表面与界面课题组实验方法整理

第一章 细胞实验相关

1.1细胞培养、增殖或毒性检测

1.1.1 细胞培养：

1. 将冻存细胞从液氮中取出，37 °C 水浴解冻。

2. 将解冻细胞悬浮液从冻存管中转移到离心管中，1000 r/min离心5 min. 3. 离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打之后再次离心处理一次 4. 离心之后去除上层清液，加入新鲜培养基，充分吹打

5. 将吹打均匀的细胞悬浮液转移到细胞培养皿中，并加入适量新鲜培养基，放到细胞培养箱

中培养

6. 细胞培养3、4天左右培养皿中细胞覆盖率80 %左右分盘继续培养，最后根据实验样品数

目计算所用细胞数合理进行分盘满足实验所用 1.1.2 细胞增殖：

1. 样品消毒处理：根据样品不同，可以选择高压蒸汽灭菌、酒精消毒、紫外照射消毒。 2. 培养有细胞的培养皿从培养箱中取出，移去培养基， PBS冲洗两遍，加入适量胰酶（预

先预热，小盘0.5 ml，大盘1 ml），放在培养箱中2~3 min，在显微镜下观察细胞解粘附即可（细胞形貌成球形），加入新鲜培养基，充分吹打培养皿底部，将细胞悬浮液转移到新离心管中，离心1000 r/min离心5 min。

3. 离心后，将离心管中上清液去掉，加入适量新鲜培养基，充分吹打，形成细胞分布均匀的

悬浮液，取10 μl，用细胞计数器在显微镜下进行细胞计数，得到细胞悬浮液中细胞浓度 4. 根据样品数量计算所用细胞总数（单个样品细胞接种密度为5 × 104）以及所用含细胞的

悬浮液体积（单个样品所用含细胞的悬浮液200 μl），根据前一步所得细胞浓度，取一定体积悬浮液，加入新培养基，配制满足实验需要的含细胞的新悬浮液，充分吹打，制得用于接种的细胞悬浮液。

5. 消毒后的样品转移到细胞培养板中，PBS清洗两遍（每次10 min），每个样品预先加入

800 μl培养基，然后加入200 μl含有细胞的悬浮液，轻轻摇晃混合均匀，放入细胞培养箱中培养1、4、7天。

6. 细胞培养到预定时间，进行定量分析的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品转移

到新的培养板中，加入0.5 ml含有10 % AlarmaBlue的新鲜培养基，继续培养4 h。4 h之

后，摇晃均匀后，取出100 μl培养基转移到96孔板中，在波长570 nm和600 nm下测量吸收值，根据公式计算得到细胞的增殖率。

7. 细胞培养到预定时间，进行表面形貌观察的样品，取出原培养基，PBS清洗两遍，将样品

转移到新的培养板中，加入2.5 %戊二醛溶液，4 °C避光过夜保存进行细胞固定。之后样品依次用30 %，50 %，75 %，90 %，95 %，100 %的乙醇/水溶液进行脱水，之后用六亚甲基硅烷/乙醇溶液（1:2，2;1和纯六亚甲基硅烷）进行干燥，在通风橱中充分干燥后，表面喷金用扫描电镜观察细胞形貌。 1.1.3 细胞毒性：

用样品直接测试毒性和细胞增殖实验步骤一样，如果用浸提液做步骤稍作改变即可，如下：

1. 样品浸提液制备，将消毒样品在培养基中浸泡24 h，所得浸提液为100 %浸提液，可以根

据需要和设计稀释为不同浓度的浸提液

2. 将细胞提前接种于96孔板中，培养一天，之后将原培养基移除，加入浸提液共同培养，

继续培养预定时间（比如1 d或3 d）

3. 与测定细胞增殖方法一样，测量与细胞浸提液共同培养后细胞增殖速率，与阴性对照和阳

性对照组比较，计算得到细胞活性，从而判断浸提液对细胞生长是否显示毒性

1.2干细胞骨架染色

1.2.1 经验分享

因PEEK分子中苯环结构会在汞灯光源下被激发出荧光，致使背底荧光较深，无法识别细胞，因此有关荧光染色的实验均不适用于PEEK材料。 1.2.2所需用具及药品

PBS（细胞房内/外用），4%PFA，0.1V%Triton X-100，1wt%BSA，FITC，DAPI，指甲油或502，盖玻片（提前准备好用24孔板切割成的独立小孔罩，并超声清洗干净，以保护样品用于观察）。 1.2.3 实验步骤

注意：整个固定、染色及观察过程需在避光环境中进行，以防荧光过早淬灭 1. 接种细胞，1 x1样品（每组3~4个，每个时间点各1个），密度5x104 cell/ml；

2. 到时间后（一般为1/4/24h或1/3/6/24h，根据具体情况定），将样品换至新的24孔板，以

去除24孔板中样品外细胞的影响，用PBS清洗2遍，每遍5min； 3. 用4%PFA固定10min，用量为每孔500μL； 4. PBS清洗3遍，每遍5min；

5. 用0.1V%Triton X-100通透，每孔500μL，时间2min; (PBS稀释：50mL PBS中加50μL

Triton)

6. PBS清洗3遍，每遍5min；

7. 加入500μL 1wt%BSA（用PBS稀释），时间20min； 8. PBS清洗1遍，5min；

9. 加入100μL（PBS和FITC混合液），染骨架，60min（1h）；(配制比例为1.2ml PBS：

20μLFITC)

10. PBS清洗3遍，每遍5min；

11. DAPI染核5min，每孔加入500μL；(配置比例为DAPI：PBS=1:1000) 12. PBS清洗3遍，每遍5min；

13. 准备好盖玻片，上滴约5μL抗荧光淬灭剂，将样品正面朝下反扣至抗荧光淬灭剂上（注意

尽量避免气泡），然后用经超声清洗的24孔板小孔罩罩住样品并进行标记，四周涂上指甲油或502固定样品；

14. 置于荧光显微镜暗场模式下进行观察并拍照。

1.3干细胞矿化

1.3.1 经验分享

对染料吸附严重的材料体系（如纳米多孔材料）以及表面胶体分散性较差的材料体系（如Zeta电位绝对值小于20）因对染料吸附较牢使得多余的染料难以经蒸馏水洗去，而在后续定量过程中又能经10%CPC洗脱从而使定量结果严重偏大，因此不适用此法。 1.3.2所需药品

PBS（细胞房内用），75%酒精；蒸馏水（或超纯水），10v%氨水（ammonium hydroxide）：

40mM茜素红(alizarin red)：称取2g茜素红溶于100ml蒸馏水，混合均匀后用10%氨水调节pH至4.1~4.3，The pH is critical, so make fresh or check pH if the solution is more than one month old。10%氯化十六烷吡啶(Cetylpyridinium chloride, Cat NO.：30037326(国药))：10g CPC+100ml水。10 mM磷酸钠(Na3PO4，sodium phosphate)：称取磷酸钠1.64g，用水溶解定容到1000ml。 1.3.3 实验步骤

1. 接种细胞，1 x1样品（每组8个，7/14d各4个），密度一般取1 x104 cell/ml for 7d and

0.5x104 cell/ml for 14d or 1 x104 cell/ml for both 7 and 14d；

2. 到时间后（7d/14d），将样品换至新的24孔板，用 PBS 漂洗三次然后用 75%的酒精固定 1

h；

3. 固定完后再用 PBS 漂洗三次；

4. 用溶解在饱和苦味酸中的 0.1%天狼星红对细胞分泌的胶原进行染色，染色过程持续 18

~20h；

5. 到时间点后用 0.1 M 的乙酸反复漂洗试样直至无颜色析出为止，体式显微镜照相（荧光显

微镜明场模式）；

6. 为了进行定量比较，每孔加入 500 ml 的洗脱液（用 0.2 M 氢氧化钠和甲醇以 1：1 的比例

配制），振荡 15 min 将试样表面的染料洗脱下来，在 540 nm 测其吸光度。

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