染料脱色菌的筛选及脱色特性研究 - 图文

染料脱色菌的筛选及脱色特性研究

1 前言

水是人类生存之源，发展之本，是环境构成中最活跃的因素。我国常年水资源总储量为2.81万亿m3，居世界第6位，而年总用水量为5 500亿～5 600亿m3，整体上能够满足需求。但由于我国人口众多，人均水资源占有量不足2 150 m3，为世界人均水资源占有量的1/4，位列世界110位，是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一。而且，随着人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，加之水资源时空分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。据美国对外关系委员会亚洲研究中心的报告，中国668个城市中440个已出现长期缺水问题。20世纪90年代以来，国家累计投入600亿元治理江河污染，相关部门也大力采取防污治污的措施，使得河流、湖泊、水库的水质基本保持稳定，局部有所改善。但据《中国环境状况公报》显示，2007年我国水污染形势依然严峻，监测的197条河流的407个断面中，Ⅰ～Ⅲ类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为49.9 %、26.5 %和23.6 %。因此，防治水资源污染，提高水环境质量，已成为当务之急。

印染产生的废水主要特点有：①水量大；②浓度高，大部分废水呈碱性,COD 值较高，色泽深；③水质波动大，印染厂的生产工艺和所用染化料，随纺织品种类和管理水平的不同而异，而对于每个工厂，其产品都在不断变化，因此，废水的污染物成分浓度的变化与波动十分频繁；④以有机物污染为主，除酸、碱外,废水中的大部分污染物是天然或合成有机物； ⑤处理难度较大，染料品种的变化以及化学浆料的大量使用，使印染废水含难生物降解的有机物，可生化性差。⑤印染废水的色泽深，严重影响着水体外观。造成水体有色的主要因素是染料。可见印染废水是较难处理的工业废水之一 。目前全世界染料年总生产量在60 万t 以上，其中50 %以上用于纺织品染色；而在纺织品印染加工中，有10 %～20 %的染料作为废物排出。印染废水的色度严重，用一般的生化法难以去除。染料废水的污染，势必影响到人畜饮水安全、水体养殖生产、农业种植等各方面，应采取得力措施进行防控和处理染料污水。根据环境污染治理专家研究发现，治理染

料污水最有有效的方法是生物法，生物法除了效果明显，也是对环境危害最小，是一种环境友好的除污方法。

本实验即是从生物防治染料污水的角度出发，从污水中提取脱色细菌，并对其进行一系列实验，包括①染料脱色菌的富集、分离②染料脱色菌的驯化培养③染料脱色菌脱色能力的测定④染料脱色菌生长曲线的测定。 2 实验器材 2.1 材料

2.1 菌种来源：各组自选污水 2.2 染料

孔雀石绿，最大吸收波长为617nm 2.3 培养基

富集培养基：KH2PO4 1g， (NH4)2SO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g， 牛肉膏1g，水1000ml，pH值为7.0，121℃下灭菌20min。

基础培养基：牛肉膏5g， 蛋白胨10g, NaCl 5g, 水1000ml，pH值为7.0, 121℃下灭菌20min。

脱色培养基：孔雀石绿的质量浓度为100mg/L。 2.4 主要仪器

电热恒温培养箱、光照培养箱、台式高速离心机、752型紫外可见分光光度计、台式压力蒸气灭菌锅、冰箱、电子天平、恒温振荡器、培养皿、试管、玻璃棒、烧杯、电炉、250ml锥形瓶、接种环、酒精灯、移液管、涂布棒、摇床等。 3 方法

3.1 染料脱色菌的筛选和纯化

染料脱色菌的富集：从求索溪中取适量污水，用无菌纱布过滤后取出10g，接入含150ml富集培养基的锥形瓶中，在37℃振荡条件培养2d后观察现象，取出颜色有明显变化的锥形瓶，进行下一步的实验。

菌种的分离筛选及纯化：在无菌条件下，用移液管从培养的锥形瓶中吸取

0.2ml菌液，将其移至加有孔雀石绿的脱色培养基培养皿上，在37℃恒温培养箱中培养1d后，待菌落长出后，拍照。以脱色圈大小、菌落大小作为指标，初步筛选出有效菌株，选取长势好、菌落下培养基脱色圈明显的菌落，用接种环挑取菌落接种至倒好的斜面培养基上，放入37℃恒温培养箱中培养，进行纯化。 3.2 染料脱色菌生长曲线的测定

采用比浊法测定菌株的生长曲线，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出菌株在30℃液体培养下的生长曲线。测定菌株的生长曲线具体步骤如下：

(1)种子液制备。取斜面菌种各1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入无菌牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃震荡培养18h作种子培养液。

(2)标记编号。取盛有10ml无菌牛肉膏蛋白胨培养液的试管，在每支上分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14h 。

(3)接种培养。用1ml无菌吸管分别准确吸取0.2ml种子液加入已编号的试管中，于30℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放4℃冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。

(4)生长量测定。将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长，分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

(5)绘制生长曲线。记录测定的各OD值，以上述时间标志为横坐标，相应的OD（600nm） 值为纵坐标，绘制菌种的生长曲线。 3.4 染料脱色菌脱色能力的测定

将分离纯化的菌株分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养24h。取新鲜制备的菌悬液5mL，加入到含100ml脱色培养基的锥形瓶中，

然后在37℃，150r/min震荡条件下的摇床中持续培养48小时后取样，将离心机设置为10000prm离心5分钟，取上清液在染料的最大吸收峰处测吸光度值，并以不加菌的脱色培养基为对照，计算脱色率。以脱色率的大小来表示菌种对染料的脱色能力。

脱色率：（A﹣B）/A×100% 式中，A——不加菌液的吸光度值

B——t时间后的接菌液的吸光度值

4 实验结果 4.1 生长情况

现象：菌落呈圆形斑点状，乳白色，数量为几个，菌落周围颜色明显变浅甚至成为浅白色。 图片：

（加孔雀石绿的脱色培养基的培养图） 4.2 染料脱色菌生长曲线的测定

不同培养时间菌液在600nm波长下的OD值表

时间/h 0 2 4 6 8 10 12 14 OD值 0.419 0.472 0.513 0.584 0.615 0.596 0.506 0.449 脱色菌生长曲线 脱色菌生长曲线

OD值0.70.60.520468101214系列10.30.20.10

0.405时间/h10154.3 染料脱色菌脱色能力的测定

现象：加菌液后的有孔雀石绿的培养基变为浅绿色，浑浊，而未加菌液的培养基依然为较深的绿色，两者差别很明显。

图片：

（说明：图中左边为加了菌液的锥形瓶，右边则为未加菌液的锥形瓶。）

两种菌液在600nm波长下的OD值表

培养基 不加菌液 加菌液 1号 1.695 0.132 OD值 2号 1.735 0.137 3号 1.718 0.125 平均OD值 1.716 0.131 脱色率=（1.716-0.131）/1.716*100%=92.37% 5 分析及讨论

（1）脱色菌在培养之初一直在增长，说明已经度过了适应期，但不是成对数增长，说明培养基某种条件（如PH值，C/N等）还不是很符合该种菌；从第6h进入稳定期，菌数量达到最大；从第10h进入衰亡期，数量开始减少，这可能是由于营养物质的减少、菌落中个体间的竞争或代谢过程中产生了有害物质。

（2）脱色菌的脱色效率达到92.37%，加入脱色菌使培养基颜色明显变浅，效果比较理想，可以作为治理含与孔雀石绿类似染料废水的理想菌种。但若要投入实际应用，还要进行进一步的研究，探究出该菌的适应生长、繁殖条件，包括适宜的废水PH值，有机物C/N，温度，理想的COD、BOD值，进入稳定期需要的时间，以及它的生态效应等各种情况，再根据当地水体的具体情况投入实际应用。 6展望

从理论上讲，多种物理化学和生物方法都可以用于印染废水的处理，常用的物化处理工艺主要是混凝沉淀法、混凝气浮法、电解法、絮凝沉淀（气浮）、生物活性炭法和化学氧化法等，但这些方法费用相对较高，在我国目前的科技和经济状况下，普及推广上有一定的困难，不是很实际。而生物方法有运转费用低，处理效果好，操作简单等优点，日益受到人们的重视，并在印染废水的处理中得到广泛应用。本实验通过对染料脱色菌的富集、分离，驯化培养，脱色能力的测定以及生长曲线的测定，可以初步得出脱色菌的生长情况和生长条件，及其脱色效果，可以为将脱色菌投入治理染料废水的实际应用提供一定的借鉴。

两种菌液在600nm波长下的OD值表

培养基 不加菌液 加菌液 1号 1.695 0.132 OD值 2号 1.735 0.137 3号 1.718 0.125 平均OD值 1.716 0.131 脱色率=（1.716-0.131）/1.716*100%=92.37% 5 分析及讨论

（1）脱色菌在培养之初一直在增长，说明已经度过了适应期，但不是成对数增长，说明培养基某种条件（如PH值，C/N等）还不是很符合该种菌；从第6h进入稳定期，菌数量达到最大；从第10h进入衰亡期，数量开始减少，这可能是由于营养物质的减少、菌落中个体间的竞争或代谢过程中产生了有害物质。

（2）脱色菌的脱色效率达到92.37%，加入脱色菌使培养基颜色明显变浅，效果比较理想，可以作为治理含与孔雀石绿类似染料废水的理想菌种。但若要投入实际应用，还要进行进一步的研究，探究出该菌的适应生长、繁殖条件，包括适宜的废水PH值，有机物C/N，温度，理想的COD、BOD值，进入稳定期需要的时间，以及它的生态效应等各种情况，再根据当地水体的具体情况投入实际应用。 6展望

从理论上讲，多种物理化学和生物方法都可以用于印染废水的处理，常用的物化处理工艺主要是混凝沉淀法、混凝气浮法、电解法、絮凝沉淀（气浮）、生物活性炭法和化学氧化法等，但这些方法费用相对较高，在我国目前的科技和经济状况下，普及推广上有一定的困难，不是很实际。而生物方法有运转费用低，处理效果好，操作简单等优点，日益受到人们的重视，并在印染废水的处理中得到广泛应用。本实验通过对染料脱色菌的富集、分离，驯化培养，脱色能力的测定以及生长曲线的测定，可以初步得出脱色菌的生长情况和生长条件，及其脱色效果，可以为将脱色菌投入治理染料废水的实际应用提供一定的借鉴。

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