黑曲霉产纤维素酶酶学性质的研究及其分离纯化

新疆农业大学

《酶与酶工程》

目:

名: 院: 级: 号: 绩 专题讨论综述

黑曲霉纤维素酶酶学性质的研究及其分离纯化

2013 年4月

题姓学 班学成

黑曲霉纤维素酶酶学性质的研究及其分离纯化

摘要：

从我院保藏菌株中，分离纯化出一株较纯的产酶相对较高的菌株。通过在单因素实验基础上进行正交实验，对其液态产酶的发酵条件进行研究，结果显示：氮源为1%的NH4NO3，无机盐为1%的NaCl,表面活性剂为0.05%的tween-80，接种量为3.6%，水量为1:1.5，pH6.0,发酵温度28℃，复合碳源为麸皮：酵母粉：蛋白胨=4:1:1，装料量为75g(250ml三角瓶)为最佳发酵条件。酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。通过对纤维素酶酶学性质的研究，得出其酶反应的最适温度为45℃，最适pH为4.5。

关键词：紫外诱变育种; 液态发酵; 纤维素酶 ; 酶学性质；

随着我国加入WTO和签署《烟草控制框架公约》，烟草行业面临诸多方面的压力，降低烟叶有害成分、提高烟叶质量成为烟草行业关注的热点问题。目前卷烟减害多侧重于工业减害技术（如：改善过滤和透气条件）研究。降低烟叶有害成分（主要是有害成分前体物），减少烟草燃烧后产生的有害物质是卷烟减害的另外一条有效途径，目前正日益受到研究者关注。

纤维素和果胶等都是生物大分子，在燃烧过程中常产生有害成分，它们的降解不仅有利于降焦减害，同时可提高烟叶品质。以往的研究多关注纤维素和果胶等单组分的降解，往往达不到理想的减害效果，需要综合考虑同时降低这些组分来解决这个问题，而选育和驯化多功能兼性好氧菌株及菌群来降解纤维素和果胶质等组分是降低焦油含量、提升烟叶品质的有效途径。

项目拟从烟叶及烟草甲共生菌中选育驯化具有同时降解纤维素和果胶质能力的功能微生物菌株及相关菌群，采用多尺度代谢调控的方法研究功能微生物的耦合发酵工艺，使用神经网络技术及响应面方法优化相关功能酶制剂配方，最终达到降低烟叶中纤维素等有害分子的目的。

本项目的实施，不但可筛选出对烟叶纤维素及果胶质等生物分子有明显降解作用的功能微生物，降低烟叶有害成分，还可通过降低纤维素及果胶质等成分直接提高烟叶质量。相关研究和应用不但可为烟草行业提供具有良好降焦作用的功能微生物，同时还可为生物方法提高烟草品质提供理论依据和技术支撑。

选用黑曲霉在优化条件下液态发酵啤酒糟生产纤维素酶具有生产成本低、经

济效益高和生产工艺简单等特点，既能有效利用资源又能减少环境污染，变废为宝，因此具有一定的社会效益。而且，黑曲霉是被美国FDA认可的工业用安全菌种；所以利用黑曲霉液态法啤酒糟生产饲用纤维素酶更具安全性。

1.分离纯化：利用实验室现有的黑曲霉保藏菌株，对其进行活化，然后进行不断的分离纯化，直至得到比较纯的黑曲霉菌株为止。利用得到的纯种黑曲霉菌株进行液体发酵培养，对其发酵产物纤维素粗酶制剂，经硫酸铵盐析，从黑曲霉发酵粉中分离纯化得到纤维素酶组分。

2.对纤维素酶酶学性质研究：探究该酶的最适反应温度、pH，及在最适反应温度及pH条件下，探究各种不同的金属离子、氧化剂、还原剂以及絮凝剂等对纤维素酶活性的影响。在最适反应温度和pH条件下测定与不同浓度底物反应时的酶活力，以及测定该纤维素酶组分中各种酶的活力。

3.UV诱变：通过紫外诱变得到具有制霉菌素且酶活性较高的菌株。制备黑曲霉的UV致死曲线，并根据致死曲线选择合理的诱变剂量。用合适的诱变剂量对野生菌株进行诱变处理，并对已诱变得到的nystatin菌株进行挑取，通过HC值进行突变株的初筛，通过酶活力的测定进行突变株的复筛。

纤维素和纤维素酶

纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，是由吡喃葡萄糖以β-1,4糖苷

键连接成的线性大分子聚合物，纤维二糖是其基本单元。纤维素分子表面平整，易于长向伸展，加上吡喃葡萄糖环上的侧基，十分利于氢键的形成，使这种带环、刚性分子链聚集在一起。纤维素分子的大小一般由聚合度来定义，即一个分子所含的葡萄糖残基数，范围从8000-10000左右。纤维素主要有结晶区和非结晶区两部分，分子链平行有序排列的为洁净区，结晶区有氢键，所以结构稳定，微生物降解十分困难；后者纤维素结构比较疏松，很容易被微生物降解。结晶区和非结晶区是一两相共存的体系，每个葡萄糖残基中都含有三个醇羟基，羟基中的氢原子与相邻的氧原子间距离小于0.28nm-0.30nm时都可能形成氢键。这样，纤维素分子链内、链间及分子链与表面水分子间，都可形成氢键。植物最初合成的纤维素分子链是呈高度水合状态，后逐渐失水，借氢键的形成造成螺旋状。结晶区内的氢键属于结合性强的不可逆类型。虽然氢键的键能远较糖苷键低，但由于在由纤维素分子链聚集排列形成的超分子结构中，特别是在结晶区中存在着大量的

氢键，是造成纤维素具有坚韧性和水不溶性的主要原因。

纤维素占植物干重的35%-50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，也是自然界中数量最大的可再生性资源，但如果未被降解为葡萄糖难以得到充分利用。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。

纤维素酶的组成及分类

纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，国内外对数根据纤维素酶的底物

及作用的位点和释放的产物将其分为三类:①内切β-葡聚糖苷酶(endo-l,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.4，来自真菌的简称EG，又称CMC-Na酶;来自细菌的简称Len)。这类酶不能水解结晶纤维素如棉花和微晶纤维素等，主要作用于纤维素内部的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，随机降解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素、纤维二糖和葡萄糖。②外切β-葡聚糖苷酶。又称外切葡聚糖苷酶，作用于纤维素线状分子末端，分解1,4-β-D-糖苷键，每次从底物的非还原端切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶，可以水解无定形纤维素和微晶纤维素，对棉花有微弱的作用。③β-葡萄糖苷酶纤维素大分子首先在EG酶和CBH酶的作用下降解为纤维二糖，再由BG酶水解成二个葡萄糖分子。

国外还有一些文献报道将纤维素酶分为四类，除以上三类外，还有一种外切葡糖苷水解酶(l,4-β-D-glucan glucobiohydrolase,EC3.2.1.74)，这类酶可从纤维葡聚糖的非还原端连续切下葡萄糖单位，水解速度随葡萄糖聚合度的增加而降低。也有文献报道将该酶与内切酶归为一类，称为β-1,4-葡聚糖苷酶，亦称Cx酶，而将纤维二糖水解酶称为C1酶，这样亦分为三类。

纤维素酶的应用

食品发酵工业:在酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率及原料的利用率，缩短发酵时间，而且酒的口感醇香，杂醇油含量低，其原因有两个方面:一是因为生产原料主要是地瓜干、玉米、高粱、淀粉等，这些原料中含有1%-3%的纤维素，在纤维素酶的作用下能转化为可发酵性糖，增加原料中的可利用碳源。二是由于纤维素酶对植物细胞壁分解，促使淀粉的释放和被利用，使糖化液、发酵液粘度降低，有利于酒糟的分离;纤维素酶应用于啤酒工业的麦

芽生产中，可增加麦粒溶解性，加快发芽，减少糖化液中单一葡萄糖含量，改进过滤性能，有利于酒精蒸馏;在酱油的酿造过程中加入纤维素酶，可促进原料细胞中的蛋白质和碳水化合物的释放，既提高酱油浓度又改善酱油质量;将纤维素酶应用于果蔬榨汁、花粉饮料生产，可提高汁液的提取率(约10%)和促进汁液澄清不沉淀。

食品加工:在果品和蔬菜加工过程中经纤维素酶适当处理，可使植物组织软化膨松，提高可消化性和口感;用纤维素酶处理大豆，可促进其蜕皮，同时使细胞壁溶解破坏，包含于其中的蛋白质、油脂完全分离，增加了优质水溶性蛋白质和油脂的获得率，降低了成本并提高了产品质量;在速溶茶生产工艺中可缩短有效成分的抽提时间，既可提高速溶茶品位又可提高得率。

中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法(如煎煮法、回流法、浸渍法、渗流法等)在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多等缺点。近年来，用于中药提取方面研究较多的是纤维素酶，该方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。大部分的中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内，用纤维素酶酶解可以使植物细胞壁破坏，有利于有效成分的提取。如侯嵘娇等首先将工业纤维素酶应用于中药及药渣中，使中药及药渣的纤维素酶解为β-葡萄糖，变渣为药，变废为宝，这对中药制药工业是一个开源节流的创举;马田田用黄柏提取小聚碱之前经纤维素酶进行预处理，可提高小聚碱收率，并与未加酶的提取进行比较，有显著性差异。

由此可见，纤维素酶用于以纤维素为主的中药材提取有效成分，的确能提高有效成分的收率，但要拓宽其应用领域，还需要进一步深入探讨酶的浓度、底物的浓度、温度、酸碱度、抑制剂等对药物提取的影响，使该法得到更广泛的应用。

纤维素酶的性质与酶系作用机制

细菌、真菌均可产生纤维素酶，但产生的纤维素酶分子量差异较大。如真菌产纤维素酶的内切酶和外切酶的分子量在20.0KD~60.0KD之间，细菌的内切酶分

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