呼谱 SOP(1)

呼吸道病原体谱16(IgM)检测试剂盒(间接免疫荧光法) 操作规程

订货号 规格 检测项目 呼吸道合胞病毒 腺病毒 流感病毒A型 流感病毒B型 副流感病毒 肺炎支原体 肺炎衣原体 柯萨奇病毒B型 柯萨奇病毒A型 埃可病毒 嗜肺军团菌 包被基质 FI 2821-16/17 M 10X01 10X02 感染细胞 细菌

标本要求：

样本：人血清或EDTA、肝素或柠檬酸盐抗凝的血浆。

稳定性：待测的患者血清样本可于2-8?C贮存14天，稀释后的样本需在一个工作日内检测。 检测IgM抗体：在检测特异性IgM类抗体前，需去除患者样本中的IgG类抗体。可采用免疫吸附（如欧蒙吸附剂，订货号：ZF 1270-0145）方法去除IgG类抗体，这不仅可以防止样本中的IgM类类风湿因子与特异性结合的IgG反应而引起的假阳性结果，还可防止特异性IgG与IgM与抗原竞争性结合而引起的假IgM阴性结果。用RF吸附剂，同时还可去除类风湿因子。

定性检测时推荐的样品稀释：IgM类抗体：用欧蒙吸附剂1:10稀释患者样本（例如，可取16.6μl样本用150μl吸附剂稀释并充分混匀，可用漩涡混匀器震荡4秒），室温温育15分钟，注意不要搅起可能已经形成的沉淀。也可以再离心5分钟（2000rpm，室温）。如果要求的稀释度为1:100，用PBS吐温缓冲液将上清液进一步1:10稀释。

仪器：

荧光显微镜，40x物镜。激发滤镜:488nm，分光滤镜:510nm，阻挡滤镜:520nm。光源100W汞灯或者欧蒙LED Bluelight。

方法和实验原理

1.方法：间接免疫荧光法

2.实验原理：病原体涂片与稀释的患者血清温育。如果样本阳性，特异性IgA、IgG和IgM抗体与相应抗原结合。在第二步温育时，结合的抗体与荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体反应。然后在荧光显微镜下观察特异性的荧光模型。

试剂:呼吸道病原体谱16(IgM)检测试剂盒(间接免疫荧光法)

制造商：德国EUROIMMUN公司；试剂盒货号：FI 2821-16/17M。

实验操作： 1.加样：

将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加30μl稀释后血清至加样板的每一反应区，避免产生气泡。加完所有待测样本后再开始温育(最多200份)。 将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触。室温(18-25?C)温育30分钟。

用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载片，然后立即将其浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸泡至少5分钟。

滴加25μl FITC标记的抗人球蛋白(荧光二抗)至洁净加样板的反应区，完全加完所有的荧光二抗方可进行下一步温育。建议使用连续加样器。FITC标记的二抗使用前需混匀。为节约时间，可在第一次温育的同时滴加二抗至另一个加样板的反应区。

从洗杯中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。确保生物薄片与液滴接触良好，然后继续下一张。室温(18-25?C)温育 30分钟，注意避免阳光直射载片。

用烧杯盛PBS吐温缓冲液流水冲洗载片，然后立即将其浸入装有PBS吐温缓冲液的洗杯中浸洗至少5分钟。

将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每一反应区约10μl。从PBS吐温缓冲液中取出一张载片，用吸水纸擦干背面和边缘的水分，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。

2.温育：

3.冲洗：

4.加样：

5.温育：

6.冲洗：

7.封片：

显微镜下观察荧光模型。

观察感染细胞用20×物镜，观察细胞基质用40×物镜。

8.结果判断：

激发滤片：488nm，分光滤镜：510nm，阻挡滤镜：520nm。 光源：100W汞灯 检验结果的解释以及临床意义： 质控芯片:

质控芯片(VBC) 包被有圆点样3种抗人免疫球蛋白抗体(抗-IgA, 抗-IgG, 抗-IgM)。依据生物薄片上的排布来区分不同的微点 (图. 1): IgA:最大的间距 IgG: 中等间距 IgM: 最小的间距

样本温育时样本中的人免疫球蛋白与相应的抗体微点结合。然后与结合物温育 (FITC-标记的抗人免疫球蛋白) 后，可以通过判读阳性反应来确定实验中使用了哪种抗人免疫球蛋白抗体(图. 2).

如果VBC上的微点没有出现阳性反应或者出现错误的二抗荧光模型，则实验结果不可靠，需重复实验。

例外: 如果样本中有抗同型抗体或抗异型抗体会出现交叉反应。这种情况下重复实验结果不会改变。这种少见的情况不能使用VBC 来确认二抗，但其他反应区的结果可以进行判读。

细菌涂片：

对以下几个检测项目，必须当生物薄片上所有的菌体都出现清晰可见的荧光才能判为阳性，尽量多观察几个视野，如果只是部分菌体出现荧光，不应判为阳性。 感染细胞：

视野中的部分细胞为非感染细胞，不会出现特异性荧光。如果所有细胞（包括非感染细胞）的细胞核或细胞浆出现荧光，表明存在抗核抗体或抗线粒体抗体以及其它抗体。 ? 抗呼吸道合胞病毒（RSV）抗体在感染细胞的细胞核和细胞浆中产生特异性荧光。从

病毒抗原散发出的荧光，根据感染的程度不同，在一些细胞中仅出现比较少的颗粒状和纤维状荧光。在感染严重的细胞中，出现大的滴状和网状荧光。 ? 抗腺病毒抗体阳性，感染细胞中产生不同的荧光，荧光模型因病人样本而异。可在细胞

浆中出现细颗粒荧光，细胞核中出现细到粗颗粒状荧光。某些血清中，可同时出现两种荧光模型。 ? 抗流感病毒A和B型抗体与感染细胞反应，在细胞浆中产生平滑的荧光，细胞核仅出

现微弱的荧光反应。 ? 抗副流感病毒抗体与感染细胞反应，在细胞浆中产生细到粗的颗粒状荧光，细胞核仅出

现微弱的反应。 ? 抗肺炎支原体抗体阳性，主要在感染细胞胞浆内产生颗粒到粗的滴状荧光。根据感染的

严重程度不同，在一些细胞中可出现细到粗颗粒状荧光，感染比较严重的细胞可产生粗的滴状荧光，有些部位可见平滑的荧光。 ? 抗肺炎衣原体抗体阳性，感染细胞胞浆内的包涵体产生荧光。包涵体中含有肺炎衣原生

小体的原体（衣原体的感染形式，直径为300nm）和网状体（衣原体的非感染形式，直径为1000nm）。细胞间游离的原生小体和网状体也可产生特异性荧光。 ? 抗柯萨奇病毒抗体与感染细胞反应主要在细胞胞浆中产生颗粒性荧光。

? 抗埃可病毒抗体与基质中的感染细胞反应，主要在细胞浆中产生颗粒样荧光。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/36wg.html