细胞免疫荧光实验步骤

细胞爬片免疫荧光实验步骤

第一天：

1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；

3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；

5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

第二天：

6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右

2.给药处理24h。

3.PBS洗三遍。

4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避光）

5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。

6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。

7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。

8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）

9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。

10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光）

11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。

12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。

All steps for IF

1) Remove culture medium and fix cells (a common fixat ive is 4%

formaldehyde in PBS, for 15 minutes)

2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical)

3) Permeabilize the cells (a common permeabilization rea gent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes)

4) Wash well in PBS

5) (optional: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933)

6) Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes

(a common blocking solution would be 3-6% bovine serum alb umin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710)

7) Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concent rations vary, but usually between 0.5-10ug/mL)

8) Wash well in PBS

9) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum albumin / PBS (a good starting antibod y concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS

11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306)

12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent sec ondaries, a good antifade solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S36937)

（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2tfe.html