小提质粒说明书

Tiangen

质粒小提试剂盒说明书（离心柱形 目录号dp103）（版本号dp121221）

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材料，高效、专一吸附DNA。 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。 使用前注意：

1. 溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。

2 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。

3. 使用前请先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4. 注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。 5. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm(~13,400×g)。 6. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

7. 实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。 8. 用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。

9. 去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。 操作步骤：

1. 柱平衡：吸附柱CP3，500μl BL，12,000 rpm，离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）

2. 取1 ml过夜培养的菌液，加入离心管，12,000 rpm，离心1 min，尽量吸除上清（多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3. 向菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液P1，悬浮混匀沉淀。（如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低）

4.加入250 μl 溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解。（温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量）

5. 向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000 rpm，离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清） 6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm，离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 7. 向吸附柱中CP3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm，离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。重复一次。

8. 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm，离心2 min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，并置于室温放置数分钟，以彻底晾干残余。

11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间滴加200 μl ddH20，室温放置2 min，12 000 rpm，离心2 min，将质粒收集到离心管中。 产物dna写好标签，保存于-20℃。

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