聚酮化合物_酮酰_ACP合酶的计算机对比分析与组合生物合成

PKS组合生物合成

微生物学通报 FEB 20, 2010, 37(2): 191 198 Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAS

tongbao@

摘 要: 为了合理地设计新的聚酮化合物提高组合生物合成的效率, 本文使用ClustalW、Mega 4.0分析了26种来自不同聚酮合酶的β-酮酰-ACP合酶结构域的序列特征, 并用ProtParam、Phdsec、Swiss-Model等工具对其中9种具有不同底物专一性的β-酮酰-ACP合酶的一级结构、二级结构和三级结构及活性位点进行了分析与预测。发现它们结构上的相似性大于序列上的相似性; 活性位点都富含丝氨酸; 底物含有2个羧酸基团的β-酮酰-ACP合酶的理论pI均小于5.0且其形式电荷总量也偏低; 序列V303ELHGTGTPLGDPIEAGA320是这26种β-酮酰-ACP合酶的一段保守序列, 但它并不与活性位点相邻。这些研究对进行聚酮合酶的模块或结构域替换以及定点突变具有重要的指导意义, 也为探讨其的进化机制提供了参考。

关键词: 聚酮化合物, β-酮酰-ACP合酶, 组合生物合成, 底物专一性

Comparison and Analysis of β-ketoacyl-ACP Synthase from Polyketide with Computer and Its Implication

on Combinatorial Biosynthesis

TANG Ying XIA Li-Qiu* WANG Hai-Long HU Sheng-Biao YU Zi-Quan SUN Yun-Jun

(Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province, College of Life Science, Hunan Normal University,

Changsha, Hunan 410081, China)

Abstract: For rational design of novel polyketides and improving the combinatorial biosynthesis of poly-ketides. 26 β-ketoacyl-ACP synthases from several polyketide synthases were analysed with ClustalW、MEGA4.0. The primary parameters, secondary, tertiary structures and active sites of nine of them with dif-ferent substrate specificity were compared or predicted in detail using ProtParam, Phdsec, Swiss-Model. The results revealed that they have more similarity in structure than in sequence and all own a high percentage of serine in their active sites; in addition, the β-ketoacyl-ACP synthases whose substrates possess two carboxyl groups were found to have a theoretical pI less than 5.0, and their formal charges sum were on the low side too; the conserved sequence of the 26 β-ketoacyl-ACP synthases is V303ELHGTGTPLGDPIEAGA320, but it is away from the active site. These conclusions have promising potential for module or domain substitution

基金项目：国家863计划项目(No. 2006AA02Z187); 国家自然科学基金项目(No. 30870064); 教育部博士点基金项目(No. 20060542006) *通讯作者：

Tel: 86-731-88872298; : xialq@ 收稿日期：2009-06-15; 接受日期：2009-08-04

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and site-specific mutation of polyketide synthases; also providing a reference for the study of their evolution mechanism.

Keywords: Polyketide, β-ketoacyl-ACP synthase, Combinatorial biosynthesis, Substrate specificity 聚酮化合物(Polyketide)是一类由细菌、真菌和植物以各种低级羧酸为底物进行连续缩合反应产生的次级代谢产物, 包括治疗细菌感染的红霉素(Erythromycin)、竹桃霉素(Oleandomycin); 抑制真菌的Soraphen、粘液噻唑(Myxothiazol); 消灭寄生虫的阿维菌素(Avermectin); 对昆虫有毒杀作用的多杀菌素(Spinosyn); 具有抑癌活性的埃博霉素(Epothilone); 以及免疫抑制剂子囊霉素(Ascomycin)等, 它们被广泛地应用于医药、畜牧和农业[1 3]。聚酮化合物都是由相应的聚酮合酶(Polyketide syn-thase, PKS)催化合成的。大多数PKS都是由几个多功能的多肽组成, 每一个多肽上分别携带有参与聚酮生物合成所必需的各种具有不同催化功能的结构域(Domain), 包括酰基转移酶(Acyltransferase do-main, AT)、酰基载体蛋白(Acyl carrier protein, ACP)、β-酮酰-ACP合酶(β-Ketoacyl-ACP synthase, KS)、酮还原酶(Ketoreductase, KR)、脱水酶(Dehydratase, DH)、烯酰还原酶(Enoyl reductase, ER)、硫酯酶(Thioesterase, TE)等。负责延伸1个二碳单位的所有结构域称为1个模块(Module)[4 5]。聚酮化合物的合成类似于脂肪酸的合成, 底物丙酸、乙酸、甘油酸等在PKS各结构域的作用下不断被聚合形成碳链, 然后环化, 经糖基修饰后成为有功能的聚酮化合物。

聚酮链合成的底物选择、还原程度和产物的立体化学构型都是由PKS上相应模块中的结构域决定的。其中酰基转移酶功能域可以特异性地决定所选择的酰基辅酶A的种类[6 7], 而β-酮酰-ACP合酶负责将这些酰基辅酶A装配到延伸中的碳链上[8 9]。PKS中模块的数量则决定合成的聚酮化合物的碳链的长度。正丁烯基多杀菌素的PKS比多杀菌素的PKS多了1个模块, 因此它的21位碳原子上比多杀菌素多了2个碳原子。

研究各种来源不同、结构各异的聚酮化合物PKS的不同结构域, 分析其氨基酸序列、三维结构、功能及底物专一性, 有助于更有效地应用聚酮合酶开发新型抗生素。已有实验表明通过突变决定酰基转移酶底物专一性的基序可以改变其底物专一

性[10 11]。多数情况下, 通过结构域置换得到的“杂合”聚酮合酶催化非天然聚酮合成的效率远远低于野生型。聚酮化合物的模块替换也大多都得不到产量高的产物。这很可能是因为杂合模块的其它催化位点或下游模块对延伸单位的限制[12]。Peter JB等通过体外实验证实在非核糖体肽聚酮化合物的合成过程中, 负责催化缩合反应的酶对延伸单位具有严格的专一性, 能够影响链延伸的效率[13]。这些足以说明β-酮酰-ACP合酶在组合生物合成中扮演着非常重要的角色, 要提高聚酮化合物组合生物合成的效率, 必须同时考虑酰基转移酶和β-酮酰-ACP合酶的底物专一性及他们之间的兼容性。

在脂肪酸的合成过程中, β-酮酰-ACP合酶(FabB、FabF、FabH)也起着非常重要的作用, 是许多新型抗菌药物的靶标位点[14]。因此脂肪酸合酶(FAS)中的β-酮酰-ACP合酶的部分结构、功能及性质已被研究的较为透彻。而在PKS的组合生物合成中, 有关酰基转移酶的报道较多, 但对β-酮酰-ACP合酶的关注相对较少。

本文从多杀菌素等多种聚酮化合物PKS各模块中挑选了26种具有不同底物专一性的β-酮酰-ACP合酶来进行分析, 其中包括尼达霉素PKS模块5中的β-酮酰-ACP合酶、红霉素PKS模块5中的β-酮酰-ACP合酶等[15], 这些分析对指导聚酮化合物的组合生物合成具有重要的意义; 也为探讨其的进化机制提供了参考。

1 材料和方法

1.1 一级结构及基本参数的比较

通过搜索美国国立生物技术信息中心(NCBI)蛋

白质序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)及聚酮化合物序列数据库(http://www.nii.res.in/searchpks. html)[15], 获得26种β-酮酰-ACP合酶的蛋白质全长序列。使用在线蛋白质序列分析工具ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam/html)计算了其中9种具有代表性的β-酮酰-ACP合酶的分子量、理论等电点、带正电荷的氨基酸和带负电荷的氨基酸

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数目。用Pymol程序分析它们表面静电势的分布情况并计算其形式电荷总量(Formal charges sum)。形式电荷总量是对表面静电势的直观描述。

氨基酸残基数, N0 为参与比对氨基酸残基数中值, α＝0.15[17]。

1.2 多序列比对及系统树

在线使用ClustalW 2 (http://www.ebi.uk.ac)对26

种β-酮酰-ACP合酶进行多序列比对, 得到反应它们之间相似性程度的分值。用MEGA4.0 (Molecular evolutionary genetics analysis)软件根据距离依靠法来构建系统树[16], 分析它们之间的同源性。树枝上的数字表示Bootstrap验证中该树枝的可信度; 系统树的拓扑形状由两两序列间的进化距离决定。

2 结果与分析

2.1 一级结构和基本参数比较

根据组成蛋白质的20种氨基酸的物理和化学

性质, 可以从理论上分析已知序列的蛋白质物化性质。比较这9种β-酮酰-ACP合酶的基本参数(表1), 发现它们的理论等电点都在5.0左右, 带负电荷的氨基酸数目多于带正电荷的氨基酸数目(其比值范围为1.56 1.16)。底物(图1)含有2个羧酸根的β-酮酰-ACP合酶的理论等电点都在5.0以下且其形式电荷总量也偏低(其值为 19、 20)。蛋白质与蛋白质之间的相互作用及蛋白质周围的电荷环境主要取决于静电和疏水相互作用, 所以该酶的表面静电势分布不仅能影响其与其他酶结构域之间的相互作用, 也能影响它周围的酸碱环境。这些含有2个羧酸根的底物必须先脱羧然后才能被加载到碳链上, 偏低的等电点和形式电荷总量在pH 7.0左右的生理环境下, 能够使该酶聚集较多的H+推动脱羧反应向正方向进行。

1.3 二级结构的分析

在线使用工具PHDsec分析9种β-酮酰-ACP合

酶的二级结构, 分别预测其α螺旋(α-Helix)、β折叠主链(Extended strand)、无规则卷曲(Random coil)的百分含量。

1.4 三维结构的预测

登陆//Swiss-Model.

html, 按提示输入内容及蛋白质序列, 获得相应序列的最初原子模型(PDB文件)。通过SwissPdb- Viewer软件查看、修改, 再退回网站以优化模型。然后用ERRAT验证预测的模型是否合理。ERRAT能对模型中所有原子间的相互作用进行评价, 得分高于50就被认为是可以接受的, 得分越高表明所构建的模型质量越好。最后用该软件进行编辑和对比并计算α 碳原子距离均方根, 然后转换成SD值以更直观的反映它们结构上的差异。差异性计算式为SD＝RMS/(Nm/N0)α, 其中SD 为结构差异性, RMS为联配氨基酸残基α 碳原子距离均方根, Nm为联配

2.2 多序列比对及进化树

ClustalW 2的分析结果表明, 来自同一聚酮

合酶不同模块中的β-酮酰-ACP合酶之间的相似性较高, SoraphenPKS模块3和4中的β-酮酰-ACP合酶比对得分为91; 来自不同聚酮合酶而催化底物相同的β-酮酰-ACP合酶也具有较高的相似性, 巨霉素PKS和红霉素PKS装载模块中的β-酮酰- ACP合酶的底物都是丙酰-ACP, 它们的比对得分为88。

表1 9种β-酮酰-ACP合酶的基本参数比较

Table 1 Comparison of the primary parameters of the nine β-ketoacyl-ACP synthases

聚酮化合物Polyketide Erythromycin Megalomicin Myxothiazol Ascomycin Soraphen Ascomycin Oleandomycin Erythromycin Soraphen

蛋白质序列号Protein ID AAQ94247.1 BAA76543.1 AAF19810.1 AAF86396.1 AAA79984.2 AAF86393.1 CAG14965.1 AAQ94246.1 AAK19883.1

模块Module 5 1 1 7 7 4 1 1 1

蛋白质全长Protein full length

416 426 424 421 428 416 417 426 425

等电点pI 4.61 5.43 5.91 4.81 5.22 4.90 5.19 5.22 5.34

Asp + Glu 53 46 44 47 51 46 46 47 48

Arg + Lys 34 34 38 27 34 27 34 34 36

底物 Substrate Methyl-malonate Propionate 3-me-butyrate O-me-malonate Glycerate Ethyl-malonate

Acerate Propionate Benzoate

形式电荷总量

Formal charges sum

19 12 6 20 17 19 12 13 12

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通过比对还发现, 序列V303ELHGTGTPLGDPI EAGA320是这26种来自不同物种、催化底物各不相同的β-酮酰-ACP合酶的一段保守序列, 其在预测的三维结构中是1个α螺旋(图2), 且不与活性位点相邻。这段仅含有18个氨基酸的保守序列中含有2个苏氨酸、2个谷氨酸、1个天冬氨酸及1个组氨酸, 这些氨基酸是原核生物主要的磷酸化位点, 因此该区

域很可能是酶的一个关键调控区域。使结核杆菌的β-酮酰-ACP合酶III的第45位苏氨酸磷酸化能抑制该酶的活性, 虽然这个苏氨酸位于底物进入活性位点的通道上, 而不是活性位点[18]。这说明细菌是可以通过磷酸化来调节这个酶的活性的。这个区域也可能参与维持蛋白质的构象或负责与PKS中其他结构域之间的相互作用。

图1 部分底物的羧酸形式

Fig. 1 The carboxylic acid form of some of the substrates

A

图2 β-酮酰-ACP合酶三维结构的预测及比较

Fig. 2 Prediction and comparison of the tertiary structures of β-ketoacyl-ACP synthases

注: A: Ascom07 (黄) + Ery05 (浅蓝); B: Ery05 (浅蓝) + EryLD (蓝); C: MegalLD (红) + EryLD (蓝); D: OleanLD (绿) + Ascom07 (黄); E: MyxalamideLD (白) + Ascom07 (黄); F: EryLD (蓝) + SoraLD (粉红). 白色箭头所指的紫色区域表示26种β-酮酰-ACP合酶的保守序列所对应的区域; 红色箭头所指的紫色区域表示活性位点对应的区域. 子囊霉素PKS模块7中的β-酮酰-ACP合酶被简写为Ascom07. 下同. Note: A: Ascom07 (yellow) + Ery05 (cambridge blue); B: Ery05 (cambridge blue) + EryLD (blue); C: MegalLD (red) + EryLD (blue); D: OleanLD (green) + Ascom07 (yellow); E: MyxalamideLD (white) + Ascom07 (yellow); F: EryLD (blue) + SoraLD (pink). The white arrow indicates regions corresponding to the conserved sequences in 26 β-ketoacyl-ACP synthases; while red arrow represents the active sites which are both in purple. β-ketoacyl-ACP synthases in Ascomycin PKS module07 is abbreviated to Ascom07. The same as follows.

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应用MEGA4.0软件构建系统树(图3), 对其同源性进行分析, 发现不同β-酮酰-ACP合酶之间的同源性与它们所属的PKS相关, 同时也与其底物特异性相关。比如: 子囊霉素PKS模块4和7中的β-酮酰-ACP合酶的底物分别是乙基丙二酰-ACP和氧甲基丙二酰-ACP, 它们之间具有较高的同源性; 巨霉素PKS和红霉素PKS装载模块中的β-酮酰-ACP合酶虽来自不同的物种, 但它们的底物都是丙酰- ACP, 它们之间的同源性也较高。

从系统树中还可以看出不同PKS装载模块中的β-酮酰-ACP合酶之间具有较高同源性; 而延伸模块中的β-酮酰-ACP合酶的同源性与其所在的PKS具有较大的正相关性, 这表明PKS装载模件和延伸模

件很可能具有不同的进化策略。

2.3 二级结构的分析

蛋白质二级结构的预测通常是蛋白质结构预测

的第一步。虽然9种β-酮酰-ACP合酶在序列上有很大差异, 催化的底物也各不相同, 但从表2可看出它们形成α螺旋、β折叠主链和无规则卷曲等构象的趋势非常接近。这很可能是因为它们催化的是同一类型的反应。其中预测的Soraphen PKS模块7中的β-酮酰-ACP合酶形成的α 螺旋含量最高, 而子囊霉素PKS模块7中的β-酮酰-ACP合酶形成的无规则卷曲含量最高。但这些微小的差异不是造成其具有不同底物专一性的原因。

图3 26种β-酮酰-ACP合酶全序列系统树

Fig. 3 Phylogenetic tree of full length sequences of the 26 β-ketoacyl-ACP synthases

注: 树枝上的数字表示Bootstrap验证中该树枝的可信度. 线状比例尺表示遗传距离. 其后依次是菌株名称, 其合成的聚酮化合物, β-酮酰-ACP合酶所在的模块, 括号内是GenBank登录号.

Note: The number at each branch points is percentage supported by Bootstrap. The scale bar indicates the genetic distance. The strain name,

polyketide produced by it, the module the β-ketoacyl-ACP synthase belongs to, GenBank accession number is followed in turn.

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2.4 三维结构预测

酶的功能很大程度取决于其空间结构, 因而研

究PKS中各酶的空间结构在组合生物合成中有着极其重要的意义。组成大多数聚酮合酶的氨基酸的数量都超过10000, 其分子量高达1100 kD, 单个模块的平均长度也有2000多个氨基酸, 要想完整地预测某个聚酮合酶的三维结构是很困难的。目前还没有

图4 红霉素PKS装载模块β-酮酰-ACP合酶侧面观

Fig. 4 Side face of β-ketoacyl-ACP synthase in Erythromy-cin PKS loading module

完整地解析聚酮合酶的三维结构的报道, 因此只能通过三维结构预测来分析其空间结构。

对9种β-酮酰-ACP合酶的三维结构进行预测, 预测的结果用ERRAT验证, 得分均在77.59 94.514之间, 表明构建的模型都是合理的。从图4可以看出β-酮酰-ACP合酶的三维结构主要由α螺旋和β折叠构成, 所有的β折叠形成了一个β折叠桶。用SwissPdb-Viewer软件对活性位点进行分析发现活性位点位于β折叠桶中的1个α螺旋上(图2紫色区2个或3个Ser(表3), 而域), 其序列中含有1个Cyc、

E. coli的脂肪酸合酶中的β-酮酰-ACP合酶(FabB)的活性口袋中的3个关键氨基酸残基分别是Cys163、His298、His333, 其中 Cys163残基的-SH与正在延伸的碳链末端的酰基相结合, 底物被ACP活化后通过与活性位点的其他氨基酸残基形成氢键来完成缩合反应, 从而导致碳链的延长[19]。虽然针对该活性位点进行了许多研究包括晶体结构解析, 但对活性位点上其他残基的确切功能了解得还不是很透彻。两者活性位点上的残基不是完全一致的, 极有可能是因为脂肪酸的合成是初级代谢而聚酮的合成属于次级代谢, 它们具有不同的进化机制。由此可见, 活性位点的这些氨基酸残基对这个酶的生物学功能是至关重要的。从表3中还可以看出第6位、倒数第5位以及最后一位氨基酸残基保守性没有其他氯基酸残基高, 这3个位点可作为定点突变的目标位点。

对这9种β-酮酰-ACP合酶的三维结构进行对比, 发现除了某些环以外, 其他大部分结构都可以重叠, 这些不能重叠的环很可能是他们具有不同底物专一性的原因。图2列出了其中6对差异较大的β-酮酰-ACP合酶的三维结构(A F的SD值分别为2.17、1.95、1.91、1.83、3.12、2.76)。值得一提的是巨霉素PKS与红霉素PKS装载模块的β-酮酰-ACP合酶的空间结构也十分相似(SD值仅为0.04)。

表2 9种β-酮酰-ACP合酶二级结构预测

Table 2 Prediction of the secondary structures of the 9

β-ketoacyl-ACP synthases

聚酮化合物Polyketide Erythromycin Megalomicin Myxothiazol Ascomycin Soraphen Ascomycin Oleandomycin Erythromycin Soraphen

模块Module 5 1 1 7 7 4 1 1 1

α螺旋β折叠主链无规则卷曲Alpha Extended Random coil helix (%)strand (%) (%) 25.96 26.76 31.13 23.28 36.45 35.10 28.78 26.29 27.53

19.95 20.19 18.87 17.34 13.79 17.07 19.66 16.67 18.82

54.09 53.05 50.00 59.38 49.77 47.84 51.56 57.04 53.65

表3 活性位点的序列

Table 3 Sequences of the active sites

聚酮化合物

Polyketide Erythromycin Megalomicin Myxothiazol Ascomycin Soraphen Ascomycin Oleandomycin Erythromycin Soraphen

模块Module 5 1 1 7 7 4 1 1 1

活性位点的序列

Sequence of the active site Gly152- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Leu168 Gly190- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Val206 Gly162- - - - Ile-

-AlaCycSerSerSer- - -Ile178 Gly159- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Leu175 Gly162- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Leu178 Gly- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Leu175 Gly153- - - - Val-

-AlaCycSerSerSer- - -Leu169 Gly- - - - Val-

-AlaCycSerSerGly- - -Val180 Gly163- - - - Val-

-AlaCycSerSerAla - - -Ile179

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3 结论和讨论

虽然将单个β-酮酰-ACP合酶结构域从聚酮合酶中抽出来研究使其脱离了它原来的生理环境, 但已有实验证明脱离聚酮合酶的结构域也能发挥其原有的功能[20]; 有的聚酮化合物如雷拉霉素(Leinamycin)生物合成所需的酰基转移酶结构域甚至位于其基因簇之外[21]。各β-酮酰-ACP合酶的一级结构差异很大, 但二级结构的比较表明它们形成各种二级构象的趋势非常接近, 与其三维空间结构的极相似性一致。三维结构上的细微差别主要体现在一些不能重叠的环上, 可能是造成其具有不同底物专一性的原因; 活性位点除都含有一个半胱氨酸之外还均富含丝氨酸; 结构上的相似性大于序列上的相似性。结合其底物专一性对系统树进行分析的结果表明不同的β-酮酰-ACP合酶之间的同源性与他们所属的物种及其底物专一性相关。底物含有2个羧酸根的β-酮酰-ACP合酶, 他们的理论等电点都在5.0以下且其形式电荷总量也偏低(其值为 19、 20)。通过多序列比对发现, 序列V

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酮化合物提供理论指导。

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LGDPIEAGA320为26种来自不同物种、催化底物各不相同的β-酮酰-ACP合酶的一段保守序列, 但它并不与活性位点相邻, 极有可能是该酶的关键调控位点。虽然暂时还没有实验数据来证明这一点, 但这很有趣也很值得研究。

在聚酮化合物生物合成中, 组成其骨架的碳链每延伸一个单位都需要上下游2个模块中具有相应底物专一性的酰基转移酶和β-酮酰-ACP合酶的共同参与。因此, 应该挑选一些对底物要求较宽松的或底物化学结构相近的结构域进行替换; 同时还可通过向培养基中添加与底物结构相似的低级羧酸盐来合成新的聚酮化合物; 运用定点突变技术改变决定结构域底物专一性的基序[10], 也是提高组合生物合成成功率的方法之一。

运用生物信息学软件对PKS进行结构分析, 不仅有助于揭示PKS中各结构域的分子结构和相互作用机理, 同时对PKS的进化策略的研究也具有重要的意义。若能在建立同源模型数据库的基础上, 对整个聚酮合酶进行结构预测, 将进一步缩小预测结构与真实结构之间的误差, 更准确的体现聚酮合酶的各种特征, 为利用各种手段改造PKS合成新的聚

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2010年部分生物、农林类学术期刊联合征订表(2-1)

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