研究室细胞与分子实验操作指南1

研究室细胞与分子实验操作指南

目 录

第一章 细胞实验操作······································································································ 3 第一节 细胞培养常用耗材与设备 ·········································································· 3 第二节 无菌操作 ······································································································ 3 第三节 培养用品的清洗 ·························································································· 5 第四节 培养用品的消毒灭菌及灭菌锅的使用 ······················································ 6 第五节 常用缓冲液、胰蛋白酶消化液及培养基的配制 ······································ 8 第六节 细胞培养、换液、消化传代 ···································································· 11 第七节 细胞计数 ···································································································· 13 第八节 细胞复苏与冻存 ························································································ 15 第九节 MTT法测定细胞活力或细胞增殖 ··························································· 16 第二章 分子实验操作···································································································· 17 第一节 PCR引物设计与实验操作 ······································································· 17 第二节 WESTERN BLOT 实验操作 ·········································································· 25 第三节 FLOW CYTOMETRY实验操作 ······································································ 31

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第一章 细胞实验操作

第一节

1. 准备室中常见耗材与设备

去离子水制备器、酸缸、烘箱、高压灭菌锅、储备柜（放置干净未消毒的物品）。

容量瓶（500 ml，1L）、锥形瓶（500 ml，1L）、磁力搅拌器、pH计、电子精密天平、台式离心机、冷冻离心机、涡旋器、普通冰箱（4℃，-20℃）、超低温冰箱（-70℃）。

细胞培养瓶（25mm2，75mm2 ，175mm2）、细胞培养板（96-well，24-well，12-well，6-well）、细胞培养皿（35mm，60mm）、细胞冻存管（2ml，5ml）、离心管（10ml）、移液管（2ml，5ml，10ml）。

移液枪（2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl，5ml），枪头（10μl，200μl，1ml；颜色分别为：白，黄，蓝），eppendorf管（0.5ml、1.5ml）。

2. 细胞房中常见耗材与设备

超净工作台、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、普通冰箱（4℃，-20℃）。

酒精喷壶（装75%酒精），酒精棉（浓度为75%）、纯酒精（>95%，酒精灯使用）

细胞培养常用耗材与设备

第二节

1. 无菌室的打扫与灭菌

无菌操作

1) 定期打扫无菌室：先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰新洁尔灭擦拭。

2) 培养箱定期灭菌：用75%酒精擦拭孵箱内部（最好同时将孵箱中各隔层拆下），再用紫外灯照射。（对于含有自动灭菌程序的孵箱，先用75%酒精擦

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拭后，再启动其灭菌程序）

3) 实验前细胞房与超净台的灭菌：打开紫外灯，照射30min左右。 4) 每天实验结束后，应及时清理垃圾筒中垃圾。 2. 实验人员的无菌准备 1) 实验前应用肥皂洗手。 2) 穿好实验服，更换拖鞋。 3) 75%酒精消毒双手。 3. 操作台中的无菌操作

1) 在超净台经紫外照射灭菌后，实验人员应注意在通风条件下进行实验操作。

2) 在通风条件下，先点燃酒精灯，再用酒精棉擦拭超净台桌面（尽可能的大于自己所用台面），同时保持工作区域的宽敞。

3) 实验人员应清除无菌区与有菌区的概念。超净台虽经紫外照射除菌，但也是相对的，因此，操作时应靠近酒精灯火焰。

4) 操作时应尽量减少手臂的运动，尽可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边，以酒精灯为界，左手用的东西放在酒精灯的左边，右手用的东西放在右边。例如，一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体，则移液枪应放在右手，而枪头与试剂瓶都应放在左手边。 5) 带入操作台中的物品，应注意：刚经高压灭菌的可以直接放入超净台中；临时带进来的，应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台，这类物品包括各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等。

6) 要养成用镊子操作的习惯：拿取饭盒中的各类物品，尽可能用镊子去夹取；对于小的物品，如瓶盖、枪头、eppendorf管，应避免用手直接去拿取。 7) 打开的瓶子，应放在酒精灯火焰旁，瓶盖反放朝上。禁止在打开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作（包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西）。

8) 实验结束后，依次将个人物品带出超净台（包括废液缸），用酒精棉擦拭桌面，熄灭酒精灯，最后调小风力并关掉日光灯。

9) 废液的处理：先将废液缸中的液体倒入下水道，再将废液缸中其他东西倒

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入垃圾篓中（尽可能避免将大量废液倒入垃圾篓中）。 4. 其他注意事项

1) 保持试剂瓶与桌面成约45℃时打开盖子或移取液体：这样可以尽量减少空气的污染以及在移液时产生最少的气溶胶。

2) 在打开试剂瓶、拿取瓶盖、镊子及玻璃移液管等时都要用火烧下：灼烧不是为了灭菌，只需在火焰上燎1~3秒即可。灼烧一下瓶口和移液管等，使颗粒固定在表面和制造一个向上的气流，以减少掉落颗粒的数量。 3) 定期检查CO2钢瓶的压力。

4) 定期检查孵箱中水盘中的水量及是否污染（最好每周更换一次，用无菌水）

第三节

1. 玻璃器皿的清洗

1) 自来水或肥皂水刷洗。

培养用品的清洗

2) 烘干，泡酸：烤箱中烘干，浸入洗液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸

馏水1000ml）中，浸泡12小时，然后从酸缸里捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

3) 烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装，待用。 2. 橡胶与塑料制品的清洗

橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序。

1) 针式滤器帽不能泡酸液：用NaOH泡6-12小时，或者煮沸20分钟（指

新的滤器）。用过的滤器，每次用完后及时用自来水、蒸馏水、双蒸水冲洗干净，晾干就可。

2) 新胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸

水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压灭菌。 3) .塑料培养瓶，培养板及胶头：用洗涤剂洗干净后，用自来水，蒸馏水，

三蒸水洗净，凉干。75％酒精浸泡过夜，超净台中吹干，紫外照射后使用即可。

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