PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成_戴军
更新时间:2023-05-01 08:25:01 阅读量: 实用文档 文档下载
- 高效液相柱前衍生法原理推荐度:
- 相关推荐
第26卷第2期2007年3月 分析测试学报
FENXI CESH I X UEBAO(J ournal of Ins tru m en talAnal ys i s)
V ol 26No 2
206~210 P MP柱前衍生高效液相色谱法分析
杜氏盐藻多糖的单糖组成
戴 军1,2,朱 松1,汤 坚1,2,王 3,尹鸿萍3,陈尚卫1
(1.江南大学 分析测试中心,江苏 无锡 214036;2.江南大学 食品科学与安全教育部重点实验室,
江苏 无锡 214036;3.中国药科大学 生命科学学院,江苏 南京 210009)摘 要:建立了柱前PM P衍生高效液相色谱法分离检测8种中性糖、2种糖醛酸及2种糖胺的方法。筛选出适合PM P衍生物分离的色谱柱为E cli pse XDB C
18
,以0 1m ol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相,考察了p H值和乙腈体积分数对各种糖的PM P衍生物的保留及分离的影响,确定最佳p H值为6 7,最佳乙腈体积分数为17%;比较了不同衍生反应时间和萃取除杂前不同量盐酸中和反应产物时醛糖-PM P衍生物的峰面积大小变化,从而得到较佳的样品衍生化条件。应用优化的色谱条件和样品制备方法,测定了由杜氏盐藻提取纯化的多糖级分PD4a和PD4b的单糖组成,其测定结果与高效阴离子交换色谱法的结果基本一致。
关键词:杜氏盐藻;多糖;单糖;高效液相色谱;柱前衍生化;1 苯基 3 甲基 5 吡唑啉酮
中图分类号:O657 72;O629 112 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2007)02-0206-05
A nal ysi s ofM onosacchari de Co mpositi ons i n Po l ysacchari des fro m D Salina
by Pre co l u mn D eri vati zati on H i gh Perf or m ance L i qui d Chro m atography
DA I Jun1,2,Z HU Song1,TANG Jian1,2,WANG M i n3,Y I N H ong p i n g3,C H EN Shang w ei1
(1.T esti ng&A nalysis Cente r o f Southe rn Y angtze U n i versity,W ux i 214036,Ch i na;2.K ey L aboratory of
F ood Science and Sa fety,M i n istry o f Educati on,Sou t hern Y ang tze U niversit y,W ux i 214036,Chi na;
3.Co llege of L ife Science,Ch i na P harmaceuti ca lU n i versity,N an ji ng 210009,China)
Abstrac:t A si m p le and sensitive h i g h perfor m ance liquid chro m atograph ic m ethod for si m u ltaneous deter m i n ation o f eight k i n ds of neutra lm onosaccharides,t w o k i n ds of ur onic acid and t w o kinds of g ly cosa m i n e by pre colu m n derivatization w it h1 phenyl 3 m ethy l 5 pyrazolone(P MP)has been deve l oped.The effects of volum e rati o s o f aceton itrile to phosphate buffer and pH ofm ob ile phase on reten ti o n and separati o n of P M P deriva ti v es of the ten m onosaccharides w ere i n vestigated w ith E clipse XPB C18Co l u m n(4 6mm 250mm).The results sho w ed that the opti m um volum e ratio of aceton itrile to buffer w as17 83and that the p H w as6 7.The variations o f the peak areas o fm onosacchari d es deriv atives due to d ifferent reaction ti m es and a m ounts ofHC l f o r neutra liza ti o n of the reacti o n syste m s w ere co m pared to obta i n better sa m p le preparation conditions.The deve l o ped m ethod w as successfully ap plied to the analyses o fm onosacchari d e co m positions i n the po lysacchari d e fractions(PD4a and PD4b) fro m Duanaliella Salina(D Salina).The ana l y tica l resu lts obta i n ed on the whole ag reed w ith those ob tained by high perfor m ance anion exchange chro m atography w ith pulsed a m pero m etric detecti o n.
Key words:Duanaliella salina;Polysaccharides;M onosacchari d e;H i g h perfor m ance liquid chro m a tography;Pre co lu m n der i v atization;1 Phenyl 3 m ethy l 5 py razo l o ne
杜氏盐藻(Duanaliella Salina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物,人工大规模培养杜氏盐藻主要用于提取 胡萝卜素。其提取后的藻渣中存在含量丰富的多糖类物质,由于具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性,其研究开发具有重要意义[1-2]。而盐藻多糖的单糖组成的分析是其性质、结构及构效关系研究的一项基本且重要的内容。由于单糖极性较强,结构相近,且缺乏光学活性,故为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度,人们常将多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检测[3-6]。其中1 苯基 3 甲基 5 吡唑啉酮(P MP)柱前衍生化高效液相色谱法反应条件较温和,产物无立收稿日期:2006-10-25;修回日期:2006-12-25
基金项目:云南省省院省校科技合作项目(2001M AABA00A028)
作者简介:戴 军(1958-),男,江苏盐城人,副研究员,硕士;汤 坚,联系人,T e:l0510-********,E-m ai:l daihplc@163 co m
207第2期戴 军等:P M P柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成
体异构,紫外检测灵敏度较高,故得到较为广泛的应用[6-9]。本文针对多糖中可能含有的单糖种类较多的特点,在前人工作的基础上,对该方法进一步进行了较系统深入的优化研究,从多种不同反相柱中筛选出分离选择性较好的Ec lipse XDB C18柱,以0 1m o l/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相考察了乙腈比例和p H值对8种中性糖和2种糖醛酸的P M P衍生物的保留值及分离效果的影响,比较了不同反应时间的衍生产物峰面积大小和衍生反应后使用不同量盐酸中和体系时的后续萃取效果,并利用优化的方法测定了杜氏盐藻多糖的单糖组成。同时用离子色谱法对其结果进行了验证比较,两方法的分析结果基本一致。
1 实验部分
1 1 仪器与试剂
Ag ilent1100高效液相色谱仪,包括G1311A四元泵,G1315B DAD检测器,G1313A自动进样器, G1379A在线脱气机,G1316A柱温箱,Ag ilent1100化学工作站(美国Ag il e nt公司);I CS3000离子色谱仪(美国D ionex公司)。
衍生化试剂:1 苯基 3 甲基 5 吡唑啉酮(P MP),纯度99%(美国A cros O r gan ics公司);乙腈, H PLC级(美国Tedia公司);三氟乙酸,纯度不低于99%(国药集团化学试剂有限公司)。
单糖标准品:葡萄糖(G lc,99%)、甘露糖(M an,99%)、半乳糖(Ga,l 99%)均购于上海化学试剂公司;鼠李糖(Rha m, 99%)、岩藻糖(Fuc, 99%)、葡萄糖醛酸(G lc UA, 99%)、半乳糖醛酸(Ga l U A, 97%)均为美国S i g m a-A l d rich公司产品;木糖(Xy,l98%)、氨基葡萄糖(G lc N,98%)、氨基半乳糖(Gal N,99%)均为美国A cros Organics公司产品;核糖(R i b,>99 0%)、阿拉伯糖(A ra,99%)均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。超纯水;其它试剂均为分析纯。
杜氏盐藻多糖用内蒙古兰太生物工程公司提供的杜氏盐藻粉提取和纯化制得[10]。
1 2 混合单糖标样的衍生
分别取100 L的混合单糖标准液(各单糖质量浓度均为0 36g/L左右)与100 L的0 6m ol/L N a OH溶液,置于1mL的具塞试管中混合均匀;再取50 L的混合液于5mL的具塞试管中,加50 L 0 5m o l/L的P M P(0 4355g/5mL)甲醇溶液,漩涡混匀;在70 烘箱中反应100m in;取出放置10 m in冷却至室温;加50 L0 3m o l/L的H C l中和;加水至1m L,再加等体积的氯仿,振摇,静置,弃去氯仿相,如此萃取3次。将水相用0 45 m微孔膜过滤后供H PLC进样分析。
1 3 样品制备
吸取100 L质量浓度为4~5g/L的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中,加入100 L的4 m o l/L TFA,充N2封管,110 烘箱中水解2h[7,9];冷却后打开盖,加200 L甲醇后用N2吹干,如此重复加甲醇并用N2吹3次,去除TF A;加入50 L0 3m o l/L N a OH溶液充分溶解残渣,再加50 L 0 5m ol/L的P M P甲醇溶液,漩涡混匀,同样在70 的烘箱中反应100m i n,冷却后按 1 2 同法中和、萃取,并用微孔膜过滤。
1 4 色谱条件
1 4 1 液相色谱条件 色谱柱:ZORBAX E clipse XDB C18,250mm 4 6mm i d ,5 m;流动相: 0 1m o l/L磷酸盐(p H6 7)缓冲液-乙腈(体积比为83 17);柱温:30 ;检测波长:250nm;流速:1mL/m in;进样体积:20 L。
1 4
2 离子色谱条件 色谱柱:CarboPac PA203mm 150mm;流动相:A为H2O,B为250mm ol/L N a OH,C为1m o l/L N a Ac,三元梯度洗脱程序:0~21 0mm,99 2%A,0 8%B,0%C;21 1m in, 94 2%A,0 8%B,5%C;30 0m in,79 2%A,0 8%B,20%C;30 1~50 0m in,20%A,80%B, 0%C。流速:0 5mL/m in;积分脉冲安培检测器,金电极,四电位波形。进样体积:20 L。
2 结果与讨论
2 1 色谱柱的选择
以0 1m o l/L磷酸盐(pH6 7)缓冲液-乙腈(体积比为83 17)为流动相,分别试用W atersA tlantis
分析测试学报第26卷
dC 18、W aters Sy mm etry C 18、Z ORB AX Extend C 18、ZORB AX Ec li p se XDB C 18、H ypersilAA ODS 、Venusil XDP C 186种不同反相柱(均为250mm 4 6mm i d ,5 m )进行 1 1 中所述8种中性糖和2种糖醛酸的分离,结果表明ZORB AX E cli p se XDB-C 18柱分离效果较好,且分析时间较短(图1)。
2 2 流动相p H 及乙腈体积分数对分离的影响
以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相反相分离P M P-醛糖衍生物时,缓冲液的pH 是一重要的影响因
素,文献选用的p H 大多为5~6左右[6,8,10]。本文先用0 1m o l/L 磷酸盐缓冲液(pH 6 0)-乙腈作流
动相,考察了乙腈比例对上述8种中性糖和2种糖醛酸在ZORBAX E clipse XDB C 18柱上的保留值及分离效果的影响,结果显示:乙腈的体积分数为17%时分离较好。实验进一步考察了缓冲液的p H 对各种糖的保留值及分离效果的影响。结果表明:pH 为6 7左右时分离效果最佳,分析时间较短,出峰间距较均匀。图1显示在该最佳条件下两种糖胺也可与这8种中性糖和2种糖醛酸同时分离(
两组混标色谱图显示于同一坐标中)。本文方法不需
梯度洗脱即可同时实现12种单糖-P M P 衍生物
的分离,比文献中的分离效果好,且同时分离的
单糖较多。
2 3 衍生化反应时间的选择
文献中的衍生化反应时间大多为30
m in [6-7,9],个别选用2h [8]
。本文在其它条件(如 1 2 所述)相同情况下,将上述8种中性糖和2
种糖醛酸的混合标样分别采用不同反应时间(30、
50、70、100和120m in)进行衍生化,考察衍生化
产物的峰面积大小变化,结果表明:反应时间为
100m in 时各种糖的P MP 衍生产物的峰面积均为
最大值,70m i n 次之;100m in 时各种糖的P MP
衍生产物总的峰面积比30m i n 大30%左右,故
衍生化反应时间选为100m in 。
2 4 酸度对萃取效果的影响
衍生反应完成后,为去除过量的衍生化试
剂,需用氯仿萃取。由于如图2所示的P M P-醛
糖衍生产物的化学结构中含有碱性基团(在较高
p H 值时不解离,因而易被氯仿萃取而损失),故
在萃取前中和反应体系中的碱所用的盐酸量对糖
的P M P 衍生物在萃取过程中的定量回收或损失
应有一定的影响。若中和不够,p H 较高,糖的
P M P 衍生物在氯仿中有一定的溶解度,在萃取中
的损失较显著[7]。因此文献中有使用等当量的盐酸中和反应液中的氢氧化钠[6],也有使用过量的盐酸
中和使pH 为酸性(p H 3~4[7]或4~5[8],即相当于本法中使用57 L 或62 L 的HC l 中和)。本文考察
比较了不同体积(50、57、62、67 L)的H C l(0 3mo l/L)中和后的萃取效果,结果表明,使用等当量的盐酸(50 L)中和即可,此时大多数单糖-P M P 衍生物的峰面积较大,且10种糖衍生物的总的峰面积最大。此现象说明p H 值太低也会增大单糖-P MP 衍生物的损失,这可能是因为在酸性条件下,衍生产物不太稳定。
2 5 检测线性及检出限
将8种中性糖和2种糖醛酸配制成一系列不同浓度的混合标样,分别按 1 2 衍生化,并在 1 4 所述条件下进样检测,以测得的各种糖的峰面积对相应浓度作工作曲线,结果见表1。以3倍信噪比计得这10种单糖的检出限为0 081~0 271nm o l(表1)。由此可见,本方法的检测线性很好,线性范围较宽,检测灵敏度较高。208
第2期戴 军等:P M P 柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成
表1 方法的检测线性及检出限
T ab le 1 Ca li bra ti on curves and de tecti on li m its o f ten m onosaccharides
Sugar Regression equation C orrelati on coeffi cient
R 2
L i near range
c /(mm ol L)Detection li m it
n /nm ol M an Y =373.81X +2.06510.99990.0104~8.330.081
R i b
Y =371.06X -5.54320.99980.0117~9.380.12Rha m Y =373.4X +5.04640.99980.0114~9.090.17G lc UA Y =342.33X -21.7280.99830.00964~7.720.20Gal U A Y =406.76X -12.7110.99960.0101~8.060.20G lc Y =336.34X -6.53530.99980.0102~8.150.13Gal Y =406.73X -7.06650.99980.0103~8.210.16Xyl Y =312.22X -10.0840.99950.0124~9.910.27A ra Y =389.78X -6.50080.99990.0122~9.760.14Fu c
Y =375.58X -3.0272
0.9998
0.0114~9.08
0.10
Y :peak area ;X :s ugar concentrati on (mmo l/L )
2 6 杜氏盐藻多糖的单糖组成测定
按 1 3 中的水解和衍生化方法及 1 4 中的色谱条件测定了纯化后的两个主要盐藻活性多糖级分[10]
的单糖组成,其结果和色谱分离图谱见表2和图3。PD4a 和PD4b 的各糖组分峰的定性除据保留
时间和DAD 紫外光谱图外,还用液相色谱-质谱联用分析给予验证(LC -M S 分析内容另文发表)。在PD4a 图谱中,分别靠近核糖(R i b )和葡萄糖(G lc)峰前均有一小峰,两者保留时间分别与葡萄糖胺和半乳糖胺标样的P MP 衍生物保留时间很接近,但用LC -M S 分析证实这两峰均不是糖胺。为了以不同方
法验证本文方法的定量结果,同时用离子色谱法[11]
也测定了这两个多糖级分水解后的单糖组成,其结果与P MP 柱前衍生化法基本一致(见表2)。
表2 杜氏盐藻多糖级分PD4a 和PD 4b 的单糖组成(摩尔分数x /%,n =3)
T able 2 M onosaccharr i de co m positi ons o f t wo po lysaccha ri de fracti ons(PD4a and PD 4b)from D salina (mo l fraction x /%,n =3)
Fracti on M et hod M an
Average RSD s r /%R i b
Average RSD s r /%Rh a m
A verage RSD s r /%G lc UA
Average RSD s r /%Gal U A
Average RSD s r /%PD4a P M P
1.573.54
1.323.17
2.36
3.22
0.785.22
1.64 4.80I C 1.55
2.72 1.33
3.242.87 3.980.81
4.87 1.70 4.32PD4b
P M P 0.874.8768.112.920.75 3.040.00/0.00/I C 0.83
3.79
67.96
2.65
0.69
4.02
0.00
/
0.00
/
Fracti on M et hod G lc
Average RSD s r /%Gal
Average RSD s r /%Xyl
A verage RSD s r /%A ra
Average RSD s r /%Fu c
Average RSD s r /%PD4a P M P 5.183.31
31.533.2424.36 2.93
26.963.29
4.30 2.87I C
5.542.1632.062.5722.38 2.842
6.923.05 4.84 3.19PD4b
P M P 8.212.077.812.226.84 3.166.473.730.94 3.45I C
8.17
2.13
7.89
2.30
6.88
2.29
6.54
3.97
1.04
3.
06
图3 杜氏盐藻多糖级分PD 4a 和PD 4b 水解样品的PM P 衍生化产物的色谱图
F i g 3 Chro m a t og ram s of P M P derivati ves of ac i d hydrolyza tes of t wo polysaccha ri de frac tions(PD4a and
PD4b)from D salina
3 结 论
本文建立的P M P 柱前衍生化高效液相色谱分析单糖的方法准确可靠,灵敏度较高,可同时分离检
209
210
分析测试学报第26卷
测的单糖数量较多,取样量少,且分离效果较理想。本法尤其适用于微量多糖样品的单糖组成测定。
由本法测定的杜氏盐藻活性多糖级分的结果显示,PD4a中主要含有半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖及盐藻糖5种中性糖,还含有少量糖醛酸;另一种多糖级分PD4b中主要含有核糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及木糖5种中性糖,不含糖醛酸。
致谢:戴安中国有限公司北京应用研究中心的梁立娜博士和上海农科院食用菌研究所的刘艳芳工程师对本文的离子色谱分析实验给予热心帮助,谨表衷心谢意!
参考文献:
[1] 丁 新,李玲凤.关于盐藻多糖的研究[J].海湖盐与化工,1996,24(6):4-6.
[2] FABREGAS J,GARCI A D,FERNANDEZ-ALON SO M.In v itro i nhi b iti on o f the repli cation of hae m o rrhag ic septicae m i a
v irus(VHSV)and A fr i can s w i ne fever v irus(ASFV)by ex tracts from m arine m icroa lgae[J].A ntiv i ra l R es,1999,44
(1):67-73.
[3] HONDA S.P ost co l umn de ri v ati zati on for chrom atographic analysis of carbohydrates[J].J Chro m atog r,A,1996,720:
183-199.
[4] ENGLYST H N,QU I GLEY M E,HUDSON G J.D e ter m i nati on o f dietary fi bre as NSP w ith GLC,H PLC o r spectropho to
m e tric m easure m en t of constituent sugars[J].A na l y st,1994,119:1497-1509.
[5] M EYER A,RA BA C,F ISCHER K.Ion pa ir RP-H PLC D eter m i nation o f s ugars,am i no sugars,and uron ic ac i ds after
de ri v ati zati on w ith p a m i nobenzo ic ac i d[J].A nal Che m,2001,73:2377-2382.
[6] HONDA S,AKAO E,SUZUK I S,et a.l H i gh perfo r mance li qu i d chrom atography of reduc i ng carbohydrates as strong l y ul
trav i o let absorb i ng and e l ec troche m i ca lly sensitive1 pheny l 3 m ethy l 5 py ra zolone der i va ti ves[J].A na l B ioche m,1989, 180:351-357.
[7] S TRYDOM D J.Chrom atog raph ic separation o f1 pheny l 3 m ethyl 5 pyrazo l one der i va tized neutra,l aci d ic and basi c a l do
ses[J].J Chro m atogr,A,1994,678:17-23.
[8] FU D,O NE ILL R A,M onosaccha ri de co m pos ition analysis o f oli gosaccharides and g lycoprote i n by h i gh performance li q
ui d chrom atography[J].A na l B i o che m,1995,227:377-384.
[9] 马定远,陈 君,李 萍,等.柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成[J].分析化学,2002,30(6):
702-705.
[10]戴 军,尹鸿萍,陈尚卫,等.杜氏盐藻多糖的高效体积排阻色谱保留特性及其分析方法的研究[J].色谱,2006,
24(6):560-565.
[11]QU I GLEY M E,ENG LY S T H N.De ter m i nati on of t he uronic ac i d constituents of non starch po lysacchar i des by h i gh per
fo r mance li qui d chrom atography w i th pu l sed a m perom etr i c detecti on[J].A na l yst,1994,119:1511-1518.
(上接第205页)
[12]ALAEE M,SERGEANT D B,I KONOM OU M G,e t a.l A g as chro m atography/high reso l u ti on mass spectro m etry(GC/
HRM S)m ethod f o r determ i nation o f po l ybro m i nated d i pheny l ethe rs i n fish[J].Che m osphere,2001,44:1489-1495.
[13]de B O ER J.F irst wo rld w ide i nter l abo ra t o ry st udy on po lybro m i nated d i pheny l ethers[J].O rganoha log en Co m p,2000,45:
118-121.
[14]MA RS H G,HU J,J AKOBSSON E,et a.l Synthesis and character izati on of32po l ybrom i nated dipheny l e t hers[J].Env i
ron Sci T echno,l1999,33:3033-3037.
[15]张建清,李敬光,吴永宁,等.同位素稀释的气相色谱/高分辨质谱联用测定食品中二噁英和共平面多氯联苯[J].
分析化学,2005,33(3):296-300.
[16]EL J ARRAT E,de LA CAL A,BARCEL D.Po ten ti a l chlor i na ted and brom i nated i nterferences on t he po l ybro m i nated di
phenyl e t her de ter m i na ti ons by gas chro m a t og raphy-m ass spectro m etry[J].J Chrom atog r,A,2003,1008:181-192.
正在阅读:
PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成_戴军05-01
2019关于元宵节猜灯谜作文40006-14
雨中的爱作文600字07-11
EQ使用技巧12-10
那一刻我永难忘记作文600字07-12
遇见月光作文600字07-10
医院信息化建设规划04-16
我不想哭作文500字07-14
贪玩的代价作文800字07-08
找回幸福作文700字07-13
- 教学能力大赛决赛获奖-教学实施报告-(完整图文版)
- 互联网+数据中心行业分析报告
- 2017上海杨浦区高三一模数学试题及答案
- 招商部差旅接待管理制度(4-25)
- 学生游玩安全注意事项
- 学生信息管理系统(文档模板供参考)
- 叉车门架有限元分析及系统设计
- 2014帮助残疾人志愿者服务情况记录
- 叶绿体中色素的提取和分离实验
- 中国食物成分表2020年最新权威完整改进版
- 推动国土资源领域生态文明建设
- 给水管道冲洗和消毒记录
- 计算机软件专业自我评价
- 高中数学必修1-5知识点归纳
- 2018-2022年中国第五代移动通信技术(5G)产业深度分析及发展前景研究报告发展趋势(目录)
- 生产车间巡查制度
- 2018版中国光热发电行业深度研究报告目录
- (通用)2019年中考数学总复习 第一章 第四节 数的开方与二次根式课件
- 2017_2018学年高中语文第二单元第4课说数课件粤教版
- 上市新药Lumateperone(卢美哌隆)合成检索总结报告
- 藻多糖
- 单糖
- 杜氏
- 戴军
- 液相
- 色谱
- 衍生
- 高效
- 组成
- 分析
- PMP
- MDM人力资源管理师三级真题和答案
- MOOCs与教学现代化的变革共4页文档
- 辽宁省沈阳市郊联体2018-2019学年高二生物上学期期末考试试题(扫描版)
- 我最喜欢的好莱坞明星介绍
- 经典雷达资料-第22章 天基雷达(SBR)系统和技术-1
- 【推荐】技术攻关和成果管理报告-word范文模板 (8页)
- 路面砂砾垫层施工方案
- 搭建flv可拖拽流媒体服务器-方案之Lighttpd
- 2014年全国高考数学卷文科卷1试题及答案解析88758
- 2017_2018学年高二地理下学期第一次月考试题(2)
- 从翻译目的论看博物馆解说词汉英翻译——以宁波博物馆解说词英译为例
- 湖南浏阳市2017-2018学年八年级第一学期期中语文试卷
- 《卓有成效——高效管理者的自我管理》2天
- 12、奇瑞汽车配件客户价
- 八年级生物上册第三节《空中飞行的动物》1学案人教新课标版
- 苏教版七年级生物下册知识点
- 陕西省三原县北城中学2014届高三上学期第一次月考试题
- 党的光辉历程和历史经验心得体会.doc
- 2020年1月中央电大本科《社区护理学》期末考试试题及答案
- 九年级化学物质构成的奥秘单元测试题