海藻酸钠固定化预实验

植物细胞固定化预实验

实验目的：熟悉海藻酸钠做固定剂下植物细胞固定化培养试验操作。

实验材料：悬浮培养的植物细胞种子、250ml三角瓶5个、培养皿、 移液枪、电子称、电磁搅拌器、滴管或注射器、烧杯、纱布、漏斗、铁架台。 实验步骤

1.实验准备：配制植物细胞液体培养基分装到4个250ml三角瓶中，每瓶70ml；配制一定量20g/LCaCl2溶液；配制40g/L的海藻酸钠溶液100ml并称量配制好的海藻酸钠溶液质量w1。 2.灭菌

3.制备凝胶球

3.1取种子液用两层无菌纱布过滤，收集滤液。

3.2静置滤液，用移液枪移去上层培养液至于事先准备好的无菌三角瓶中备用。获得植物细胞。

3.3取鲜重20g的细胞于配置好的无菌还在酸钠溶液中边加入边用电磁搅拌器搅拌。

3.4用滴管或注射器吸取海藻酸钠--细胞混合液滴入无菌CaCl2溶液中形成直径3--5mm的凝胶球，放置30--60min后倒出CaCl2溶液，用无菌水充分洗涤凝胶珠。 3.5称量胶球质量w=8*（20+w1）/20g加入到含70ml新鲜培养基+10ml原培养基的三角瓶中，制作两瓶。称量植物细胞鲜重8g加入到含70ml新鲜培养基+10ml原培养基中做对照。

4.在一定条件下进行摇瓶振荡培养，每5天取发酵液测定培养基组分消耗情况、代谢产物的生成速率等并观察记录胶球完整情况。

植物细胞固定化培养原理及海藻酸钠浓度单因素试验方案

科学研究发现，密集而有一定程度分化的、生长缓慢的细胞培养物，较分散而无结构的、生长迅速的细胞培养物累积更多的次生代谢物。其原因为:前者细胞所处的理化环境与其在整体植物中所处的环境类似，细胞因而能够发挥正常的代谢功能；而对后者而言，细胞在培养液中所处的环境既无极性，也无理化梯度。故而设想把细胞固定在一定的支持物上，使它们之间密切接触，并形成一定的理化梯度。如此，既可以保障细胞的营养需要，又可避免由于代谢产物的累积而对细胞代谢造成反馈抑制。

物质生产大多利用处于稳定增殖期的细胞，由于固定化抑制生长发育，因此应考虑尽可能模拟稳定期等等。

优点：细胞遗传性状较稳定、能长时间保持细胞活力、光合作用增强、可反复使用、细胞利用率高、次生物质的合成和积累提高、有利于产物的释放、细胞抗剪切能力增强、后处理难度小。

难点：产物的释放以及如何控制固定化细胞处于不分裂状态等。

由于用细胞固定化时是以高的细胞密度来保持高活性的，若能抑制细胞增殖来提高反应效率则可弥补产物生合成所具有的缺点。

Yoeman发现当细胞进入缓慢生长状态时，其次生代谢产物的合成能力比较强。这正是利用固定化细胞生产次生代谢产物的基本原理之一。

1海藻酸钠浓度的选择

原理：Yoeman发现当细胞进入缓慢生长状态时，其次生代谢产物的合成能力比较强。这正是利用固定化细胞生产次生代谢产物的基本原理之一。物质生产大多利用处于稳定增殖期的细胞，由于固定化抑制生长发育，因此应考虑尽可能模拟稳定期等等。培养基中的初始总糖浓度都是相同的,经固定化细胞培养一段时间后,如果培养液中的总糖浓度较高,说明糖的通透性差,细胞耗糖较少,因而生长缓慢。

试验设计：

将悬浮培养的细胞与一定浓度的海藻酸钠溶液（表1）混合均匀，包埋密度为0.2kg/L，再缓慢滴入一定浓度的CaCl2溶液中，放置30m in后倒出CaCl2溶液，用无菌水充分洗涤凝胶珠。 在无菌条件下，将洗涤干净的固定化细胞凝胶珠以一定的接种量转入发酵培养基中，每一浓度三次重复，在一定条件下进行摇瓶振荡培养.以无固定剂等接种量的细胞培养为对照。每天观察和记录细胞凝胶珠的完整情况。30d后取样测定培养液中的总糖浓度。

表1 海藻酸钠浓度

海藻酸钠浓度 g/L 培养液中总糖浓度 g/L

25

30

35

40

45

结果分析：培养基中的初始总糖浓度都是相同的，经固定化细胞培养一段时间后，如果培养液中的总糖浓度较高，说明糖的通透性差，细胞耗糖较少，因而生长缓慢.通过测定培养液中总糖浓度综合细胞凝胶珠的完整程度选择海藻酸钠最佳浓度。

破囊液基本组成为0.2ｍｏｌ/ＬＮａＨＣＯ3和0.06ｍｏｌ/ＬＮａ3Ｃ6Ｈ5Ｏ7·2Ｈ2Ｏ,ｐＨ7.8～8.2。将破囊液与壳聚糖/海藻酸钙微胶囊以体积比10∶1混合,30ｓ内可完成破囊操作。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/331p.html