微生物学检验基本技术！！ - 图文

1．葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F或Hugh－Leifson，HL）

下层：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克

葡萄糖 0.2克 水 100毫升 1.6%溴甲酚紫(Bromo cresol purple)乙醇溶液0.1-0.2mL

PH=7.6 注意: 调完pH值后再加葡萄糖.

(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置30℃孵箱孵育48h以上。

(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为产碱型；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。

2.氧化酶试验

(1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。因此，本试验结果与细胞色素C的存在有关。

(2)方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂（10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液）1滴，1min内观察结果。也可将试剂滴加到菌落上进行试验。

(3)结果：阳性者立即变粉红色，5-10s内呈深紫色。无色为阴性。

(4)应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性。此外，也用于气单胞菌和假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，气单胞菌和假单胞菌属为阳性，而肠杆菌科细菌阴性。莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳性。

注意事项： ①试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。②10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。

3．克氏双糖铁或三糖铁琼脂培养基试验

双糖铁培养基

成份：

下层：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克 葡萄糖 0．2克 琼脂 0．3-0．5克 水 100毫升

将上述物质混匀调PH7．6后加1．2%酚红0．4毫升 上层：蛋白胨 1克 氯化钠 0．5克 乳糖 1克 硫代硫酸钠 0．03克 硫酸亚铁 0．02克 琼脂 1克 水 100毫升

制法：1将下层配好，分装中号试管（1毫升），塞好包扎，15磅高压灭菌半小时，使凝固后备用。

2 制上层时，先将蛋白胨水制好，加入硫酸亚铁，硫代硫酸钠，加热溶解PH8．1，再加入酚红分瓶，（每瓶300毫升，称取琼脂包扎灭菌，趁热加入乳糖隔水煮沸30分钟或112℃消毒15分钟）。

3 取已制的下层管，每管用无菌法倒入上层液约1。5毫升，边斜放置使成斜面，凝固后备用。

标准：无菌试验合格，接种大肠杆菌下层产酸产气，上层产酸。

试验过程与意义

(1)原理：克氏双糖铁(KIA)或三糖铁琼脂(TSI)培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使pH降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。

(2)方法：用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到KIA或TSI深层，距管底3~5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置35℃孵 育18~24h，观察结果。

(3)结果：常见的KIA反应有如下几种： ①斜面碱性/底层碱性：不发酵碳水化合物，系不发酵菌的特征。如铜绿假单胞菌。②斜面碱性/底层酸性：葡萄糖发酵、乳糖（和TSI中的蔗糖）不发酵，是不发酵乳糖菌的特征，如志贺菌。 ③斜面碱性/底层酸性（黑色）：葡萄糖发酵、乳糖不发酵并产生硫化氢，是产生硫化氢不发酵乳糖菌的特征。如沙门菌、亚利桑那菌、枸橼酸杆菌和变形杆菌等。 ④斜面酸性/底层酸性：葡萄糖和乳糖（和TSI中的蔗糖）发酵，是发酵乳糖的大肠菌群的特征，如大肠埃希菌、克雷伯菌属和肠杆菌属。

(4)应用：鉴别肠道杆菌用。KIA或TSI对初分离出的、可疑为革兰阴性杆菌鉴定特别有

用。其反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分，也可作为观察其他培养基反应的有价值的质控依据。

4．O/129试验

(1)原理：O/129（2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。

(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10μg/片及150μg/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育18-24h，观察结果。

(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。

(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。

5．触酶试验(H2O2)

(1)原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。

(2)方法：取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％H2O2 1滴，立即观察结果。

(3)结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。

(4)应用：大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。

注意事项：①3％H2O2溶液要新鲜配制。②不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应，③取对数生长期的细菌。

4．苯丙氨酸脱氨酶试验(phenylalanine)

(1)原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。 (2)方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。 (3)结果：有绿色出现为阳性。

(4)应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。

4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只

有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。 (3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。

柠檬酸盐

1．枸橼酸盐利用试验

(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。

(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。

(3)结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。

(4)应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。

微生物学检验基本技术

随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。 第一节 微生物形态学检查

细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。 一、显微镜检查

由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。

1．普通光学显微镜

采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。 2．暗视野显微镜

常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。 3．相差显微镜

相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。 4．荧光显微镜

荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。 5．电子显微镜

用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。

二、不染色标本检查

不染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。 1．悬滴法

在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹

玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察。 2．压滴法

用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察。 3．毛细管法

主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60~70mm长。0.5~1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。

三、染色标本检查

细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。 （一）细菌染色的一般程序

细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脱色）—（复染）。 1．涂片制备

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。 2．固定

目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。 3．染色

根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。 4．媒染

凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。 5．脱色

凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。 6．复染

已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。

（二）常用染色法（染液配方见第8章） 单染色法

只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。 2．复染色法

用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

（1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。

（2）抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。持续染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干。②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30~90s。②弃去第1液后加第2液染15min。③用第3液脱色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。 3．特殊染色法

（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸馏水1滴。③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果 鞭毛和菌体呈紫色。

（2）异染颗粒染色(阿尔培托法)：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。

（3）荚膜染色：①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。

（4）芽胞染色：染液：第一液为萋－纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min，冷却后水洗。用第二液脱色2min，水洗。加第三液复染1min，水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。 4．负染色法

背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。最常见的是墨汁负染色法，用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。 5．荧光染色法

经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。

微生物培养与分离方法

大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。 一、接种与分离方法

根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。 1．平板划线分离培养法

对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法：

（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的?）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。

（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。 琼脂斜面接种法

主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。 3．穿刺接种法

此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。 4．液体培养基接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。 5．倾注平板法

本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。 全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2 每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数 6．涂布接种法

本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表

面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。 二、细菌的培养方法

根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。 1．需氧培养

是指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养，将已接种好的平板、斜面、液体培养基等在空气中置35℃孵育箱内孵育18~24h，无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的细菌需要培养3-7d甚至1个月才能生长。为使孵育箱内保持一定的湿度，可在其内放置一杯水。对培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士林封固，以防培养基干裂。 2．二氧化碳培养

某些细菌，如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、布鲁氏菌和流感嗜血杆菌等的培养，特别是在初次分离时，须在5%~10 %二氧化碳环境中培养才能生长。常用的培养法如下。

（1）二氧化碳培养箱法：二氧化碳孵箱能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度，培养物置于孵育箱内阁，孵育一定时间后可直接观察生长结果。

（2）烛缸培养法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，将接种好的培养基放入缸内，点燃蜡烛后放在缸内稍高于培养物的位置上，缸盖或缸口均涂以凡士林，加盖密闭。因缸内蜡烛燃烧氧逐渐减少，数分钟后蜡烛自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量约占5%~10%。将缸置于35℃普通孵育箱内孵育。

（3）气袋法：选用无毒透明的塑料袋，将已接种标本的培养皿放入袋内，尽量祛除袋内空气后将开口处折叠并用弹簧夹夹紧袋口。使袋呈密闭状态，执断袋内已置的二氧化碳产气管（安瓿）产生二氧化碳，数分钟内就可达到需要的二氧化碳培养环境，置于35℃孵育箱内孵育。

（4）化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml比例，分别置容器内，连同容器置于玻璃缸内，盖紧密封，倾斜缸位使盐酸与碳酸氢钠接触而生成二氧化碳。于35℃孵育箱内孵育。 3．微需氧培养

微需氧菌培养在大气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含有5%-6% 氧气，5%-10%二氧化碳和85%氮气的气体环境中才可生长，将标本接种到培养基上，置于上述气体环境中，35℃进行培养即微需氧培养法。 4．厌氧培养

厌氧菌对氧敏感，培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。厌氧培养常用的方法有：物理法、化学法、生物法。如厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。

三、细菌在培养基上生长特性 1．固体培养基

标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。

(1)菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型： ①光滑型菌落（S型菌落）：

菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。

(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况。①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。 (4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。 2．液体培养基

细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。 3．半固体培养基

半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

细菌的生物化学试验

各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。

一、碳水化合物的代谢试验 1．糖（醇、苷）类发酵试验

（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。

(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。

(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵 不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。

表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类

单糖 四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖

双糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麦芽糖（两分子葡萄糖） 三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉

醇类 侧金盏花醇 卫茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖类 肌醇

2．葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F或Hugh－Leifson，HL）

(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。

(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。

(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为产碱型；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。

(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。

3．甲基红（MR）试验

(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。

(2)方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。

(3)结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。

(4)应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。

4．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）

(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。 (3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。 5．VP试验

(1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。(2)方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml 400g/L KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。(3)结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。 (4)应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。

6．胆汁七叶苷水解试验

（1）原理：在10%~40％胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。 (2)方法：将被检菌接种于胆汁七叶苷培养基中，35℃孵育18~24h后，观察结果。 (3)结果：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

(4)应用：主要用于鉴别D群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。D群链球菌本试验为阳性。

7．淀粉水解试验

(1)原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围出现透明区。

(2)方法：将被检菌划线接种于淀粉琼脂平板或试管中，35℃孵育18~24h，加入革兰碘液数滴，立即观察结果。

(3)结果：阳性反应，菌落周围有无色透明区，其它地方蓝色；阴性反应，培养基全部为蓝色。

(4)应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。

8．甘油复红试验

(1)原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，呈深紫红色。

(2)方法：取被检菌接种于甘油复红肉汤培养基中，于35℃孵育，观察2~8d。应同时做阴性对照。

(3)结果：紫红色为阳性，与对照管颜色相同为阴性。

(4)应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。

9．葡萄糖酸氧化试验

(1)原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成α-酮基葡萄糖酸。α-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。 (2)方法：将待检菌接种于葡萄糖酸盐培养基中(1ml)，置35℃孵育48h,加入班氏试剂1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷却，观察结果。

(3)结果：出现黄到砖红色沉淀为阳性。不变或仍为蓝色为阴性。 (4)应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。

二、氨基酸和蛋白质的代谢试验

1．硫化氢试验

(1)原理：某些细菌能分解含硫氨基酸生成硫化氢，与亚铁离子或铅离子结合形成黑色沉淀物。

(2)方法：将待检菌接种于含硫化物及亚铁离子的培养基或克氏双糖铁琼脂（KIA）中，35℃孵育18~24h，观察有无黑色沉淀出现。或用醋酸铅纸条，悬挂于KIA管中（白色滤纸，根据试管大小裁剪适当，在热的50g/L醋酸铅饱和水溶液中浸泡，然后于50~60℃烘干，121℃15min高压灭菌备用）。醋酸铅是最敏感的方法。 (3)结果：有黑色沉淀物为阳性。

(4)应用：主要用于鉴别肠杆菌科细菌，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其它菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。

2．明胶液化试验

(1)原理：细菌分泌的胞外蛋白水解酶（明胶酶）能分解明胶，使明胶失去凝固能力而液化。

(2)方法：将待检菌接种于明胶培养基中，35℃孵育24h到7d或更长时间，每24h取出放入4℃冰箱约2h后，观察有无凝固。

(3)结果：如无凝固，则表示明胶已被水解，液化试验阳性。如凝固，则继续培养。 (3)应用：奇异变形杆菌、普通变形杆菌、沙雷菌属和阴沟肠杆菌等到能液化明胶，肠杆菌科中的其它细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外，许多假单胞菌也能产生明胶酶而使明胶液化。

3．吲哚试验（靛基质试验）

(1)原理：某些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚与对二甲氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚。

(2)方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35℃孵育24~48h，加入靛基质试剂，观察结果。

(3)结果：红色为阳性，无色为阴性。

(4)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等的鉴别。

4．苯丙氨酸脱氨酶试验

(1)原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氨酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。若延长时间，会引起退色。

(2)方法：将待检菌大量接种入苯丙氨酸培养基中，35℃孵育18~24h，滴加100g/L三氯化铁试剂4~5滴，立即观察菌落生长处有无绿色出现。 (3)结果：有绿色出现为阳性。

(4)应用：变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其它细菌均为阴性。

5．氨基酸脱羧酶试验

(1)原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。

(2)方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸，鸟氨酸或精氨酸）脱羧酶试验管和1支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖至少0.5cm高度的无菌石蜡油，35℃孵育1-4d，观察结果。

(3)结果：若为溴甲酚紫指示剂，则试验管紫色为阳性，黄色为阴性，对照管应为黄色。 (4)应用：主要用于某些细菌种间的鉴别，如赖氨酸用于产气肠杆菌（阳性）与阴沟肠杆菌（阴性）；鸟氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和克雷伯菌（阴性）；精氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）等。

6．精氨酸双水解酶试验

(1)原理：精氨酸经两次水解后,生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。 方法：将待检菌接种于试验培养上，置35℃孵箱孵育1~4d，观察结果。

结果：溴甲酚紫指示剂呈紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性。黄色为阴性。 应用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属的鉴定。

7．尿素酶试验

(1)原理：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱。 (2)方法：将待检菌接种于含有尿素的培养基中，35℃孵育18~24h，观察结果。 (3)结果：红色为阳性，不变为阴性。

(4)应用：主要用于肠杆菌科变形杆菌属、普罗威登菌属、克雷伯菌属及假单胞菌属的鉴定。

8．霍乱红试验

(1)原理：霍乱弧菌分解色氨酸生成吲哚，并能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，当加入硫酸后生成亚硝酸吲哚，呈红色反应。

(2)方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，置35℃孵育24h，加入浓硫酸数滴，观察结果。 (3)结果：呈红色者为阳性。

(4)应用：霍乱弧菌呈阳性反应，但本试验并非霍乱弧菌所特有。凡能产生吲哚并还原硝酸盐为亚硝酸盐的细菌，均可呈现阳性反应。

三、碳源和氮源利用试验

1．枸橼酸盐利用试验

(1)原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，而在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。

(2)方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基上，置35℃孵育1~4d，逐日观察结果。

(3)结果：若用溴麝香草酚兰指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性；无菌落生长，培养基绿色为阴性。

(4)应用：可用此试验作细菌种属间鉴定。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常阳性，粘质和液化沙雷菌和某些变形杆菌及枸橼酸杆菌阳性。此外，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜水气单胞菌也能利用枸橼酸盐。

2．丙二酸盐利用试验

(1)原理：某些细菌能利用丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解生成碳酸钠，使培养基变碱。

(2)方法：将待检菌接种于丙二酸盐培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。 (3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。颜色无变化为阴性。

(4)应用：肠杆菌科中亚利桑那菌和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其它各菌属均为阴性。

3．醋酸钠利用试验

(1)原理：细菌利用铵盐作为唯一氮源，同时，利用醋酸盐作为唯一碳源时，可在醋酸盐培养上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培养基变为碱性。

(2)方法：将被检菌接种于醋酸盐培养基中，置35℃孵育2~7d，逐日观察结果。 (3)结果：培养基上有细菌生长，并变为蓝色为阳性。

应用：主要用于大肠埃希菌和志贺菌属的鉴别，前者为阳性，而后者为阴性。

4．马尿酸钠水解试验

(1)原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。 (2)方法：将待检菌接种于马尿酸钠培养基中，置35℃孵育48h，离心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀，经10~15min观察结果。 (3)结果：出现恒定之沉淀物为阳性。 应用：主要用于B群链球菌的鉴定。

5、乙酰胺利用试验

(1)原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱。

(2)方法：将被检菌接种于乙酰胺培养基中，置35℃孵育24~48h，观察结果。

(3)结果：培养基由绿色变为蓝色为阳性。如不生长，或稍有生长，但培养基颜色不变为阴性。

(4)应用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、去硝化产碱杆菌、食酸假单胞菌为阳性，其它非发酵菌大多数为阴性。

四、酶类试验

1.氧化酶试验

(1)原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使

血清)去检测患者标本中或培养物中的未知细菌或细菌抗原，以确定病原菌的种或型。血清学诊断是指用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染性疾病的方法。血清学试验是临床微生物学检验的重要方法之一。血清学试验基本类型包括凝集反应、沉淀反应和补体结合反应等。 一、凝集反应

颗粒性抗原（细菌、红细胞、乳胶等）与相应抗体可发生特异性结合，在一定条件下（电解质、pH、温度、抗原抗体比例适合等）出现肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。参与反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素。凝集反应可分为直接凝集反应和间接凝集反应两大类。

(一)直接凝集反应

直接凝集反应指颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现的凝集现象。 玻片凝集试验 是一种定性试验。用己知抗体(诊断血清)测未知抗原，适用于细菌的鉴定或分群（型）等。方法是取已知抗体（诊断血清）滴加在载玻片上，直接从培养基上刮取待检菌混匀于诊断血清中，数分钟后，如出现细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，即为反应阳性。自临床初分离的细菌中，有些细菌表面含有某种表面抗原(如伤寒沙门菌的Vi抗原和志贺菌属的K抗原等)，这些抗原能阻止菌体抗原(O抗原)与相应抗体发生凝集反应，从而导致错误的判定。此时应将菌悬液于100℃中隔水煮沸(Vi抗原100℃30min 、 K抗原100℃ 1h)，待细菌表面抗原破坏后，再进行试验。

凝集试验简便、快速、特异性强，常用于沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌及链球菌等的鉴定。 2．试管凝集试验

为半定量试验。用等量抗原(细菌)悬液与一系列递倍稀释的抗血清混合，37℃保温4h后放室温或4℃冰箱过夜，观察结果。根据每管内抗原的凝集程度判定血清中抗体的相对含量。以血清最高稀释度仍有明显凝集现象者，为该血清中抗体的凝集效价，以表示血清中抗体的相对含量。

本法常用于测定免疫血清的效价、抗原的凝集性能；在临床上主要用于检测受试者血清中有无某种特异性抗体及其相对含量。如诊断伤寒、副伤寒的肥达反应、诊断布氏杆菌病的瑞特反应等。 (二)间接凝集反应

是将可溶性抗原或抗体吸附于某种与免疫无关一定大小的颗粒载体表面，制成致敏载体，再与相应抗体或抗原作用，在电解质存在的适宜条件下，被动地使致敏载体凝集，称为间接（或被动）凝集反应。

可用红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等颗粒作载体，分别称间接血凝、间接乳凝、间接炭凝试验。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与少量抗体结合后，就能出现肉眼可见的反应，故可提高反应的敏感性。常用间接凝集反应来测定待检血清中细菌、病毒、螺旋体、寄生虫等抗原及自身抗体。间接凝集反应又可分为如下3种。

正向间接凝集试验

即将已知可溶性抗原吸附于载体颗粒上，然后与相应抗体结合产生颗粒凝集现象，用以检测未知抗体。 反向间接凝集试验

是将已知抗体吸附于载体颗粒表面，以检测相应可溶性抗原的凝集反应。适用于可溶性和颗粒性抗原的检出，如反向间接血凝试验检测乙型肝炎表面抗原及甲胎蛋白，协助诊

断乙型肝炎和原发性肝癌。从食品中检出肉毒毒素和葡萄球菌肠毒素等。 间接凝集抑制试验

是将已知抗体或可溶性抗原先与被测的抗原或抗体混合，然后加入有关抗原或抗体致敏的载体颗粒，如已知抗体或可溶性抗原与被测的抗原或抗体相结合，则不出现颗粒凝集现象。故也可称为正向间接凝集抑制试验或反向间接凝集抑制试验。 协同凝集试验

协同凝集反应属于间接凝集反应的一种类型。它所用的载体是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黄色葡萄球菌。 SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段结合，IgG的Fc段与SPA结合后，IgG的两个Fab 段暴露于葡萄球菌菌体的表面，并仍保持正常的抗体活性，当结合于葡萄球菌表面的已知抗体与相应细菌、病毒或毒素抗原接触时，则出现肉眼可见的凝集现象。方法简便、快速、敏感性高，易于观察结果，已广泛用于细菌的快速鉴定和分群（型），如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、布鲁氏菌、沙 门菌及志贺菌等细菌。 二、沉淀反应

可溶性抗原(如细菌的培养滤液、含细菌的患者血清、脑脊液及组织浸出液等)与相应抗体相混合，在比例适合和适量电解质的存在等条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称沉淀反应。利用沉淀反应进行血清学试验的方法称为沉淀试验。沉淀反应有环状、絮状和琼脂扩散法3种基本类型。 1．环状沉淀试验

将已知的抗血清加于内径1~3mm，长75mm的玻璃细管中约三分之一高度，然后沿管壁徐徐加入已适当稀释的待测抗原溶液，使成为分界清晰的二层，置室温或35℃5~30min后，如在两液面交界处形成肉眼可见的白色环状沉淀物为阳性反应。本试验主要用于鉴定微量抗原，如链球菌、肺炎链球菌、鼠疫耶尔森菌的鉴定及炭疽的诊断（Ascoli氏试验）。

絮状沉淀试验

指可溶性抗原与抗体在试管内以适当比例混合后，在电解质存在的条件下，出现絮状的沉淀物。有2种方法：一种是将恒定量的抗体分别与一系列稀释的抗原溶液在试管内混合，另一种是将恒定量的抗原分别与一系列稀释的抗血清在试管内混合，随后观察各管沉淀物出现的时间和量。通常在抗原与抗体比例最适管，出现沉淀物最快，量最多。本试验常用于毒素、类毒素、抗毒素的定量测定，还用于已知抗原测血清中的相应抗体，如肥达氏试验用于诊断伤寒、副伤寒等。 琼脂扩散试验

用琼脂制成固体的凝胶，使抗原和抗体在凝胶中扩散，若两者比例适当，则在相遇处形成肉眼可见的沉淀物（线或环），为阳性反应。常用的试验方法有：

(1)单向琼脂扩散试验：是将抗体预先在琼脂中混匀，制成凝胶板，凝固后在琼脂上打孔，孔中加入待试抗原，经一定时间扩散后，若抗原与抗体对应，则在孔周围比例适当处形成白色沉淀环。由于沉淀环大小与直径孔中抗原浓度成正比关系，故可事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，来测定未知标本中抗原含量。本法是一种定量试验，主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量。

(2)双向琼脂扩散试验：先制备琼脂凝胶板，待凝固后，根据需要在其上面多少个孔，孔间保持一定距离，然后将抗原和抗体分别注入小孔中，使两者相互扩散。如抗原与抗体相对应，浓度比例适当，经一定时间扩散后，在抗原抗体孔之间出现清晰的白色沉淀线。一对相应的抗原抗体只能形成一条线。因此，根据沉淀线的数目即可推测抗原液中有多少种抗原成分，根据沉淀线融合与否及交叉关系，还可鉴定两种抗原是否完全相同，还

是部分相同。本法可用于检测未知抗原或抗体、分析和鉴定抗原成分、检测抗体或抗原的纯度、滴定抗血清的效价等。缺点是需时长，敏感性差。

(3)对流免疫电泳：是一种将双向扩散和电泳技术相结合的方法。试验时按双向扩散法在琼脂板上打孔，抗原加于阴极侧的孔中，抗体加于阳极侧的孔中，然后通电，在电场与电渗作用下抗原与抗体向相对方向移动，两者相遇后即可出现沉淀线。

(4)免疫电泳：是将琼脂电泳与双向琼脂扩散相结合的方法。先将抗原在琼脂平板上进行电泳，使其中各成分因电泳迁移率不同而分离区带。尔后沿电泳方向挖一与之平行的槽，加入特异性抗体作双向琼脂扩散。各区带中抗原分别在不同位置与抗体相遇生成弧状沉淀线。可据沉淀弧的数量、位置和形状，与已知标准抗原比对，即可分析样品中的成分及其性质。免疫电泳主要用于血清蛋白的组分分析。亦用于抗原和抗体提纯物的纯度鉴定。

三、补体结合反应

是一种在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素为指示系统的抗原抗体反应。在试验时，先将定量补体（使用新鲜的豚鼠血清）加入待检系统中，使抗原抗体优先结合补体。如果待检系统中抗原与抗体相对应，加入的补体可被抗原抗体复合物所结合而固定，不再与以后加入的溶血系统起反应，不出现溶血现象，为补体结合反应阳性。如待检系统中的抗原抗体不相对应，则游离的补体与后面加入的溶血系统反应，从而出现溶血，为补体结合反应阴性。如果待检系统中抗原抗体比例不适当时，仍有部分补体游离，则此剩余的游离补体可作用于溶血系统产生不同程度的溶血现象，据此可判断阳性反应的强弱，推知抗原或抗体的效价。

本反应可用已知抗原测定未知抗体，也可用已知抗体测未知抗原。多用于检测某些病毒、立克次体和螺旋体病病人血清中的抗体。亦用于某些病毒分型试验。 四、荚膜肿胀试验 1．原理

特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀。 2．方法

取洁净载玻片一张，两侧各加待检菌1~2接种环，于一侧加抗血清，另一侧加正常兔血清各1~2接种环，混匀；再于两侧各加1％亚甲蓝(美蓝)水溶液1接种环，混匀，分别加盖玻片，置湿盒中室温放置5~10min后镜检。 结果

若试验侧在蓝色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物而对照侧无此现象，为荚膜肿胀试验阳性；试验侧与对照侧均不产生无色环状物则为荚膜肿胀试验阴性。 5．应用

常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和炭疽芽胞梭菌等检测。

五、制动试验 原理

特异性抗鞭毛血清与相应运动活泼的细菌悬液混合，则抗鞭毛抗体与鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、相互粘着而失去动力，细菌运动停止。 方法

将待检标本或增菌培养液1滴置于洁净玻片上，用显微镜观察细菌运动情况。再于待检标本上加 l滴适当稀释的特异的抗鞭毛血清，混匀，作悬滴镜检。 结果

若滴加抗血清后3~5min内，细菌运动停止，菌体凝集成块为制动试验阳性；反之，滴加抗血清后，细菌运动无改变为制动试验阴性。 应用

主要用于霍乱弧菌的快速鉴定。

第五节 分子生物学技术在微生物检验中的应用

分子生物学技术的迅速发展，拓展了微生物学检验方面的应用空间。该技术具有敏感、特异、安全和快速等特点，在微生物检验中发挥着日益重要的作用。本节简要介绍分子生物学技术在微生物检验中的应用，具体检测方法参见有关专著或试剂盒说明书。

一、分子生物学技术在细菌分类中的应用

细菌的传统分类法和数值分类法以表型特征相似性为基础，而单纯表型相似性还不能准确地确定系统发育关系。随着分子生物学及遗传学的发展，细菌分类学中发展了一系列核酸分析方法，包括DNA分子中G＋C百分含量测定、DNA-DNA杂交、16S rRNA相关度分析等。

1. DNA分子中G＋C百分含量的测定

细菌DNA G+C或A+T摩尔百分比能反映细菌间DNA分子同源程度，不同种属间

G+C mol%范围在25%~ 75%之间，但同一种细菌G+C mol%相当稳定，不受菌龄、培养条件和其他外界因素影响，亲缘关系越近的细菌，G+C mol%越相近，亲缘关系较远的细菌G＋Cmol%也不同，但G＋Cmol%相同或近似其亲缘关系不一定相近。最常用的测定方法是热变性温度法，其次是高效液相色谱法和浮力密度法。

2. DNA-DNA杂交

DNA杂交可得出DNA之间核苷酸顺序的互补程度，从而推断不同细菌基因组间的同源性。目前最常用的是复性速率法，变性DNA在溶液中复性（杂交）时，同源DNA的复性速率比异源DNA要快，同源性愈高，复性速率愈快。复性的过程也伴随着260nm紫外吸收的减少，再通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的复性速率，最后用理论推导的公式来计算DNA之间的同源性。同一菌的复性率为100%，80%~90%同源为同一种内同一亚种的细菌，60%~70%同源为同一种内不同亚种的细菌，20%~60%同源则是同一属中的不同菌种。这种方法还可对新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定，并可修正其他方法的分类和鉴定错误。

3．16S rRNA同源性分析

(1) rRNA-DNA杂交：变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。

(2)16S rRNA序列测定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16S rRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。1985年Lane等提出了改良的Sanger双脱氧链终止法测定rRNA序列，以rRNA为模板，以一个或多个寡核苷酸链做引物（与rRNA分子上的一段保守区域互补的15~20

个核苷酸），用反转录酶合成反转录DNA。随着PCR技术的成熟，出现了利用PCR技术扩增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，该法比前者更方便。当前的细菌分类要求测定16S rRNA基因的全序列来进行比较。16S rRNA基因序列分析技术是建立系统分类的主要技术，有人建议DNA相关性≥70%，16S rRNA序列差异≤1%~1.5%的细菌属于同一种，这使细菌的种有一个稳定和统一的标准。

二、分子生物学技术在细菌鉴定中的应用

十九世纪，细菌的鉴定主要依靠细菌的表型特征，因耗时长，往往耽误了对疾病诊断与治疗。随着分子生物学技术的发展及在临床微生物学检验中的应用，为微生物学实验室对细菌的快速鉴定，尤其是对难分离细菌的快速鉴定，提供了有利条件。目前在细菌鉴定中应用的分子生物学技术主要有核酸探针和核酸扩增技术等。

1．核酸探针技术

应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床诊断学的重大发展，其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段（称为探针），在一定条件下，按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探针技术有固相杂交（斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。）和液相杂交技术。

核酸探针适用于直接检出临床标本中的病原微生物，不受非病原微生物的影响，因此对某些尚不能分离培养或很难分离培养的微生物的检测具有重要的意义。随着探针标记的不断改进，检测试剂盒商品化，操作更简便易行。 核酸扩增技术

核酸扩增（又称基因或DNA扩增）技术是体外酶促合成DNA片段的新方法，其原理类似于DNA的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温下（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37~55℃）情况下，两条人式合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物的3`端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新链。这样每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍。经过上述25~40个循环后，靶序列可以扩增成106~108。

核酸扩增技术（或称聚合酶链反应技术，PCR）具有高敏感性、高特异性、简便、快速等特点，临床实验室常用PCR技术来检测标本中某些微生物，尤其是对难以培养微生物的检测。其它用于检测微生物的PCR技术还有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和随机引物PCR等。核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用见表6-4-2。 表6-4-2 核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用

微生物种类 核酸扩增技术 应 用

金黄色葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测 凝固酶阴性葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测

肺炎链球菌 PCR 自溶酶和青霉素结合酶的检测 化脓性链球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型 淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物标本直接检测 百日咳杆菌 PCR、巢式PCR 临床标本检测 结核分枝杆菌

PCR、SDA、Qbeta 肺结核的诊断、呼吸道标本检测、临床标本直接检测 鸟分枝杆菌复合群 PCR 鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别 白喉棒状杆菌 PCR 产毒菌株的检测

肠致病性大肠埃希菌 多重PCR 产毒菌株检测 伤寒、副伤寒沙门菌 PCR 耐药质粒分型和检测 幽门螺杆菌 多重PCR 胃活检组织细菌检测 小肠结肠炎耶尔森菌 PCR 菌株分型 弯曲菌属 PCR 通过16s rRNA鉴定

杜克雷嗜血杆菌 多重PCR 生殖道溃疡病人的直接检测 嗜肺军团菌 PCR 与爆发相关菌株的分型 金氏杆菌属 PCR 临床标本鉴定

念珠菌属 PCR 通过“DNA”指纹鉴定

梅毒螺旋体 多重PCR 生殖道溃疡标本直接检测 伯氏螺旋体 巢式PCR 治疗前、中、后检测

问号状钩端螺旋体 PCR 钩端螺旋体血清型的鉴定 CDC group Ⅳ 群 PCR 分型

沙眼衣原体 PCR 无症状病人的诊断

三、分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用

分子生物学技术在检测耐药基因方面日益受到重视。临床上可用PCR方法检测耐药基因，来判断待检菌对某种抗菌药物是否具有耐药性。但某些沉默耐药基因，如不表达相应产物，则可能不表现耐药表型。现在已有检测耐药基因的DNA探针和PCR商品化试剂盒供应，但多用于实验研究，常规工作中开展较少。目前能检测的耐药基因有： β-内酰胺类 mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。 氨基糖苷类

aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。 氯霉素

catP、catQ、catD、catI 环内酯类

ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。 磺胺类

sulⅠ、sulⅡ,sulA。 四环素

tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。 甲氧苄啶

dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。 8．糖肽类

vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。 9．喹诺酮类

gyrA、gyrB、parE。 10．乙胺丁醇 embB。

11．吡嗪酰胺 pncA。 12．利福平 rpoB。 13．链霉素 rpsL、rrs。 14．异烟肼

katG、inhA、ahpC。

第六节 自动化技术在微生物检验中的应用

微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。本节简要介绍有关情况。

一、微生物数码鉴定法

早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理

数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤：

(1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以100的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0.99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。

(3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（%id）

(4)在每个菌群中，再按%id值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，

个体与总体越接近，鉴定价值越大。按%id大小排序，将相邻两项的%id之比为R，代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果%id≥80，参考T及R值可作出鉴定。

2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以API鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（%id和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。

(2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(%id＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释

(1)如果排序第一的细菌%id≥80.0，则可将未知菌鉴定在此条目中，并按%id值的大小对鉴定的可信度作出评价。%id≥99.9和T≥0.75为最佳的鉴定；%id 99.0~98.9之间，T≥0.5为很好的鉴定；%id 90.0~98.9之间，T≥0.25为好的鉴定；%id 80.0~89.9之间为可接受的鉴定。

(2)如果第一条目的%id＜80.0，则将前2个条目的%id加在一起，若仍不足80.0，则将前3个%id相加。若≥80.0，则有2种可能：①为同种细菌，可能是不同生物型。②为同一菌属的不同种。

如果相加的几个条目既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属，在评价中会指出“补充生化反应”的项目及阳性反应率，可通过这些生化反应将几种菌区分开来。若前3个条目的和＜80.0，则为不可接受的结果。 (二)数码鉴定在临床上的应用

国内外已有许多种用于临床细菌鉴定的数码鉴定系统，为临床微生物学实验室对细菌的鉴定提供了简便、快速的方法。目前常见微生物鉴定系统见表6-4-3 表6-4-3 目前常见微生物鉴定系统

生产厂商 系统名称 可鉴定的微生物 孵育时间及条件 ANI 厌氧菌 ４h；需氧 API20A 厌氧菌 2４h；厌氧

API An-IDENT 厌氧菌 ４h；需氧

API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h GPI 革兰阳性球菌和杆菌 2~15h ID32 Staph 葡萄球菌 24h

API Coryne(Rapid CORYNE) 棒状杆菌及相关菌 24h API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌 ４~24h API 20E 肠杆菌科、非发酵菌 2４~48h EPS (Enteric Pathogen Screen） 爱德华菌属、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属 ４~8h GNI 肠杆菌科、非发酵菌 2~18h GNI＋ 肠杆菌科、非发酵菌 2~12h

UID／UID-3 尿液来源尿道致病菌 1~13h YBC 酵母菌 24~48h

API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厌氧菌 ４h

Crystal E/NF 肠杆菌科、某些革兰阴性非发酵菌 18~2４h Crystal Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 18~2４h Crystal MRSA ID MRSA ４h

Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、莫拉菌属、加德纳菌属、其它的苛养菌 ４h

Crystal Rapid Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 ４h Crystal Rapid stool/Enteric 革兰阴性肠道致病菌 ３h Enterotube Ⅱ 肠杆菌科 18~24h

ID Tri-Panel 革兰阴性和阳性菌 16~20h；40~44h

MiniTek 厌氧菌、肠杆菌科、革兰阳性菌、奈瑟菌属、非发酵菌、酵母菌 4h（肠杆菌科、奈瑟菌属） 72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革兰阴性、氧化酶阳性葡萄糖发酵或不发酵菌 24~48h

NEG ID Type2 肠杆菌科、其它的发酵和非发酵菌 15~42h Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 18~48h Rapid Anaerobe 厌氧菌 4h；需氧

Rapid HNID 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、卡他莫拉菌、阴道加德纳菌 4h Rapid NEG ID Type2 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2h Rapid NEG ID Type3 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2.５h Rapid Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 2h Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 肠杆菌科 4h

RapID ANAⅡ 厌氧菌 4~6h；需氧 RapID CB Plus 棒状杆菌 4h

RapID NF Plus 非发酵革兰阴性杆菌 4h

RapID NH 奈瑟菌、嗜血杆菌和其它革兰阴性细菌 4h；1h(淋球菌) RapID onE 肠杆菌科和其它氧化酶阴性菌 4h RapID STR 链球菌 4h

RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌样菌 4h

AN 厌氧菌 4~16h；需氧

GN Microplate 需氧革兰阴性杆菌 4~24h

GP Microplate 大多数革兰阳性球菌和杆菌 4~24h YT 酵母菌 24~72h

Neisseria Enzyme test 奈瑟菌属、莫拉菌属 30min r/b Enteric Differential System 肠杆菌科 18~24h Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d

Uni-N/F-Tek 革兰阴性发酵或不发酵细菌 24~28h

Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 肠道和非肠道革兰阴性杆菌 18~24h

AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 肠杆菌科和非发酵革兰阴性杆菌 5~18h

二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统

自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。

药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例 酶谱分析

(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS pH为基础的反应

（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels 碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog

挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI

肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统

1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统

VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。

2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。 3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统

BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液

4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。 5．抑菌圈直径测量仪

抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），

AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。 （二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统 1．VITEK 系统

VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。

该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。 2. MicroScan Walk/ Away系统

MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。 3．PHOENIXTM 系统

PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试

验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。 4．SENSITITRE ARIS系统

该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。 (三)使用自动化鉴定仪的局限性 1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。 2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。

3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统

正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。

全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列 BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。 2．BacT／Alert系统

该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内

有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。 3. VITAL系统

主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。 4．ESP血培养系统

主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统

结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。 3．16S rRNA同源性分析

(1) rRNA-DNA杂交：变性rRNA与变性DNA混合时，rRNA与其互补的DNA链形成杂交双链，rRNA分子与异源DNA杂交时，也能在其同源区形成互补双链，这种杂交双链的稳定性与其同源性成正相关，适于细菌属及属上水平的分类研究。现最常用的是硝酸纤维膜结合法。

(2)16S rRNA序列测定：rRNA分子具有高度保守性，在所有的细胞生物中都存在，在长期的进化中，16S rRNA的总碱基数有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互对齐进行比较。1985年Lane等提出了改良的Sanger双脱氧链终止法测定rRNA序列，以rRNA为模板，以一个或多个寡核苷酸链做引物（与rRNA分子上的一段保守区域互补的15~20

个核苷酸），用反转录酶合成反转录DNA。随着PCR技术的成熟，出现了利用PCR技术扩增16S rRNA基因（rDNA），然后采用Sanger法分析rDNA序列的方法，该法比前者更方便。当前的细菌分类要求测定16S rRNA基因的全序列来进行比较。16S rRNA基因序列分析技术是建立系统分类的主要技术，有人建议DNA相关性≥70%，16S rRNA序列差异≤1%~1.5%的细菌属于同一种，这使细菌的种有一个稳定和统一的标准。 二、分子生物学技术在细菌鉴定中的应用

十九世纪，细菌的鉴定主要依靠细菌的表型特征，因耗时长，往往耽误了对疾病诊断与治疗。随着分子生物学技术的发展及在临床微生物学检验中的应用，为微生物学实验室对细菌的快速鉴定，尤其是对难分离细菌的快速鉴定，提供了有利条件。目前在细菌鉴定中应用的分子生物学技术主要有核酸探针和核酸扩增技术等。 1．核酸探针技术

应用核酸探针技术检测病原微生物核酸是临床诊断学的重大发展，其原理是用带有酶、化学荧光物、放射性核素或生物素标记的已知序列特定DNA片段（称为探针），在一定条件下，按碱基互补原则探针与待测标本中的核酸杂交，通过对杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。常用核酸探针技术有固相杂交（斑点杂交、原位杂交、Southern印迹、Northern印迹等。）和液相杂交技术。

核酸探针适用于直接检出临床标本中的病原微生物，不受非病原微生物的影响，因此对某些尚不能分离培养或很难分离培养的微生物的检测具有重要的意义。随着探针标记的不断改进，检测试剂盒商品化，操作更简便易行。 核酸扩增技术

核酸扩增（又称基因或DNA扩增）技术是体外酶促合成DNA片段的新方法，其原理类似于DNA的体内半保留复制。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温下（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37~55℃）情况下，两条人式合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物的3`端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5` 3`方向延伸，合成DNA新链。这样每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍。经过上述25~40个循环后，靶序列可以扩增成106~108。

核酸扩增技术（或称聚合酶链反应技术，PCR）具有高敏感性、高特异性、简便、快速等特点，临床实验室常用PCR技术来检测标本中某些微生物，尤其是对难以培养微生物的检测。其它用于检测微生物的PCR技术还有：RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和随机引物PCR等。核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用见表6-4-2。 表6-4-2 核酸扩增技术在临床微生物学检验中的应用

微生物种类 核酸扩增技术 应 用

金黄色葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测 凝固酶阴性葡萄球菌 多重PCR 对mecA基因检测 肺炎链球菌 PCR 自溶酶和青霉素结合酶的检测 化脓性链球菌 PCR M蛋白基因的菌株分型 淋病奈瑟菌 LCR 尿道分泌物标本直接检测 百日咳杆菌 PCR、巢式PCR 临床标本检测 结核分枝杆菌

PCR、SDA、Qbeta 肺结核的诊断、呼吸道标本检测、临床标本直接检测 鸟分枝杆菌复合群 PCR 鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的区别 白喉棒状杆菌 PCR 产毒菌株的检测

肠致病性大肠埃希菌 多重PCR 产毒菌株检测 伤寒、副伤寒沙门菌 PCR 耐药质粒分型和检测 幽门螺杆菌 多重PCR 胃活检组织细菌检测 小肠结肠炎耶尔森菌 PCR 菌株分型 弯曲菌属 PCR 通过16s rRNA鉴定

杜克雷嗜血杆菌 多重PCR 生殖道溃疡病人的直接检测 嗜肺军团菌 PCR 与爆发相关菌株的分型 金氏杆菌属 PCR 临床标本鉴定

念珠菌属 PCR 通过“DNA”指纹鉴定

梅毒螺旋体 多重PCR 生殖道溃疡标本直接检测 伯氏螺旋体 巢式PCR 治疗前、中、后检测

问号状钩端螺旋体 PCR 钩端螺旋体血清型的鉴定 CDC group Ⅳ 群 PCR 分型

沙眼衣原体 PCR 无症状病人的诊断

三、分子生物学技术在细菌药敏试验中的应用

分子生物学技术在检测耐药基因方面日益受到重视。临床上可用PCR方法检测耐药基因，来判断待检菌对某种抗菌药物是否具有耐药性。但某些沉默耐药基因，如不表达相应产物，则可能不表现耐药表型。现在已有检测耐药基因的DNA探针和PCR商品化试剂盒供应，但多用于实验研究，常规工作中开展较少。目前能检测的耐药基因有： β-内酰胺类 mecA、blaTEM、blaROB-1、blaSHV、blaIMP、blaMIR-1、blaOXA、blaPER-1、blaPER-2、blaOXY-1、blaOXA-10/11。 氨基糖苷类

aph（3’）—Ⅲ、aph（3’）—Ⅵ、ant（2〃）Ia、ant（4’）-Ia、aac（3） -Ia、acc（6’）-Ia、aac（3）-Va、aac（6’）-aph（2〃）、ant（4’）、ant（6’）-Ia、aac（6’）-Ic、aac（3）-Ib、aad（2〃）-Ia、ant（6）-I、aph（2〃）-Ic。 氯霉素

catP、catQ、catD、catI 环内酯类

ereA、ereB、ermA、ermAM、ermC、ermF、smp、mphA、mefA、vat。 磺胺类

sulⅠ、sulⅡ,sulA。 四环素

tet（A）、tet（C）、tet（D）、tet（K）、tet（L）、tet（M）、tet（O）、tet（P）、tet（S）、tet（Q）、tet（U）、tetA（P）。 甲氧苄啶

dhfrⅠ、dhfrⅡ、dhfrⅢ、dhfrⅤ、dhfrⅦ、dhfrⅨ、dhfrⅩ、dfrA、folH、dhfrⅧ。 8．糖肽类

vanA、vanB、vanB2, vanC1、vanC3、vanD。 9．喹诺酮类

gyrA、gyrB、parE。

10．乙胺丁醇 embB。

11．吡嗪酰胺 pncA。 12．利福平 rpoB。 13．链霉素 rpsL、rrs。 14．异烟肼

katG、inhA、ahpC。

第六节 自动化技术在微生物检验中的应用

微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。本节简要介绍有关情况。

一、微生物数码鉴定法

早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和形成独特的不同细菌鉴定系统。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理

数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤：

(1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以100的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0.99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。

(3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（%id）

(4)在每个菌群中，再按%id值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按%id大小排序，将相邻两项的%id之比为R，代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果%id≥80，参考T及R值可作出鉴定。

2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以API鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（%id和T值）。②对鉴定结果

好坏的评价，最佳……等。③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。

(2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(%id＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释

(1)如果排序第一的细菌%id≥80.0，则可将未知菌鉴定在此条目中，并按%id值的大小对鉴定的可信度作出评价。%id≥99.9和T≥0.75为最佳的鉴定；%id 99.0~98.9之间，T≥0.5为很好的鉴定；%id 90.0~98.9之间，T≥0.25为好的鉴定；%id 80.0~89.9之间为可接受的鉴定。

(2)如果第一条目的%id＜80.0，则将前2个条目的%id加在一起，若仍不足80.0，则将前3个%id相加。若≥80.0，则有2种可能：①为同种细菌，可能是不同生物型。②为同一菌属的不同种。

如果相加的几个条目既不属于同一细菌种，又不属于同一细菌属，在评价中会指出“补充生化反应”的项目及阳性反应率，可通过这些生化反应将几种菌区分开来。若前3个条目的和＜80.0，则为不可接受的结果。 (二)数码鉴定在临床上的应用

国内外已有许多种用于临床细菌鉴定的数码鉴定系统，为临床微生物学实验室对细菌的鉴定提供了简便、快速的方法。目前常见微生物鉴定系统见表6-4-3 表6-4-3 目前常见微生物鉴定系统

生产厂商 系统名称 可鉴定的微生物 孵育时间及条件 ANI 厌氧菌 ４h；需氧 API20A 厌氧菌 2４h；厌氧

API An-IDENT 厌氧菌 ４h；需氧

API Staph（STAPH－Trac） 葡萄球菌、微球菌 2４h GPI 革兰阳性球菌和杆菌 2~15h ID32 Staph 葡萄球菌 24h

API Coryne(Rapid CORYNE) 棒状杆菌及相关菌 24h API 20Strep(Rapid STREP) 链球菌、肠球菌 ４~24h API 20E 肠杆菌科、非发酵菌 2４~48h EPS (Enteric Pathogen Screen） 爱德华菌属、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属 ４~8h GNI 肠杆菌科、非发酵菌 2~18h GNI＋ 肠杆菌科、非发酵菌 2~12h

UID／UID-3 尿液来源尿道致病菌 1~13h YBC 酵母菌 24~48h

API 20C AUX 酵母菌 48~72h

Crystal Anaerobe 厌氧菌 ４h

Crystal E/NF 肠杆菌科、某些革兰阴性非发酵菌 18~2４h Crystal Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 18~2４h Crystal MRSA ID MRSA ４h

Crystal Neisserial/Haemophilus 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、莫拉菌属、加德纳菌属、其它

的苛养菌 ４h

Crystal Rapid Gram Positive 革兰阳性球菌和杆菌 ４h Crystal Rapid stool/Enteric 革兰阴性肠道致病菌 ３h Enterotube Ⅱ 肠杆菌科 18~24h

ID Tri-Panel 革兰阴性和阳性菌 16~20h；40~44h

MiniTek 厌氧菌、肠杆菌科、革兰阳性菌、奈瑟菌属、非发酵菌、酵母菌 4h（肠杆菌科、奈瑟菌属） 72h（酵母菌）

Oxi／FermⅡ 革兰阴性、氧化酶阳性葡萄糖发酵或不发酵菌 24~48h

NEG ID Type2 肠杆菌科、其它的发酵和非发酵菌 15~42h Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 18~48h Rapid Anaerobe 厌氧菌 4h；需氧

Rapid HNID 奈瑟菌属、嗜血杆菌属、卡他莫拉菌、阴道加德纳菌 4h Rapid NEG ID Type2 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2h Rapid NEG ID Type3 肠杆菌科、其他的发酵和非发酵菌 2.５h Rapid Pos ID 革兰阳性球菌和李斯特菌属 2h Rapid Yeast ID 酵母菌 4h

Micro-ID 肠杆菌科 4h

RapID ANAⅡ 厌氧菌 4~6h；需氧 RapID CB Plus 棒状杆菌 4h

RapID NF Plus 非发酵革兰阴性杆菌 4h

RapID NH 奈瑟菌、嗜血杆菌和其它革兰阴性细菌 4h；1h(淋球菌) RapID onE 肠杆菌科和其它氧化酶阴性菌 4h RapID STR 链球菌 4h

RapID Yeast Plus 酵母菌和酵母菌样菌 4h

AN 厌氧菌 4~16h；需氧

GN Microplate 需氧革兰阴性杆菌 4~24h

GP Microplate 大多数革兰阳性球菌和杆菌 4~24h YT 酵母菌 24~72h

Neisseria Enzyme test 奈瑟菌属、莫拉菌属 30min r/b Enteric Differential System 肠杆菌科 18~24h Uni-Yeast Tek 酵母菌 24h~6d

Uni-N/F-Tek 革兰阴性发酵或不发酵细菌 24~28h

Medical Specialties Inc. Fox Exera GNI 肠道和非肠道革兰阴性杆菌 18~24h

AccuMed International, Inc. Sensititre AP 80 肠杆菌科和非发酵革兰阴性杆菌 5~18h

二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统

自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果

的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。

药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例 酶谱分析

(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS pH为基础的反应

（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels 碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog

挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI

肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统

1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统

VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。

2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。 3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统

BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液

4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。 5．抑菌圈直径测量仪

抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），

AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。 （二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统 1．VITEK 系统

VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。

该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。 2. MicroScan Walk/ Away系统

MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。 3．PHOENIXTM 系统

PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。

每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。 4．SENSITITRE ARIS系统

该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。 (三)使用自动化鉴定仪的局限性 1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。 2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。

3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统

正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。

全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列 BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。 2．BacT／Alert系统

该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、

血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。 3. VITAL系统

主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。 4．ESP血培养系统

主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统

结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。 二、自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统

自动化的微生物鉴定和药敏试验分析系统在临床微生物实验室的应用，为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断和药敏试验提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础，而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。各种微生物鉴定系统的反应基础见表6-4-4。

药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

表 6-4-4 各种微生物鉴定系统的反应基础

系统源性 需要培养 分析 阳性结果指示 系统举例 酶谱分析

(通常2~4h) 不需要 酶活性 色原性／荧光性底物混合物被酶水解后产生颜色变化 MicroScan Rapid panels、IDS pH为基础的反应

（通常15~24h） 需要 碳水化合物利用 pH指示颜色变化 碳水化合物分解产酸，蛋白质或含氮化合物被水解产碱 API、Crystal、VITEK cards、 Micro Scan conventional panels 碳源利用 需要 有机物 无色变为紫色 Biolog

挥发性和不挥发酸测定 需要 细胞脂肪酸 气相色谱鉴定终末产物与已知图谱比较 MIDI

肉眼观察生长 需要 各种底物 混浊生长 酵母菌鉴定

半自动化细菌鉴定和/或药敏分析系统

1．VITEK-ATB半自动细菌鉴定和药敏分析系统

VITEK-ATB是生物-梅里埃公司产品，由计算机和读数器两部分组成，计算机程序包括ATB和API的鉴定数据库、ATB的药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机读取结果，由计算机进行分析和处理，并报告细菌鉴定和药敏结果。

2．AutoScan-4半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoScan-4是由Dade MicroScan公司生产，由计算机和读数器两部分组成。鉴定和药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工进行判读，将编码输入计算机，由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。 3．BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统

BBLTM CrystalTM半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，将传统的酶、底物生化呈色反应与先进的荧光增强显色技术结合以设计鉴定反应最佳组合。反应板在机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。配套提供独立分装的鉴定用肉汤试管，确保无菌状态，使用方便。配套比浊仪可快速调配所需浊度的菌液

4．AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统

AutoReader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成。采用荧光测定法，反应板在机外作定时孵育后，上机读数，由SAMS软件评定测定结果，也可通过SAMS系统人工确认法输入计算，或完全由人工输入作评定。所用鉴定板和药敏板与全自动机型中的反应板是一样的。 5．抑菌圈直径测量仪

抑菌圈直径测量仪有BIOMIC（Giles Scientific Inc），

AccuZone System (AccuMed International Inc) ，SIRSCAN (SIRSCAN) 等三种单板读取机，已在临床应用。经孵育后的药敏平板，被仪器的图象分析系统识别并计算抑菌圈直径。根据判断标准，报告药敏试验结果。这些仪器可减少人工测量抑菌圈直径大小差异及主观判断错误。BIOMIC系统宣称能根据抑菌圈大小来计算MIC，值得注意的是该类仪器对抑菌圈内模糊生长或微小的菌落不能正确识别，而这些菌落对细菌的耐药性的判定至关重要，读取每个平板时必须进行人工观察。 （二）全自动的微生物鉴定和药敏试验分析系统 1．VITEK 系统

VITEK AMS是由生物-梅里埃公司生产的全自动微生物鉴定和药敏分析系统。第一代产

品有以下四个规格VITEK AMS 32、60、120、240。由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。

获得细菌的纯培养后，调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的药敏试验卡片，在充液仓中对卡片进行充液。置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试、读取数据和判断结果。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌。具有20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，快速检测细菌药敏情况。

该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。 2. MicroScan Walk/ Away系统

MicroScan Walk/ Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16~18h，快速板测定只需2~3.5h。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17~33种抗菌药物的MIC值。此系统有walk / Away－40和96两个型号，40或96分别代表该系统可同时容纳40或96个测试板。 3．PHOENIXTM 系统

PHOENIXTM System是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏系统，由BD公司生产。鉴定试验采用BD专利荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色（Chromogenic）反应双重标准进行药敏试验结果判断。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。有PHOENIXTM 100或50 二种型号。PHOENIXTM 100型分别可进行100个鉴定试验和100个药敏试验。可鉴定革兰氏阳性菌139种、革兰氏阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种可供选择。每个鉴定药敏复合板有51孔用于鉴定试验，85孔用于药敏试验，可同时进行17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验。90%细菌的鉴定在3~6h完成，鉴定准确率大于90%，85%的细菌药敏试验在4~6h内出结果。 4．SENSITITRE ARIS系统

该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在培养箱中设置可存放64块板的转盘，每块板均能检测3个标本，故同时可检测192个菌种标本。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。在较短时间内能够分析不同生化底物所反映出的荧光物质，通过荧光读数仪检测板孔中荧光Biocide和Willcox值来鉴定细菌。该系统的药敏试验有两种测定法，即当采用人工判定时为比浊法，当采用仪器自动判读时为荧光测定法。但均参照NCCLS的标准和规则来解释结果。大多数菌种均可在

5小时内报告检验结果。通常有革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定板和300多种抗菌药物不同组合的药敏板及鉴定/药敏复合板。 (三)使用自动化鉴定仪的局限性 1．自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止，尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法，因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为“金标准”。使用自动化鉴定仪的实验室，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。 2．细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变，使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。

3．通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

三、自动化的血液细菌培养系统

正常血液是无菌的，细菌侵入可导致菌血症、败血症、脓毒血症，及时准确地进行病原学诊断极为重要。传统的血培养是抽取5ml血液注入血培养瓶中，放入孵箱，每天观察结果，费时费力，不能及时发阳性结果，易延误诊断。

全自动血液细菌培养仪主要优点是可以在较短培养时间内提示出血液培养瓶中有无微生物的存在。

1．BACTEC系列 BACTEC460、NR-730是早期的血液培养仪，目前基本上已被BACTEC9000系列替代（包括9050、9120和9240三种型号，可分别容纳50、120和240个培养瓶）。微生物在生长过程中消耗培养基内的营养物质，产生的二氧化碳直接激活瓶底部预埋的对二氧化碳浓度变化高度敏感的荧光物质，在激发光的激发下放出荧光，荧光的强度变化直接反映瓶内二氧化碳浓度变化，来判断瓶内有无微生物生长。根据不同的培养要求，该系统配置了标准需氧／厌氧培养瓶、有中和抗菌药物的树脂培养瓶、厌氧菌和真菌等多种培养瓶。细菌培养生长曲线、结果等均可在联机的计算机上显示出来。 2．BacT／Alert系统

该系统有BacT／Alert48、72、96、120、240及3D等型号。主要测定原理为当培养瓶内有微生物生长，代谢过程中产生的二氧化碳可经过半透膜渗透至瓶底，与固定于瓶底的Novel／CO2感应器结合，产生颜色变化，通过光电检测得知二氧化碳变化情况。通过计算机处理后，在曲线图上反映、分析、判断阴性或阳性结果，并及时报警。该系统可在任何时间内放入培养瓶，通过条码识别允许该标本进入系统，并连续跟踪监测。系统配置有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、中和抗生素需氧瓶、中和抗生素厌氧瓶、小儿培养瓶、血液分枝杆菌培养瓶和痰液分枝杆菌培养瓶等。 3. VITAL系统

主要测定原理为使用均质荧光技术的快速培养系统，培养瓶内的液体培养基中含有荧光底物，当细菌生长后，产生的质子、电子和离子与荧光分子结合后，使荧光物变成无荧光化合物，通过测量每瓶内荧光强度来反映细菌生长情况。 4．ESP血培养系统

主要测定原理为细菌在生长过程中消耗氧，产生氮气、氢气和二氧化碳，导致培养瓶内压力改变。该系统采用气压传感技术，通过压力传感器监测瓶内压力变化，报警提示有细菌生长。

四、结核分枝杆菌快速检测系统

结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。

结核分枝杆菌的经典培养是将标本接种在特定培养基上，定时观察，15天后生长的为可疑菌落。判定阴性需8周时间，要完成阳性病例的鉴定、药物敏感试验需2~3个月，且阳性率低，不易标准化。二十世纪七十年代以来，采用14C棕榈酸作为底物快速检测结核分枝杆菌，使快速分离及鉴定结核分枝杆菌成为可能。第一代的仪器为BD公司的BACTEC 460TMTB培养仪，由于14C的放射性环境污染及探针穿刺开放等缺陷，基本上已被淘汰。BACTEC 9000系列为了克服放射性的缺陷，改用荧光增强技术。由于分枝杆菌的生长需要添加一定浓度的二氧化碳，因此检测培养瓶中氧浓度的变化比二氧化碳浓度的变化更加敏感直接。BACTEC 9000系列利用对氧浓度敏感的荧光物质，来测定培养瓶中结核分枝杆菌的生长。BACTECTMMYCO／FTIC（含溶血素分枝杆菌／真菌培养瓶）适用于血液及无菌体液中结核分枝杆菌和真菌的检测。由于添加了溶血素，破坏了红细胞等血细胞对氧的利用，避免了假阳性。BACTECTMMYCO／FSPuta培养适用于其它污染标本的使用。在此二种瓶中有阳性生长时，需鉴别是结核分枝杆菌还是真菌及其它细菌生长所引起的阳性，它们仅适用于结核分枝杆菌的筛查。

BACTEC960和BacT／ALERT3D系统，可进行结核分枝杆菌的初代培养、阳性结果的鉴定和药敏试验。通过对标本的消化处理后，接种分枝杆菌快速培养管。培养管的基本组成为：①改良Middle Brook 7H9分枝杆菌专用增菌肉汤。②抗菌剂 两性霉素B，阿洛西林，奈啶酸，多粘菌素B，甲氧嘧啶，万古霉素。③营养添加剂。平均阳性检出时间为9~13d，鉴定4~5d。大大加快了结核分枝杆菌的检出。

还有一些适用于小型实验室的手工结核分枝杆菌快速鉴定系统。包括标本前处理管、结核分枝杆菌快速生长管、鉴定试验管、药敏试验管及荧光判读器。

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