青龙汤高剂

量组（Ｅｒ＿１加ｌＯ％／Ｊ、青龙汤高剂量组血清）、小青龙汤中剂量（Ｅｒ－ｌ加ｌＯ％／Ｊ、青龙汤中剂量组血清）、小青龙

汤低剂量组（ＥＴ－１加１０％／Ｊ、青龙汤低剂量组血清）、地塞米松组（ＥＴ－１加１０％地塞米松组血清），每组８孔。

采用ＭＴＹ比色法检测ＡＳＭＣ２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ增殖情况。结果：与模型组比较，小青龙汤低剂量组含药血清各

期及中剂量组２４ｈ、７２ｈ对ＡＳＭＣ增殖均有显著性差异（Ｐ＜０．０５）；小青龙汤高剂量组各期、中剂量组４８ｈ及

地塞米松组各期均有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。结论：小青龙汤药物血清能有效抑制ＥＴ－１诱导的ＡＳＭＣ增

殖作用，可知抑制哮喘大鼠平滑肌增殖是小青龙汤影响哮喘大鼠气道重建的途径之一。

关键词：小青龙汤；含药血清；气道平滑肌细胞；增殖

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＩ删ｏｌｌＭｅｄｋｉｎｅ－ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＳｅｒｕｍ

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ＸｕｅＨａｎｒｏｎｇＨｏｎｇＧｕａｎｇｘｉａｎｇＣｈｅｎｇＧｕａｎｇｙｕＦｕＸｉａｎｇｃｈｕｎＬａｎＺｈｉｈｕｉＷａｎｇ“ｈｕａＬｉｎＳｅｑｉ（ＲｅｓｐｉｒａｔｉｏｎＤｉｓｅａｓｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＪｉａＩｌ班ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴＣＭ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６）

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２００６年第２１卷第１０期中华中医药杂志（原中国医药学报）

ｌｉｆｅｍｔｉｏｎａｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＴ－１．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｘｇｒｏｕｐｓｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：ｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ（１０％ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｓｅｎｌｌｎ），ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ（ＥＴ－１ａｄｄｅｄ１０％ｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｓｅｍｍ），ＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｈｉｇｈｄｏｓｅｇｒｏｕｐ（ＥＴ－１ａｄｄｅｄ１０％ＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｈｉｇｈｄｏｓｅｓｅｌ３／ｍ），ＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ（ＥＩ＇－Ｉａｄｄｅｄ１０％ＳｍａｌｌＱｉｎｒＪｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｓｅｌ＇ｔｌ／ｎ），Ｓｍａｌｌ９ｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｌｏｗｄｏｓｅｇｒｏｕｐ（Ｅｒ－１ａｄｄｅｄ１０％ＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅ－ｃｏｃｔｉｏｎｌｏｗｄｏｓｅｓｅｒｕｍ）ａｎｄＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｇｒｏｕｐ（ＥＴ－１ａｄｄｅｄ１０％Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｓｅｒｕｍ），ｅｉｇｈｔｓｌｏｔｓｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐ．ＡＳＭＣｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆ２４ｈ，４８ｈａｎｄ７２ｈｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭＴｒｃｈｒｏｍｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ＡＳＭＣｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎＳｍａｌｌＱｉｎｇｈｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｌｏｗｄｏｓｅｇｒｏｕｐｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＳｅｌＭｌｎｅａｃｈｓｔａｇｅａｎｄｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ２４ｈａｎｄ７２ｈａｌｌｈａｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）；ＳｍａｌｌＱｉｎｄｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｈｉ曲ｄｏｓｅｇｒｏｕｐｅａｃｈｓｔａｇｅ，ｍｉｄｄｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ４８ｈａｎｄＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅｇｒｏｕｐｅｖｅｒｙｓｔａｇｅａｌｌｈａｄｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜Ｏ．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｅＮｌｌｎｃａｎａｃｔｉｖｅｌｙｓｕｐｐｒｅｓｓＡＳＭＣｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＴ－１，ｔｏａｐｐｒｏｖｅｔｈａｔｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｆｌｓｔｈｍａｒａｔｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆＳｍａｌｌＱｉｎｇｌｏｎｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ－ｉｎｓａｉｒ耻ｌｓ肾ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｉｎａｓｔｈｍａｒａｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：＆ｍＵ啦珂锄ｇＤｅｃｏｃｔｉｏｎ；ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｅｒｕｍ；ａｉｒｗａｙｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ（ＡＳＭＣ）；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ

材料

１．实验动物雄性ｓＤ大鼠，３０只，体质量２００—２２０９，由南昌大学医学院动物中心提供。

２．药物小青龙汤颗粒（无糖型）购自吉林省集安益盛药业股份有限公司，批号为０４０６２４；醋酸地塞米松片购自浙江仙琚制药股份有限公司，批号为０４０３５３。

３．主要试剂ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）；胶原酶Ⅱ型（Ｃｉｂｃｏ，ＵｓＡ）；胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）；胎牛血清（杭州四季青）；多聚赖氨酸（Ｓｉｇｍａ，ｕｓＡ）；抗生素（青霉素、链霉素，国产）；Ｍ－ｒｒ（Ａｍ—ｌ℃ＳＣＯ，ＵＳＡ）；二甲基亚砜（Ａｎ３１ｆｅｓｃｏ，ＵＳＡ）；组胺（上海）；内皮素．１（ＥＴ－１）（Ｃａｙｍａｎ，ＵＳＡ）；丘．ＳＭＯｏ聊ＵＳＣⅡＡＣｌ矾免疫组化试剂盒（Ｓｉｇｍａ，

ＵＳＡ）。

４．主要仪器倒置显微镜：ＯＬＹＭＰＵＳ公司产品；显微镜：ＯＬＹＭＰＵＳ公司产品；ｃ０２培养箱：ＳＡＮＹＯ，ＭＣＶ—Ｂ１６１Ｓ；超净工作台：ＳＡＮＹＯ，ＭＣＶ—Ｂ１６１Ｓ（Ｔ）；ｃ０２培养箱：ＳＡＮＹＯ，ＭＣＯ．２０ＭＣ；离心机：上海安亭科学仪器厂，８００Ｂ；酶标仪：Ｔｈｅｒｍｏ，ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＫ３。

方法

１．小青龙汤含药血清的制备将２５只雄性ｓＤ大鼠，随机分为５组：正常对照组、小青龙汤高剂量组、小青龙汤中剂量组、小青龙汤低剂量组、地塞米松组，每组５只。给药：按体表面积折算后小青龙汤高、中、低组、地塞米松组的每日给药剂量分别为４．５９／ｋｇ、３９／ｋｇ、１．５９／ｋｇ、０．０６３ｍｇ／ｋｇ，正常对照组给予等体积蒸馏水，一日２次，连续５天。血清的制备…：末次给药１ｈ后，乙醚麻醉，无菌条件下，经腹主动脉采血，冷置１ｈ，离心（４℃，２５００ｒ／ｍｉｎ，２５ｍｉｎ），分离血清，一２０℃冰箱保存备用。所取血清分别为正常对照组血清、小青龙汤高剂量组血清、小青龙汤中剂量组血清、小青龙汤低剂量组、地塞米松组血清。

２．大鼠平滑肌细胞的培养及鉴定

２．１大鼠气管平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）的培养采用酶消化法匕ｏＪ，①原代培养：断颈法处死大鼠，７０％酒精清洗，无菌剥离气管组织置于盛有Ｄ．Ｈａｎｋ’Ｓ抗生素液容器中，用含抗生素的Ｄ．Ｈａｎｋ’ｓ洗４遍，取平滑肌组织移入盛有ＤＭＥＭ的无菌平皿中，用无菌手术剪剪成碎片，加入３０～５０倍体积的０．２％的胶原酶Ⅱ，３７℃消化１～３ｈ；然后加入０．２５％胰蛋白酶，３７℃消化５～ｌＯｍｉｎ，即得到分离的平滑肌细胞；强力吹打使组织分散，将悬液移入（刻度）离心管中，用含１０％ＦＣＳ。ＤＭＥＭ终止酶作用，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；弃上清，加入含抗生素的２０％ＦＣＳ．ＤＭＥＭ重新悬浮细胞，在显微镜下调节细胞密度为ｌＯＳ／ｍ１接种到培养瓶中，在ｃ０２培养箱中培养，每３ｄ换液一次。②传代：约７。１０天可见培养瓶中形成致密细胞层时即可传代培养。

２．２大鼠气管平滑肌细胞的鉴定①细胞形态：培养第２ｄ呈梭形，５—７ｄ后，７０％。９０％融合，可见细胞呈梭形，密集与稀疏处相互交错呈典型的“峰谷”状。②ａ．ａｃｔｉｎ免疫细胞化学染色：取第３代气管平滑肌细胞，经０．２５％胰蛋白酶消化，将细胞悬液以终浓度１×１０４／ｍｌ接种到培养皿中（预置多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片），培养４８ｈ后取出盖玻片，Ｄ—Ｈａｎｋ’Ｓ液冲洗３次，８０％丙酮固定１０ｒａｉｎ，室温晾干；按试剂盒说明完成。

３．小青龙汤含药血清的细胞毒作用

３．１大鼠气管平滑肌细胞生长曲线测定Ｈ］

中华中医药杂志（原中国医药学报）２００６年第２１卷第１０期

取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液经计数后，精确地按１×１０４个／１１１１分别接种于２４孔培养板内，每天取３孔细胞进行计数，并计算均值，共计数８ｄ，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘曲线。结果见图１。

０１２３４５６７８９

时间（ｄ）

图１ＡＳＭＣ细胞生长曲线

３．２ＭｑＴ法测定空白血清和含药血清的细胞毒作用ＨＪ设５％、１０％、１５％的空白血清和含药血清，共１５组，每组６孔，另设无细胞的空白对照孔６孔，用ＭＴｒ法检测，结果表明各浓度血清培养液对细胞生长均无毒性作用。

４．小青龙汤含药血清对ＡＳＭＣ增殖的影响

采用Ｍ１１’比色法检测ＡＳＭＣ２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ增殖情况【５“ｊ。实验分６组，正常组（１０％正常对照组血清）、模型组（ＥＴ．１加１０％正常对照组血清）、小青龙汤高剂量组（ＥＴ．１加１０％小青龙汤高剂量组血清）、小青龙汤中剂量（ＥＴ．１加１０％小青龙汤中剂量组血清）、小青龙汤低剂量组（ＥＴ．１加１０％小青龙汤低剂量组血清）、地塞米松组（ＥＴ．１加１０％地塞米松组血清），每组８孔。操作步骤：将３代大鼠气管平滑肌细胞悬液按每孔１×１０４个接种到９６孔培养板中，２００ｖａ／孑Ｌ，共铺３板，３７℃、５％ｃ０２培养箱中培养；加入含１０－９ｍｏｌ／ＬＥＴ－１的１０％各组血清的培养液（预试验证实该浓度ＥＴ－１刺激ＡＳＭＣ增殖作用最佳），每２４ｈ换液１次，分别培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后加入５ｍｇ／ｎ［１ｌ的Ｍ＇ＩＴ液（２０山／孔），继续培养４ｈ；小心吸弃孔内培养液后，加入二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）液（１５０∥孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解；酶标仪检测各孔ＯＤ值（检测波长５７０ｒｉｍ）。

５．统计学分析实验数据皆以露ａ－ｓ表示，采用单因素方差分析（Ａ＿ＮＯＶＡ），各组与模型组相比采用Ｄｕｎｎｅｔ７ｔ检验。

结果

小青龙汤含药血清对ＡＳＭＣ增殖的影响见表１。如表１所示，与模型组比较，小青龙汤低剂量组含药血清各期及中剂量组２４ｈ、７２ｈ对ＡＳＭＣ增殖均有显著性差异（Ｐ＜０．０５）；小青龙汤高剂量组各期、中剂量组４８ｈ及地塞米松组各期均有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。

表１各组培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈＡＳＭＣ

的０Ｄ值变化（ｘ±ｓ）

组别ｎ—百—｛｝—面一正常组８０．７９±０．１７—０．９４±０．１８～１．１０土０．２６一

模型组８１．４９士０．３５１．６８士０．３５１．８６士０．３７

小青龙汤高剂量组８０．９９±０．２３—１．１２士Ｏ．２７—１．２７±０．２８一小青龙汤中剂量组８１．１２±０．２６’１．２５±０．２７—１．４３士０．２７。

小青龙汤低剂量组８１．２０±０．２８。１．３７±０．２３。１．５４±０．２５’地塞米松组８Ｉ．０２±０．１９～１．１０±Ｏ．２３—１．２５４－０．２５～注：与模型组同期比较，＋Ｐ＜０．０５，一Ｐ＜０．０１。

讨论

小青龙汤具有温肺化饮，止咳平喘之功效，在临床上被广泛用于哮喘防治，疗效确切。ＥＴ－１［７ｊ是已知支气管平滑肌最强的收缩剂和强大的细胞增殖剂，笔者选用ＥＴ－１诱导体外培养的ＡＳＭＣ增殖，即在体外给细胞造哮喘模型，结果证实ＥＴ－１确能促使ＡＳＭＣ增殖，同时亦证实本方药物血清能有效抑制ＥＴ．１诱导的ＡＳＭＣ增殖作用，可知抑制哮喘大鼠平滑肌增殖是小青龙汤影响哮喘大鼠气道重建的途径之一。

参考文献

［１］刘建文．药理实验方法学——新技术与新方法．北京：化学工业出版社现代生物技术与医药科技出版中

心，２００３：２５９

［２］罗雅玲，赖文岩，徐健，等．沙丁胺醇在诱导培养人气管平滑肌细胞凋亡中的作用．中华结核和呼吸杂

志，２００１，２４（４）：２１９—２２４

［３］文思成，徐军，钟南山．反义寡核苷酸对气道平滑肌细胞内皮素转换酶及内皮素１表达的影响．中华结核

和呼吸杂志，１９９９，２２：２７９—２８２

［４］司徒镇强，吴军正．细胞培养．北京：世界图书出版社，２００４

［５］钱效森，林耀广，孙梅励，等．吸入地塞米松对哮喘豚鼠内皮素．１的影响．基础医学与临床，２０００，２０（４）：５８—６０

［６］叶人，郎玮，尹丽慧，等．扶正祛邪法抑制胃腺癌细胞增殖的实验研究．浙江中西医结合杂志，２００５，１５

（６）：３３１—３３３

［７］杨新良，周文波，富维骏．内皮素一１在肺部的作用及其研究进展．国外医学呼吸系统分册，１９９８，１８

（２）：１０４～１１１

（收稿日期２００６年３月１４日）

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