利用ITS序列鉴定真菌 - 图文
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实 验 论 文
题 目: 利用ITS序列鉴定真菌 学 院: 生物科学与工程学院 专 业: 生物技术 班 级: 082 姓 名: 李晓飞 李 妍 吾木尔古丽
张瑞莉 陈 波 艾克拜尔
指导老师: 刘建利
完成日期:2011年5月18日——2011年6月5日
分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌
利用ITS序列鉴定真菌
李晓飞 李 妍 吾木尔古丽 张瑞莉 艾克拜尔 陈 波
(北方民族大学 生物科学与工程学院 银川 750021)
摘要:采用实验室提供的两株酵母菌,活化培养后,经基因组DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测,以ITS1和ITS2为引物构成的PCR反应体系对目的DNA片段(ITS1区)进行扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测后送至测序公司测序,所测序列经Genbank比对后,两株菌分别为掷孢酵母属TY-241菌株(Sporobolomyces sp)和假丝酵母ST-50菌株(Candida sp)。 关键词:ITS序列 酵母菌 PCR 菌种鉴定
1 材料与方法
1.1试验材料与试剂
实验室提供的红色掷孢酵母菌[1]和白色产香酵母菌。
YEPD液体培养基[2]配方:酵母浸粉10g,葡萄糖20g,蛋白胨20g,配成1L溶液,分装100/250ml,121℃灭菌15min。
裂解液[3]:1L裂解液中需加Tris1.2114g,EDTA8.767g,SDS5g,用1M的NaOH调至8.0,121℃灭菌30min备用。
醋酸钾溶液:1L溶液中含醋酸钾245.35g。 氯仿-异戊醇(24:1):现配现用。 70%乙醇:用95%乙醇配制,现配现用。
10×TAE溶液:1L溶液中含Tris1.2114g,EDTA29.22g,用HCl调pH至8.0。 1%琼脂糖凝胶:取1g琼脂糖溶于100ml1×TAE溶液中,微波炉加热至沸腾三次。 1.2主要仪器与设备
表一 实验中使用的主要仪器
仪器名称
立式自控高压蒸汽灭菌器 数显恒温水浴锅 电泳仪 制冰机 生物安全柜 电冰箱
Sigma高速离心机 电子精密天平 酸度计
电子可调电炉 双层恒温振荡器 紫外分析仪
型号
LDZX-40SSI HH-4 DYY-12
AF200PSC50R HFsafe 1200/C BCD-219D 3K30 HR-200 DELTA302 101RF-3 THZ-9511K WD-9403C
产地
上海申安医疗器械厂 国华电器有限公司 北京市六一仪器厂 ΜSA
上海力申科学仪器有限公司 青岛海尔股份有限公司 Germany
上海精科天平 上海
天津市泰斯特仪器有限公司 太仓市实验设备厂 北京市六一仪器厂
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分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌
台式常温高速离心机 微量移液器 生化培养箱 基因扩增仪 电泳槽 1.3实验方法
1.3.1酵母菌的活化及培养
Centrifuge 5415D 多型号 LRH-250 Palm-Cyeler DYCZ-24A Germany Germany
上海一恒科技有限公司 Aμstralia
北京六一仪器厂
采用本实验楼4楼保藏的红色掷孢酵母菌和白色产香酵母菌[4],先将菌株接于斜面中,25℃培养24h,再转接入三角瓶中100ml/250ml,25℃培养24h,保存于4℃冰箱备用[5]。 1.3.2酵母菌基因组DNA的提取
DNA的提取按照Makimura等[6](1994)的方法进行。
⑴ 用移液器吸取1ml菌液,置于已灭菌的1.5ml的离心管内,常温下12000rpm离心1min,弃上清;
⑵加入250μl裂解液; ⑶100℃水浴15min;
⑷加入250μl 2.5M的醋酸钾后,置于冰上30min至1h;
⑸在4℃下13000rpm离心5min,上清夜移至一新1.5ml离心管内;
⑹加入500μl的氯仿-异戊醇(24:1),剧烈振荡,13000rpm,离心15min,移取上清夜至另一灭菌的1.5ml的离心管内;
⑺重复上一步,直到两相之间没有沉淀,将上清液移至另一灭菌的1.5ml的离心管内; ⑻加入500μl的冷的异丙醇,放置在-20℃静置15min; ⑼13000rpm离心15min; ⑽用1ml70%的乙醇洗涤沉淀; ⑾用1ml70%的乙醇再次洗涤沉淀; ⑿将沉淀置于室温下干燥;
⒀加入50μl已灭菌的ddH2O,在室温下溶解2h; ⒁放于-20℃冷藏备用;
1.3.3酵母菌基因组DNA的检测[7]
⑴制备琼脂糖凝胶:将10×TAE贮存液用蒸馏水稀释成1×TAE电泳缓冲液,待用,按1%称取适量琼脂糖,置于250ml锥形瓶中,加入对应量1×TAE稀释缓冲液,盖上封口膜,以减少水份蒸发,放入微波炉里加热沸腾,取出摇匀,使瓶壁上粘附的琼脂糖全部溶解,反复3次,至琼脂糖全部熔化,放置,待其稍冷却。
⑵胶板的制备:将制胶槽置于水平支持物上,选择合适厚度和齿数的样品梳,插上梳子。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液数滴,摇匀,小心地倒入制胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后,小心拨出梳子,将胶块取出,置于已加入足量1×TAE电泳缓冲液得电泳槽内。
⑶加样:取20μlDNA样品与2μl6×加样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中,在第
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分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌
一个上样孔或最后一个上样孔内加入5μl的100bpDNA ladder。
⑷电泳:接通电泳槽与电泳仪的电源,以5V/cm(约100V)电泳,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处,停止电泳。
⑸成像:戴上一次性手套,在波长为254nm的长波长紫外灯下观察胶块,DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带,用凝胶成像系统照相(本实验中仪器损坏,直接用相机拍照)。 1.3.4 ITS片段的PCR扩增及扩增产物的检测
1.3.4.1 PCR反应体系见下表,于冰浴下进行[8]。
表二 核糖体基因反应体系的组成(25μl体系)
试剂
PCR缓冲液(包含TaqDNA 聚合酶、Mg2+和dNTP) 正向引物 反向引物 模板DNA ddH2O
2.5×
10 μM 10 μM
10 ng/μl -1 μg/μl
浓 度
10 0.2 0.2 1.0 13.6
体积(μl)
1.3.4.2 根据下表的引物和PCR反应条件对目的序列进行扩[9]。
表三 核糖体基因PCR反应所用引物和反应条件 扩增片段 ITS1区
引物(5’-3’)
ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC
PCR扩增反应条件 95℃5min;(94℃45s,52℃1min,72℃30s)×30;72℃8min。
1.3.4.3 PCR扩增产物的检测,采用琼脂糖凝胶电泳系统检测同1.3.3。 1.3.5 ITS片段的测序
将PCR扩增产物邮寄至测序公司,由测序公司完成测序。 1.3.6 BLAST比对、鉴定属、种
登录NCBI主页-点击BLAST-点击Nucleotide-nucleotide BLAST在Search文本框中粘贴检测序列-点击BLAST-点击Format-得到result of BLAST。
2 结果与分析
2.1基因组DNA电泳图
图一 酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
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分子生物学实验 利用ITS序列鉴定真菌
1 1 2 2 C C C C M
如上图所示,标号“1”为红色掷孢酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图;标号“2”为白色产香酵母菌的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图;C为对照组,无任何条带;标号“M”为Mark,共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8类DNA片段,根据原图对比,本次实验只可以检测到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6类DNA片段。酵母菌的基因组DNA破损片段较小,从图中可以看到,红色掷孢酵母DNA片段小于5000bp,集中于3000bp以下;而白色产香酵母的DNA片段有大于15000bp的,集中区段为5000到1500bp。ITS1片段大小为500bp左右,故这样大小的DNA片段可以满足PCR要求。 2.2PCR产物电泳图
图二 酵母菌ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
1 1 2 2 C M
如上图所示,标号“1”为白色产香酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图;标号“2”为红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图;“C”为对照组,物任何条带;标号“M”为Mark,共有1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp等11类DNA片段,根据原图对比,本次实验只可以检测到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8类DNA片段。从图中可以看到,白色产香酵母菌和红色掷孢酵母菌的ITS1片段PCR产物大小均位于500-600bp之间,与预测结果相符,目的条带前端存在干扰小条带,可能为引物二聚体所致。
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