格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

生物工程学报 Chin J Biotech 2008, January 25; 24(1): 15-20 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved.

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

赫卫清, 周红霞, 王红远, 高群杰, 王以光

中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所, 卫生部抗生素生物工程重点实验室, 北京 100050

摘 要: 在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始单位的合成, 而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量, 并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术, 将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏, 以获得ΔSOP菌株, 从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明ΔSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时, 通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期, 第2代孢子菌种的Gdm产量较高。 关键词: 吸水链霉菌17997, 格尔德霉素, 基因阻断, 孢子形成周期

Construction and Cultivation of Genetically-engineered Strain to Improve Geldanamycin Production

Weiqing He, Hongxia Zhou, Hongyuan Wang, Qunjie Gao, and Yiguang Wang

Institute of Medicinal Biotechnology, CAMS & PUMC, Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Ministry of Health, Beijing 100050, China

Abstract: To improve the production of geldanamycin in Streptomyces hygroscopicus 17997, gene disruption was done to delete the

naphthalenic AHBA genes (shnSOP), encoding the products that share the common biosynthetic substrates with geldanamycin. The resulting mutant strain (ΔSOP) was cultivated on a solid medium and the amount of spores collected from the plates was calculated from 5 to 14 days and the yield of geldanamycin was measured by HPLC. The geldanamycin production of the ΔSOP strain increased by 185% comparing with that of the parent strain. On solid medium, the ΔSOP strain underwent 2 cycles of sporulation and the growth of the second sporulation had the highest geldanamycin production.

Keywords: Streptomyces hygroscopicus17997, geldanamycin, gene disruption, spore formation

吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)可以产生苯安莎类的Gdm(图1)。安莎类抗生素属于一种大环内酰胺, 它们的结构中都含有一个芳香环(苯醌或萘醌), 其脂肪链是连结在芳香环的两个不相邻原子

之间。芳香环的脂肪链通过酰胺键连接成大环结构。安莎类抗生素芳香环的生物合成均是以AHBA作为起始单元。

安莎类抗生素具有抗菌、抗结核、抗真菌、抗

Received: April 6, 2007; Accepted: June 4, 2007

Supported by: the National Department of Sciences and Technology under Preliminary Basic Research 973 project (No. 2001CCA00500). Corresponding author: Yiguang Wang. Tel: +86-10-63038137; Fax: +86-10-63176489; E-mail: wangyh456@ 科技部基础研究重大项目973前期研究专项(No. 2001CCA00500)资助。

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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用基因阻断技术破坏参与萘醌型安莎类化合物的AHBA基因, 以便通过阻断或减少通往合成萘醌型安莎类化合物前体(N-AHBA)量, 增强Gdm前体(B-AHBA)供应代谢流提高其发酵产量。此外, Gdm产生菌属于吸水链霉菌, 这种类型的菌种在固体培养基上经培养其孢子丝将自溶形成吸水褐黑色湿斑, 本研究拟阐明所构建的基因阻断工程菌在固体培养基上的生长周期与发酵产量的关系。

1 材料和方法

图1 格尔德霉素的化学结构

Fig. 1 Chemical structure of geldanamycin

1.1 菌种和质粒

Gdm产生菌——吸水链霉菌17997为本所从土壤中分离得到并保存。大肠杆菌/链霉菌接合转移质粒pGH112 (tsrR 硫链丝菌素抗性) [12]。大肠杆菌/链霉菌接合转移供体菌[13], 大肠杆菌DH5α, 本室保存。阿泊拉抗性基因(Apramycin, AmR)构建在pUC18质粒上, 本室构建。

肿瘤和抗病毒等多种生物活性。Sasaki等最先发现Gdm具有抗原虫和抗肿瘤作用[1], 本所的研究发现Gdm还具有良好的抗病毒活性[2]。近年的研究表明Gdm的这些生物学活性是因为它能特异性地抑制热休克蛋白90 (Hsp90)的ATP/ADP结构域[3,4], 下调多种Hsp90的靶蛋白功能所致。Gdm新颖的作用机制决定了对其深入研究具有潜在的科学与经济价值。低毒、高效Gdm衍生物的获得成为当今新药研究的一个主要目标。目前对Gdm所进行的比较成功的化学改造，主要集中在苯核(17位)上所连接甲氧基的变换。两个在Gdm C17位进行取代的衍生物17-AAG和17-DMAG已在美国进行II期和I期临床实验

[5, 6]

1.2 培养基

吸水链霉菌17997固体培养基(MY)(Yeast ex-tract 4 g, Malt extract 10 g, Glucose 4 g, 琼脂 15 g, 加水至 1000 mL)。Gdm发酵培养基 (starch 2 g, cotton meal 0.5 g, glucose 0.5 g, corn starch liquor 0.5 g,

大肠yeast powder 0.5 g, CaCO3 0.2 g, 加水至100 mL)。杆菌/链霉菌接合转移培养基 (soybean powder 20 g, mannitol 20 g, agar 15 g, 加水至1000 mL)。

。

1.3 药品和试剂

限制性内切酶、LA-Taq酶、连接酶、去磷酸化酶 (CIAP) 均购自TaKaRa公司。DNA回收采用北京鼎国生物技术有限公司的DNA快速纯化/回收试剂盒。引物合成由赛百胜公司完成。硫链丝菌素为美国Squibb & Sons, INC 产品, 阿泊拉霉素(Am)为沈阳药科大学夏焕章教授惠赠。

利用生物技术实现对Gdm产生菌染色体的改造, 对提高Gdm发酵产量和研制化学方法难以获得的衍生物有重要意义。为此首先需要从产生菌中克隆Gdm生物合成的相关基因。本实验室曾根据参与Gdm生物合成的起始单位AHBA

[8, 9]

[7]

合酶基因的

保守区域设计兼并引物, 从Gdm产生菌基因文库中发现并获得了两组AHBA生物合成基因簇及与之连锁的部分PKS基因片段, 通过基因阻断实验鉴定了参与Gdm 生物合成的基因簇[10]。基因同源性分析表明, 另一组AHBA生物合成基因簇(AHBA-shn)与萘醌型的同源性高于苯醌型基因簇, 提示该产生菌中含有编码萘醌型安莎类抗生素的生物合成基因簇。抗生素生物合成中前体的供应往往是发酵产量的限制因素[11]。鉴于苯醌和萘醌型两种安莎类化合物共享AHBA为生物合成的起始单元, 本研究拟采

1.4 仪器

Shimadzu LC-10Avp高压液相色谱仪, SPD- M10AvP二极管阵列检测器, CLASS-VP工作站。PCR仪Techgene Thermal Cycler -PROGENE型。

1.5 DNA操作

大肠杆菌中质粒的提取和转化按文献[14]进行,链霉菌DNA操作按文献[15]进行。质粒的酶切、回收和连接按TaKaRa的说明书操作。PCR反应: PCR反应采用TaKaRa LA-Taq酶, GC-I体系(20 μL): (ddH2O 4.6 μL, GC-I buffer (2×) 10.0 μL, Primer

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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(25 μmol/L) 各0.5 μL, Template 1 μL, dNTP (2.5 mmol/L) 3.2 μL, Taq 酶 0.2 μL)。反应条件: 仪器40℃预热 1 min, 96℃预解链 2 min, 解链96℃×40 s, 退火60℃×40 s, 延伸72℃×1.5 min, 30个循环, 72℃延伸5 min, 结束反应。

P5上游引物: 5′GTTACGA3′(Xba I) P6下游引物: 5′GAAAGTAGCG3′(Xba I)

1.10 孢子生长周期的观察和计数

将甘油保存菌种接种到平皿上, 28℃培养7 d, 用3 mL无菌水洗下, 取0.1 mL涂布含20 mL培养基的平皿, 28℃培养5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 d, 观察孢子生长情况, 并分别以5 mL无菌水用玻璃珠滚下孢子、打碎、过滤, 孢子液经适当稀释后, 取0.1 mL加入平皿中涂布均匀, 置28℃培养7 d, 根据单菌落计算其孢子数。

1.6 大肠杆菌ET1567/pUZ8002与链霉菌进行接合转移

按文献[15]操作。 1.7 Gdm基因阻断工程菌发酵培养及产物HPLC分析

按文献[7]进行。

1.8 基因阻断载体的构建

根据shnSOP基因序列设计引物, 以吸水链霉菌 17997基因组为模板进行PCR。

上游引物: P1 5′

-CCGGAATTCACACTCGCAC GTCCAGCC-3′带有EcoRI 酶切位点

下游引物: P2 5′-GCGGGTACCGCAGCCAG ATGCAGTCGG-3′带有Kpn I 酶切位点

扩增 1257 bp片段1。

上游引物: P3 5′-AAAACTGCAGCTGTGGCT CAGACTGCTGC-3′带有Pst I酶切位点

下游引物: P4 5′-CTAGTCTAGATGATGTCGG AAAGTAGCG-3′带有Xba I酶切位点

扩增 1265 bp 片段2。

回收PCR产物片段1和2, 在其中间以Pst I－Kpn I酶切位点插入Am抗性基因(1.5 kb), 并以EcoR I-Xba I酶切位点与载体pGH112相应酶切位点进行连接, 转化大肠杆菌DH5α, 获得基因阻断载体。

2 结果

2.1 萘醌型AHBA基因阻断重组质粒的构建

AHBA是安莎类抗生素生物合成的起始单位, 在吸水链霉菌17997中曾发现了两种AHBA生物合成基因簇[AHBA-gdn和AHBA-shn], AHBA-shn基因簇结构见(图2), 前者参与Gdm的生物合成, 后者与吸水链霉菌17997可能产生的萘醌类抗生素有关。为了阻断AHBA-shn的合成, 采用pGH112载体构建了AHBA-shn基因簇中部分基因敲除的重组质粒。应用同源基因重组原理根据ShnS的N端(引物P1)和ShnO的C端(引物P2), 以及ShnO的C端(引物P3)和ShnP的N端(引物P4), 以吸水链霉菌17997总DNA为模板进行PCR, 分别获得了同源片段S1和S2。在片段S1和S2中间加入选择性标记Am抗性基因, 并与载体pGH112相连。基因阻断重组载体pGEX-shn构建流程如图3所示。

1.9 基因阻断株的获得及鉴定

基因阻断株的筛选按文献[16]进行。基因阻断株的PCR鉴定, 选取构建基因阻断载体的1和2两翼外测序列设计引物, 以原株和变株的基因组为模板进行PCR。

2.2 基因阻断株的获得和鉴定

将构建的基因阻断重组质粒pGEX-shn通过大肠杆菌ET12567/pUZ8002接合转移导入到吸水链霉菌17997中, 并在MY培养基中传3~4代后, 再进行

图2 AHBA-shn基因簇的组成

Fig. 2 The organization of AHBA-shn gene cluster

shnQ: aminodehydroquinate synthase gene, shnS: AHBA synthase gene

shnO: oxidoreductase gene, shnP: phosphatase

shnK: kinase gene, shnJ: aminodehydroquinate dehydratase gene

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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图3 pGEX-shn基因阻断载体的构建

Fig. 3 Construction of the gene disruption vector pGEX-shn

单克隆分离, 根据对Tsr和Am抗性表型, 筛选获得对ΔSOPAmRTsrS同源基因双交换阻断突变株ΔSOP。阻断变株在基因整合水平进行了PCR验证。以原株和ΔSOP变株的基因组为模板, 选取构建基因阻断载体的1和2片段两翼外测序列所设计引物(P5和

P6)进行PCR, 结果见图4。

由图4可见原株基因组PCR产物大小约4 kb左右, 而在ΔSOP变株中扩增出将近6 kb的特异性条带, 揭示在靶基因之间插入了1.5 kb左右的Am抗性基因, 符合预期结果。ΔSOP变株在不加药传代中AmR表型很稳定, 说明该变株中确实发生了DNA同源重组双交换所造成的AmR基因插入, 并使shn SOP基因受到破坏。

图4 基因阻断变株PCR产物电泳图

Fig. 4 Electrophoresis of PCR products of gene disruption

mutant genome

1: S. hygroscopicus 17997; 2: ΔSOP mutant; M1: λDNA/Hind Ⅲ

marker; M2: DNA marker Ⅲ

2.3 ΔSOP变株发酵产量的HPLC检测

吸水链霉菌17997及ΔSOP变株在固体培养基上培养7d, 将孢子收集后经发酵培养，发酵液离心, 取5 μL发酵液直接进样, 采用甲醇: 水=40%~100% 梯度洗脱30 min, 选择波长304 nm进行HPLC检测,结果见图5。

从峰面积来看, ΔSOP变株发酵液中Gdm的含量要比17997原株的高185%。说明阻断shn SOP基因可以提高菌株的Gdm产量。

2.4 ΔSOP变株在固体培养基上的生长周期与发酵产量的关系

根据孢子形成过程考察了吸水链霉菌17997和

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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ΔSOP变株在固体培养基的生长周期及孢子形成过程, ΔSOP变株在MY固体培养基上的生长有二个完整的周期, 第一代从营养菌丝到形成气生菌丝再形成第一代孢子的时间为7 d左右, 以后孢子数明显减少, 第二代孢子形成高峰在10 d左右。而吸水链霉菌17997原株在固体培养基上的生长只呈现一个

Incubation days A: 7 day B: 10 day

RT 27.43324.470

ΔSOP mutant parent strain

Peak area 529614 76616 747856 139125

图7 HPLC检测ΔSOP变株固体培养基上不同培养时间

发酵液效价

Fig. 7 HPLC analysis of Gdm fermentation title of ΔSOP

mutant culturing on solid medium at different days

周期, ΔSOP菌株和原株在固体培养基上孢子形成情况见图6。将第一代生长周期(培养7 d)的菌种与第二代生长周期(培养10 d)的ΔSOP菌种进行发酵, 以17997原株同样时间培养物作为对照, 并用HPLC检测其发酵产量, 结果见图7。结果表明, 原株培养7 d, 而ΔSOP变株培养10d GDM发酵产量最高。

A: Gdm B: 17997 C: ΔSOP

27.433 24.470

1076622 285489

3 讨论

用于抗生素生物合成的微生物初级代谢小分子产物, 称为抗生素生物合成的前体。当前体供应有可能成为抗生素生物合成限制性因素时, 通过有目的地提高产生菌前体供应可促进抗生素的生物合成。

AHBA是安莎类抗生素生物合成的前体。AHBA的合成途径与初级代谢产物莽草酸的合成相类似, 但有所不同。参与其合成的过程有激酶、氨基脱氢奎尼酸合酶、氧化还原酶、磷酸化酶和氨基脱氢奎尼酸脱水酶等, 而且, 参与苯醌型和萘醌型安莎类抗生素AHBA生物合成基因的同源性有一定差异[17]。在吸水链霉菌17997中本实验室发现了两套AHBA基因簇, 分别负责苯醌型Gdm合成的AHBA-B和与萘醌型安莎类抗生素合成相关的AHBA-N基因簇。这两种类型AHBA的合成均与初级代谢的磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖4-磷酸的代谢

RT Peak area

24.480 529614

图5 HPLC检测ΔSOP变株发酵液中Gdm的含量

Fig. 5 HPLC analysis of Gdm content in ΔSOP mutant broth

图6 ΔSOP变株在MY固体培养基上不同培养天数形成

孢子数的变化

Fig. 6 Spore amount of ΔSOP mutant culturing on the MY

medium at different days

Y axis indicating the spore amount per Petri dish (unit: ten thousands)

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid, AHBA)的生物合成基因簇, 根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin, Gdm)起始

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流相关。本研究采用基因重组技术, 通过破坏AHBA-N基因, 获得的基因阻断变株ΔSOP, 其苯醌型安莎类抗生素Gdm的发酵产量提高了185%, 表明AHBA的合成可能在吸水链霉菌中是限制因素, 抑制该菌中AHBA-N的供应, 可以促进AHBA-B的合成和供应, 有利于Gdm的合成。

一般链霉菌的生活周期多以孢子起始和告终。孢子萌发后形成菌丝, 在固体培养基上开始长为基内菌丝, 菌丝体发育至一定阶段形成气生菌丝, 部分气生菌丝发展为孢子丝和孢子。链霉菌固体培养物的生长周期对菌种的发酵潜能影响很大。使用以孢子量多和成熟的菌种为佳, 过于年轻的孢子产生抗生素的能力容易波动, 过于成熟的孢子已接近衰老会导致生产能力的降低, 但不同菌种随着培养基的不同其生长规律有变化。尤其是吸水链霉菌在固体培养基上的孢子易自溶而形成湿斑。本研究表明吸水链霉菌17997原株孢子形成较缓慢, 至10 d孢子数达到高峰, 而ΔSOP变株在固体培养基上孢子形成可分为两个周期, 第一代孢子形成期为7 d, 但这时孢子表面颜色较浅, 显示培养物处于比较年轻的状态, 第7天以后孢子数明显减少, 表明第一代孢子又形成气生菌丝, 以后又长成孢子, 至第10天孢子表面颜色变深, 显示第二代孢子比较成熟, 以孢子计数为指标的菌种生长周期与发酵潜力的研究表明, 在本实验条件下17997原株在孢子形成高峰期发酵效价较高(HPLC图谱从略)。ΔSOP在第二代孢子成熟期的发酵能力比第一代孢子高140%。其确切机制尚需进一步深入研究。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2qmm.html