用玉米叶肉原生质体进行瞬时表达实验步骤

用玉米叶肉原生质体进行瞬时表达实验（PEG转）

一、生长条件

将玉米种子浸泡过夜，然后移到蛭石和营养土各半的培养基中光照生长3天（地上部分大约1cm左右），再移到黑暗条件下生长直到第二片叶的长度比第一片叶长10-15cm，这需要在25℃条件下生长10-11天。只浇水不用施肥。为了防止细菌生长，可往培养基中加入50-100g/ml 的 Amp。黄化叶片的原生质体可用于实验，茎和根也可以用，但尽量避免用绿色的叶片。 二、原生质体分离

切取第二片叶的中部（6-8cm）。将20片叶叠在一起，轻压，切成0.5mm的条，不要损伤叶片。刀片用95%的酒精清洗。1克含有5×106的原生质体可做50个反应。

在250ml的容器中放入10-20ml的酶液，放入切好的叶片，抽真空30min，40rpm轻摇，继续消化3-4hr。通常消化时间往往在黑暗条件下延长至16-18h。在显微镜下检测原生质体的完整性，玉米叶肉原生质体的大小为25-35um。80rpm继续震荡5min，使原生质体完全释放。 三、纯化

1、将消化好的原生质体用74uM的滤网过滤到10ml离心管中，原生质体用枪转移，需剪掉枪头。

2、4℃，100xg离心2min，吸掉上清（需剪枪头），将原生质体迅速轻轻弹起，然后沿离心管壁加入W5 buffer，使原生质体悬浮（加入

buffer的量视原生质体而定，通常为1-5ml）。 3、重复步骤2一次。

4、4℃，100xg离心1min，吸掉上清，将原生质体迅速轻轻弹起，然后沿管壁加入W5 buffer，使原生质体悬浮，冰上放置30min。 5、将10ul 1ug/ul的质粒加到干净的2ml离心管中。

6、吸掉原生质体上方的上清，沿管壁加入1ml MMg 悬浮原生质体。7、4℃ 100xg离心1min。

8、吸掉上清，再加入MMg重新悬浮原生质体，用量考虑原生质体的浓度，保持在104-5个/ml。 9、检测原生质体的完整性。

10、往含有质粒的2ml离心管中加入100ul原生质体，混匀，再加入原生质体和质粒总体积的PEG，混匀。 11、放入适宜的培养温度中转化1-1.5hr。

12、再加入2倍体积的W5 buffer（常温），上下轻轻晃动混匀。 13、常温，100xg离心1min。

14、吸掉上清，加入500ul W5 buffer（常温）悬浮。 15、常温，100xg离心1min。

16、往细胞培养板中加入1ml W5 buffer。

17、吸掉上清，吸取培养板中少量W5 buffer（常温）于离心管中，将原生质体充分悬浮后转移到培养板中，转移过程中要环绕加入，使原生质体充分分散。 18、检测细胞完整性。

19、培养12hr以后检测荧光信号。 四、溶液配制 1、母液（20ml）

10mM MES(195.24) 配成100mM 需MES 0.39g pH=5.7 1mM CaCl2（147.02） 配成1M 需CaCl2 2.94g 20mM KCl(74.55) 配成200mM 需KCl 0.298g 154mM NaCl（58.44） 配成2M 需NaCl 2.34g 15mM MgCl2(203.3) 配成50mM 需MgCl2 0.203g 2、酶液（20ml） A、玉米

100mM MES 2ml 终浓度 10mM pH=5.7 1M CaCl2 20ul 终浓度 1mM 甘露醇（182.2） 2.186g 终浓度 0.6M 纤维素酶R10 0.3g 终浓度 1.5% 果胶酶R10 0.06g 终浓度 0.3% β-巯基乙醇 7.8ul 终浓度 5mM BSA 0.02g 终浓度 0.1%

先将MES和CaCl2混合，再加入适量的水，然后加入甘露醇，待溶解后再依次加入剩余药品，完全溶解后定容，最后用0.42uM的过滤器过滤，4℃保存。 3、W5 buffer（100ml）

2M NaCl 7.7ml 终浓度 154mM

1M CaCl2 12.5ml 终浓度 125mM 200mM KCl 2.5ml 终浓度 5mM 100mM MES 2ml 终浓度 2mM pH=5.7 配好后4℃保存。 4、MMg buffer （10ml）

甘露醇（182.2） 0.729g 终浓度 0.4M 50mM MgCl2 3ml 终浓度 15mM 100mM MES 0.4ml 终浓度 4mM pH=5.7 配好后-20℃保存。

5、PEG/Ca2+ buffer （10ml）

(先加CaCl2和甘露醇，用水溶了之后再加PEG，再定容) 1M CaCl2 1ml 终浓度 0.1M 甘露醇（182.2） 0.364g 终浓度 0.2M PEG-4000 4g

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