愈创木酚法测定过氧化物酶活性(准确,无误)
更新时间:2023-11-23 08:18:01 阅读量: 教育文库 文档下载
愈创木酚法测定过氧化物酶活性
一、实验目的
过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用,掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。 二、实验原理
在过氧化物酶(POD)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm处有最大光吸收值,故可通过测470 nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 三、实验材料 马铃薯块茎。 四、设备与试剂
分光光度计,离心机,研钵,容量瓶,量筒,试管,吸管。
0.05 mol·L的磷酸缓冲液(pH 5.5);0.05 mol·L愈创木酚溶液;2% H2O2;20%三氯乙酸 五、实验步骤 (一)酶液的制备
取1.0~5.0 g 洗净去皮的马铃薯块茎,切碎,放入研钵中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中,于3000×g离心10 min,上清液转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL 磷酸缓冲液再提取两次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。 (二)过氧化物酶活性测定
酶活性测定的反应体系:依次加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液;1.0 mL 2% H2O2;1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚和0.1 mL 酶液。用加热煮沸5 min 的酶液为对照,反应体系加入酶液后,立即于34℃水浴中保温3 min,然后迅速稀释1 倍,470 nm 波长下比色,每隔1 min 记录1次吸光度A470,共记录5次,然后以每分钟内A470变化0.01 为1 个酶活性单位(U)。 六、实验结果
以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位(U)。 △A470 ×VT 过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)=────── W×VS×0.01×t 式中:△A470——反应时间内吸光度的变化;
W——马铃薯鲜重(g); t——反应时间(min); VT——提取酶液总体积(mL); VS——测定时取用酶液体积(mL)。 七、注意事项
酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加,不能直接加入。
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