Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平文库

Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平文库

Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平

2011-05-09 吴咏梅 邓洁英 史轶蘩

【摘要】 目的 研究正常人及生长激素分泌异常病人血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的水平。方法 本文采用Western印迹方法测定20例正常人，33例活动性肢端肥大症病人和34例特发性生长激素缺乏症(IGHD)病人血清IGFBP-3水平。结果 正常成人血清中存在五种分子量不同的IGFBP，IGFBP-3含量为最高。本文测定了20例正常成人和67例生长激素分泌异常患者血清IGFBP-3的相对光密度(ROD)，正常人血清IGFBP-3含量为(1.1±0.4)ROD，活动性肢端肥大病人为(2.7±1.2)ROD，明显高于正常成人(P＜0.01)，IGHD病人为(0.4±0.2)ROD，明显低于正常成人(P＜0.01)。血清生长激素与IGFBP-3、胰岛素样生长因子-I与IGFBP-3均呈正相关(P＜0.05)。结论 Western印迹测定血清IGFBP-3正常值和病理值提示IGFBP-3浓度的变化与生长激素功能状态密切相关，并依赖GH。

【关键词】 蛋白印迹 胰岛素样生长因子结合蛋白 生长激素

Measurement of serum insulin-like growth factor binding protein-3 by Western blot

WU Yongmei,DENG Jieying,SHI Yifan.

Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College Hospital,Beijing,100730

【Abstract】 Objective To investigate serum insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) level in normal adults and patients with abnormality of growth hormone secretion. Methods Serum IGFBP-3 levels in 20 normal adults, 33 active acromegaly and 34 patients with idiopathic growth hormone deficiency (IGHD) were measured by Western blot. Results There are five kinds of IGFBPs with different molecular weight in serum of normal adult. IGFBP-3 was by far the major circulating binding protein. Serum IGFBP-3 level was found to be elevated in active acromegaly and diminished in IGHD. The relative optical density units (ROD) of IGFBP-3 were 1.1±0.4, 2.7±1.2 and 0.4±0.2 in normal adults, acromegaly and IGHD respectively. There was positive correlation between growth hormone and IGFBP-3 and between insulin-like growth factor I and IGFBP-3. Conclusion The serum levels of IGFBP-3 measured by Western blot may reflect the growth hormone secreting status. Serum level of IGFBP-3 may provide a useful index for growth hormone function.

【Key words】 Western blot Insulin-like growth factor binding protein Growth hormone

生长激素(GH)对生长的促进作用由胰岛素样生长因子(IGFs)来介导，IGFs在血液中绝大多数都与其结合蛋白(IGFBPs)结合，最近的研究表明，IGFBPs不但起运载作用，而且对IGFs的生物作用有重要的调节作用。IGFBP-3与GH轴的功能有密切的关系，本文建立血清IGFBP-3的测定方法，探讨在病理情况下，IGFBP-3与GH功能的关系。

对象和方法

一、对象

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1.正常组：20名，男女各10人，年龄19～45岁，为无肝、肾及内分泌疾病的健康献血者。

2.肢端肥大症组：33例，均为活动性肢端肥大症患者，男16人，女17人，年龄18～48岁，均有活动性肢端肥大症的临床表现，血GH水平升高，空腹平均值为32μg/L，且不被口服葡萄糖试验所抑制。

3.特发性生长激素缺乏症(IGHD)组：34例，男19人，女15人，年龄5～17岁，身材矮小，左旋多巴和胰岛素低血糖GH刺激试验血清GH不能升高到10ng/ml以上。

所有对象均要求空腹过夜后取血，取血后立即放于4℃，分离血清，-20℃保存待测。

二、方法

1.主要试剂：(1)IGFBP-3标准品：美国Diagnostic Systems Lab赠送。(2)IGFBP-3参考血清：为正常人混合血清，经IGFBP-3标准定量为6μg/ml，每次电泳时用量为5μl。(3)其它：丙烯酰胺购自Fluka公司，硝酸纤维素膜(NC)购自Bio-Rad公司。

2.IGFBPs的蛋白印迹(Western印迹)〔1〕：(1)SDS-PAGE：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%的垂直电泳。每次电泳的样品包括分子量标准、参考血清和被测血清样品。样品中加入上样缓冲液，加热变性，恒压120V，电泳7～8小时。(2)转膜：采用电转移装置，将电泳后凝胶上的血清成分转移到硝酸纤维素膜上，恒流100A，8小时。(3)蛋白印迹反应：杂交反应液(含1%BSA，0.1%Tween20,〔125I〕IGF-I 105cpm)，置4℃，反应12小时。(4)放射性自显影和读片：-80℃自显影1～3天。在激光扫描仪上读出自显影的强弱。

3.抑制实验：(1)在凝胶中线两侧对称样品孔中加入相同的血清样品，电泳。(2)转膜后，沿膜中线剪开，则成为两张蛋白含量完全相同的NC膜。(3)一张膜与含〔125I〕IGF-I反应液反应，另一张与含〔125I〕IGF-I和过量的IGF-I(约500ng)的反应液反应。(4)压片，观察两张膜自显影的变化。

4.血清GH和IGF-I的放免分析法：均采用本室建立的方法〔2〕，测定IGF-I前对血清进行酸乙醇提取，以减少IGFBPs对IGF-I测定的干扰，具体步骤略。

5.结果表示和统计学分析：每次实验都含有一个参考血清，将待检测血清样品与参考血清的自显影强度(以激光扫描仪计算出的自显影条带的面积作为自显影强度)的比值作为待检测血清的IGFBPs的相对含量，以相对光密度(ROD)为单位。GH、IGF-I、IGFBP-3三者关系采用相关分析。

结 果

一、Western印迹的方法学

1.IGFBPs的量与自显影强度的关系：当以1.5，3.0，4.5和6.0μl的正常人血清进行IGFBP-3 Western印迹分析后，其光密度(OD)则分别为0.2，1.2，2.0，3.5，见扫描图(图

1)。显示血清IGFBP-3含量与OD值呈正相关(r=0.991,P＜0.01)。

2.Western印迹的特异性——抑制实验：由图2可见当反应液中仅有〔125I〕IGF-I时，〔125I〕IGF-I与膜杂交自显影后显出的IGFBP条带，而反应液中加入过量未标记的IGF-I时，与膜杂交经自显影后所有条带消失，可见未标记的IGF-I对〔125I〕IGF-I与IGFBPs的结合有特异的抑制作用，〔125I〕IGF-I与膜上蛋白的结合是特异的。

图1 不同量血清中IGFBP-3 Western印迹放射性自显影扫描图

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2yxi.html