槲皮素阻断热休克蛋白70表达对艾灸预处理抑制胃黏膜损伤细胞凋亡的影响

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槲皮素阻断热休克蛋白70表达对艾灸预处理抑制胃黏膜损伤细胞凋亡的影响（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：易受乡,郁洁,常小荣,彭艳,林亚平

【摘要】目的通过槲皮素灌胃阻断热休克蛋白(HSP)70表达,观察艾灸预处理对大鼠急性胃黏膜损伤指数及细胞凋亡的影响,以进一步探明艾灸的细胞保护作用及其与HSP70的关系。方法40只大鼠随机分为捆绑对照组(A组)、模型组(B组)、艾灸＋模型组(C组)、槲皮素＋艾灸＋模型组(D组)、槲皮素＋模型组(E组)。D、E组每日采用槲皮素灌胃。C、D组每日艾灸足三里、梁门,以上处理共8 d。第9日,B、C、D、E组均采用无水乙醇灌胃制作大鼠急性胃黏膜损伤模型。采用western-blot方法检测胃黏膜HSP70蛋白表达；TUNEL 法检测胃黏膜细胞凋亡指数(AI)。结果与A组比较,模型组大鼠胃黏膜AI明显增高(P＜0.05),胃黏膜HSP70表达升高(P＜0.01)。与B组相比,C组大鼠AI明显降低(P＜0.05),HSP70表达显著升高(P＜0.01)；D组大鼠胃黏膜AI值明显增加(P＜0.01),HSP70表达未见上调。与C组相比,D组大鼠胃黏膜AI值升高明显(P＜0.01),HSP70表

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达明显下调。结论艾灸预处理上调胃黏膜HSP70表达,急性病胃黏膜损伤所致的细胞凋亡被抑制。槲皮素阻断HSP70合成后,艾灸预处理抑制急性胃黏膜损伤细胞凋亡的作用被取消,证明艾灸预处理对胃黏膜的保护作用确与艾灸上调HSP70表达有关。

【关键词】槲皮素；艾灸；热休克蛋白；细胞凋亡；大鼠

Abstract：Objective To observe the effects of pre-moxibustion on gastric mucosal ulcer apoptosis index (AI) and cell apoptosis in acute gastric mucosal injuring rats by perfusing quercetin into the stomach to blocking HSP70 expression, to further prove up the cell protecting effect of moxibustion and its connection with HSP 70. Methods Forty healthy Wistar rats were randomly assigned to group A (binding control), group B (model), group C (moxibustion ＋model), group D (quercetin ＋moxibustion ＋model), and group E (quercetin ＋model). Quercetin was given by gavage in group D and E, and moxibustion at Zusanli and Liangmen acupoint in group C and D every day for 8 days. At the ninth day, acute gastric mucosal injuring model was made by ethanol in group B, C, D and E. AI was checked by TUNEL method, and HSP70 by western-blot method in gastric mucosa of all groups. Results Compared with group A, the value of AI was increased obviously (P ＜0.05), and HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated in group B(P＜0.01). Compared with group B, the

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value of AI was reduced obviously (P＜0.05) and HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated obviously in group C (P＜0.01). The value of AI was increased obviously in group D (P ＜0.01), but HSP70 expression of gastric mucosa has no change. Compared with group C, the values of AI was raised obviously, but HSP70 expression of gastric mucosa was down-regulated markedly in group D. Conclusion While HSP70 expression of gastric mucosa was up-regulated by treatment with pre-moxibustion, the cell apoptosis was suppressed in acute gastric mucosal injuring rats. But after HSP70 expression was blocked by quercetin, the effect of restraining the cell apoptosis with pre-moxibustion was canceled. This study certificates that pre-moxibustion has the gastric mucosal protecting efficacy, and the effect is related with up-regulation of HSP70 expression.

Key words：quercetin；moxibustion；HSP70；cell apoptosis；rat

以往的实验研究已经表明,艾灸可以上调大鼠胃黏膜热休克蛋白(HSP)70表达,从而达到保护胃黏膜、抑制胃黏膜细胞凋亡的目的。为了进一步明确艾灸的预保护作用与HSP70的关系,本实验采用槲皮素灌胃阻断HSP70表达后,观察了艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜损伤程度、细胞凋亡及HSP70表达的变化。

1 实验材料

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1.1 动物

健康Wistar大鼠40只,雌雄各半,体质量220～250 g,月龄3～4月,河南实验动物中心提供,合格证号：scxk(豫)2005-0001。

1.2 仪器与试药

艾条为南阳市卧龙汉医艾绒厂生产的“天然华佗念盈艾条”(型号：mg-454,规格：18 mm×200 mm)。兔抗大鼠(HSP70)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；槲皮素(Sigma),细胞凋亡试剂盒(德国ROCHE公司),细胞及组织总蛋白抽提试剂盒(KangChen,KC-415)；BCA蛋白质定量试剂盒(KangChen, KC-430)；KC·化学发光试剂盒(KangChen, KC-420)。石蜡切片机(美国820型AO切片机)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；MIAS医学图像分析系统(北京航空航天大学)。低温离心机(上海安亭科学医学仪器厂)；电泳仪(北京六一仪器厂)；磁力搅拌器(太仓华美生化仪器厂)；扫描仪(上海天能仪器有限公司)；图像分析软件Image J。

2 实验方法

2.1 分组

40只大鼠按随机数字表法分为5组。捆绑组(A组)、模型组(B组)、艾灸＋模型组(C组)、槲皮素＋艾灸＋模型组(D组)、槲皮素＋模型组(E组),每组8只。

2.2 动物穴位定位及艾灸方法

参考文献[1]常用动物穴位定位法及拟人对照法定位。足三里：膝

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关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处。梁门：以胸骨柄上缘至外生殖器连线的上3/4与下1/4交界处为肚脐,胸剑联合到肚脐连线中点旁开至锁骨中线中点处。取大鼠单侧足三里、梁门,每日左右交替艾灸。将大鼠捆缚于鼠板,C、D组大鼠取单侧穴位,定位剪毛,将艾条固定于自制艾灸支架上,使艾灸垂直对准大鼠穴位或者非穴对照点,距离约0.5 cm,点燃施灸,局部温度维持在43 ℃左右,每日每穴艾灸约30 min。各组每日处理后松绑,回笼正常饲养,连续处理8 d。

2.3 造模

采用无水乙醇灌胃法制作大鼠急性胃黏膜损伤模型[2]：大鼠禁食24 h后,用灌胃针将无水乙醇注入大鼠胃腔内,注入剂量为0.6 mL/100 g,造模时间2 h。

2.4 给药

D、E组大鼠每日早晚以槲皮素灌胃2次,每次灌胃量为100 mg/kg,连续灌胃8 d。

步骤：A、B、E组大鼠每日捆绑约30 min,不艾灸,E组捆绑后槲皮素灌胃1次；C、D组捆绑后艾灸足三里、梁门约30 min,D组艾灸后槲皮素灌胃,以上连续处理8 d。第8日处理完毕后松绑回笼,禁食不禁水。第9日,B、C、D、E组大鼠均以无水乙醇灌胃2 h造成急性胃黏膜损伤模型,A组大鼠同时以等量蒸馏水灌胃。造模后每组随机抽取4只大鼠准备摘取全胃。取胃前,先将幽门部用线结扎,然后用注射器抽取4%多聚甲醛3 mL,自食道注入胃内,拔出针头,结扎贲门。在两结扎线的两端切断食道及十二指肠,摘下全胃,10 min后沿

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胃大弯剖开,用冰生理盐水冲洗,计算胃黏膜损伤指数(UI)。然后取胃窦部组织一小块(约5 mm×10 mm),放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h,石蜡包埋,供细胞凋亡检测。剩余每组4只大鼠,于取胃前,将幽门和贲门部结扎,在两结扎线的两端切断食道及十二指肠,摘下全胃。用冰生理盐水冲洗干净,取胃窦部组织一小块(约5 mm×10 mm),迅速装入冻存管中入液氮罐,用于检测HSP70表达。

2.5 指标检测

2.5.1 热休克蛋白70蛋白表达测定

采用western-blot方法检测。①取冻存胃窦组织放入管中,加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂,匀浆,离心15 min；②配置BCA 工作液。分别吸25 μL标准品和2.5 μL待测样品至微孔板对应孔中,并加入22.5 μL稀释液；③SDS-PAGE电泳：制备分离胶(pH 8.8)和积层胶(pH 6.8),加入电泳缓冲液,上样,电泳；④蛋白质转移：以吸水纸-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-吸水纸的顺序装配于转移装置上。30 mA恒流条件下,4 ℃转移过夜；⑤膜在5% BSA溶液中室温孵育1 h 以封闭膜上的非特异结合。KC·化学发光试剂盒中2种试剂等比例混合为反应液。将膜置于反应液中室温孵育5 min,去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光。每张膜上做1种目的蛋白和相应的内参蛋白。图片扫描保存为电脑文件,并用Image J分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化,将目的蛋白的灰度值除以内参B-actin的灰度值以校正误差,其比值(相对灰度值)作为检测指标单位。

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2.5.2 细胞凋亡测定

采用TUNEL(原位末端标记法)法检测细胞凋亡。组织切片按照常规方法进行脱蜡及水合,其余步骤按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明进行：滴加末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)反应液60 min, PBS洗3次,每次5 min；滴加Anti-fluorescein antibody工作液30 min,DAB显色,苏木精复染后漂洗脱水。细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞(凋亡细胞)。采用IMS 医学图像分析系统(上海申腾信息技术有限公司),光镜下(10×40倍)随机选5个视野,每个视野观察100个细胞,计数阳性细胞数,计算凋亡指数(apoptotic index,AI)＝阳性细胞数/观察细胞总数×100%。

3 统计学方法

所有数据用x±s表示,并进行正态性检验。符合正态分布者,多组计量资料采用方差分析,方差齐者用LSD和SNK法,方差不齐者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法；不符合正态分布者采用多个独立样本比较的秩和检验(K Independent Samples)。所有数据使用SPSS11.5 for Windows软件进行处理。

4 结果

(见表1)表1 各组大鼠AI值及HSP70表达比较(略)注：与A 组比较,★P＜0.05,★★P＜0.01；与B组比较,△P＜0.05, △△P＜0.01；与C组比较,▼P＜0.05,▼▼P＜0.01

5 讨论

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HSPs是生物体(或离体培养细胞)在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白,它普遍存在于整个生物界,几乎所有的细胞均能合成HSPs。大多数HSPs因环境改变而被诱导。如热损伤、缺血、氧化应激、射线、组织损伤、病毒、细菌以及某些化学物质如乙醇、亚砷酸钠等[3]。根据其分子量及等电点不同将HSPs分成5大类(或家族)：低分子量HSPs家族、中等分子量HSPs家族、HSP70家族、HSP90家族等。其中HSP70家族是研究最为深入的一种。机体细胞在受到各种应激,如高热、氧化等有害应激时,产生的HSP70可以增强细胞对损害的耐受程度,维持细胞的正常功能代谢,提高细胞在应激状态下的生存率。如将培养细胞置于中等温度下诱导HSP70合成,能避免高温应激时的细胞畸变。进一步试验证明,不同类型的细胞和物种经热诱导合成HSPs后能提高其在高温应激下的生存率[4-5],此即为HSPs的细胞保护作用。

现有资料表明,HSP70可从以下几方面发挥其细胞保护作用：①提高细胞对应激原的耐受性。②分子伴侣作用(Molecular chaperones)：HSP70作为主要的分子伴侣蛋白,与新生、未折叠、错折叠或聚集的蛋白质相结舍,减少产生不溶性聚集物的危险性,促进某些变性蛋白的降解和清除,以维护细胞功能。③抗细胞凋亡作用[6]：阻断或抑制HSPs诱导细胞凋亡,而HSPs的高表达则能发挥细胞保护作用,抑制细胞凋亡。④抗氧化antioxidition)作用：HSP70通过抑制氧自由基的产生,清除氧自由基,释放和增加内源性过氧化物酶(SOD)水平,实现细胞保护作用[7]。此外,HSP70在参与机体免疫、抗肿瘤、细胞周

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期调控、胚胎形成的细胞分化和胚胎发育过程中也扮演重要角色。

在正常胃组织中可检测到HSPs的少量表达,但在应激条件下,胃黏膜可出现大量HSP表达[8]。胃黏膜经常受到食物、乙醇、病原体等因素的刺激,细胞应激诱发凋亡,依照细胞适应性保护原则,胃黏膜上皮细胞能积极调整保护机制,促进HSP合成,减轻应激损伤[9]。已有多项研究表明,HSPs可以防止应激性溃疡的发生[10-l1],并对高热、缺血再灌注、氧化应激和化学毒物等因素引起的受损胃黏膜细胞有促进功能恢复的作用。HSP70作为分子伴侣在胃黏膜应激反应中能保护线粒体并减少应激引起的细胞内蛋白质变性和聚集,减少细胞凋亡[12-14]。

现代医学多采用短暂的缺血、缺氧、高温等物理化学的预处理方法来启动机体内源性保护机制[15-17],以加强机体对随后疾病的抵抗与耐受力。但上述这些预处理方法的安全性及可操作性尚存争议,因此其临床应用受到限制。近年将针灸作为一种“预处理”的方法,来研究其“预适应”作用的报道逐渐增多,并提出“穴位针刺预处理”

[18]、“针灸预处理”、“针灸良性预应激”[19]等概念。经过大量实验和临床研究显示,针灸预处理对心、脑、胃肠、脊髓等部位缺血缺氧有良好的保护作用。大量文献提示,针灸预处理的细胞保护作用与HSP密切相关[20-25],故人们认为,如果通过针灸预处理的手段,诱导HSPs 等生物活性物质产生,启动内源性保护体系,提高机体防御疾病能力,对于推动中医药学乃至生物学发展具有重要意义。

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笔者所在课题组曾报道艾灸对胃黏膜细胞的损伤修复具有良好的细胞保护作用,如艾灸足三里、梁门能降低应激性溃疡,胃黏膜丙二醛(MAD)和内皮素(ET)含量,对受损胃黏膜出现抗氧化损伤作用；抑制胃黏膜细胞凋亡,刺激胃黏膜上皮细胞增殖与修复。而以上作用均与艾灸上调应激性溃疡大鼠胃黏膜细胞HSP70蛋白其及基因表达有一定关系[7,25-28]。为了确认HSPs与细胞保护作用之间的关系,常采用基因敲除或蛋白质合成阻断方法来验证两者之间关系。槲皮素(quercetin)因其具有抑制HSP转录与翻译的特点已被广泛应用于HSP的研究中[29-31]。如姜氏等[32]发现腹腔注射锌离子可诱导大鼠视网膜HSP72表达,而对照组注射槲皮素后HSP72呈阴性表达,且实验组凋亡细胞少于实验对照组,表明通过诱导HSP72可减轻病理性细胞凋亡的发生。因HSP70对肿瘤细胞也具有保护作用,故也有人采用槲皮素特异性抑制肿瘤细胞HSP70的表达来诱导肿瘤细胞凋亡[33]。

实验表明,适当剂量的槲皮素灌胃可抑制胃黏膜细胞HSP 合成,但不会对大鼠产生毒性作用[34]。为了进一步验证艾灸的预保护作用与HSP70的关系,本实验采用槲皮素灌胃方法阻断HSP70合成后,观察了艾灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜损伤程度,HSP70表达及细胞凋亡的影响。实验结果表明,D组大鼠HSP70含量明显低于C组(P＜0.01),接近于B组和A组(P＞0.05),说明槲皮素确实阻断了急性胃黏膜损伤大鼠胃黏膜HSP70的合成。同时,D组

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大鼠UI和AI均明显高于C组。这表明槲皮素阻断HSP70的合成后,艾灸预处理对急性胃黏膜损伤的保护作用也随之减弱,表现为胃黏膜损伤加剧和细胞凋亡增多。由此再一次证明,艾灸预处理对胃黏膜的保护作用确与艾灸上调HSP70表达有关,艾灸作为激发机体内源性保护机制的有效手段,其作用机制的分子生物学基础与HSP70的表达是分不开的。

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