3T3-L1细胞诱导分化

首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买 的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.

让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是 1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。这 是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。一般说不能超过20代，最好在10代以内。 诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。

诱导剂的配制

IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存

用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液 终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。 DEX： 分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存

用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液

终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。可用2年。 Insulin：分子量：6000 ,4度保存

原液为诺和灵R：400IU/10ml

终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。4度保存

3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化

1) 将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培

液在37℃、5％CO2培养;

2) 待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是

长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX（储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）

3) 48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液

再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。

诱导操作注意事项：

1、 一共需诱导3次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h，若时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h。

2、 诱导操作需注意：以6孔板为例，每孔3ml培液，一个6孔板需18ml培液，

则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul（储存液），DEX7.2ul储存液，胰岛素108ul（储存液）。第一遍诱导时用200ul的移液枪先每孔加200ul配制好的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细胞会飘起来，俗称卷边。每孔加5遍200ul培液，合计1ml，第二、三遍则每孔1000ul加培液，方法同上，操作要慢、轻。

3、 第2次诱导时，诱导剂的配制为：18ml培液，加胰岛素108ul（储存液），混

匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第3次诱导诱导仅需换10%高糖DMEM培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培液看起来就黄了。

4、 第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出

来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次1ml的培液换，一般换液2天后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。

细胞是否诱导成功细胞代数很重要，我们这边一般是13代以后的细胞就很难诱导出来了，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。

3T3-L1细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI诱 导，DMEM高糖+胎牛血清），第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin诱导，DMEM高糖+胎牛血清），细胞中 就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定浓度的KOH溶解 的，insulin是在一定浓度的HCL中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为3T3-L1细胞，但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入 分化诱导的时候，一定不能用胎牛血清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小心被污染！祝各位实验顺利！共同学 习！

因为3T3-L1加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管 家的时候很难控制流速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的 话，还是能用，没有什么大的影响，如果范围比较大的话最好重新诱导。

你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX大家一般都是用 0.5mmol/L，胰岛素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性的吗？因为一般 的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。

镜下观察细胞接 触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起了，如果你的细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。 这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自 己需要自己摸索 一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1长得非常快，如果长满以后不换液，会有大批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在10*4数量级，这样让细胞长3天后铺满，再换液，再让细胞长 2-3天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest状态。 2，IBMX的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH溶液都可，针对你所说的出现结晶问题建议你用1M KOH试试，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，

3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的insulin，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化。

我用的方法是美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细),现发给各位战友共享,呵呵.

如果不能成功分化的话,只能质疑细胞的问题了.

3T3-L1 Differentiation Protocol

MATERIALS

Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate) Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)

Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEM

Isobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500)

MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)

SOLUTIONS

10% Calf Serum/DMEM

60mL Calf Serum

6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate 6mL 100x P/S/G 500mL DMEM 10% FBS/DMEM

60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized) 6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate 6mL 100x P/S/G 500mL DMEM

IBMX Solution (make fresh)

a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL. b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.

Insulin Stock Solution

167 uM (1mg/mL) in 0.02M HCl

Filter sterilized through 0.22 mm filter

Can store at -20C for long term, 4C short term.

Dexamethasone Stock Solutions

Freezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C) Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBS Filter sterilize and store at 4C.

MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)

To required volume of 10% FBS/DMEM add: 1:100 IBMX 1:1000 Insulin

1:1000 Dexamethasone working stock

Insulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)

To required volume of 10% FBS/DMEM add: 1:1000 Insulin

METHOD

Preadipocyte maintenance and passage:

We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning

(Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.

Adipocyte Differentiation Protocol:

1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM

2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.

3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.

4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10% FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2rt2.html