质粒抽提试剂盒基本原理
更新时间:2024-04-21 05:10:01 阅读量: 综合文库 文档下载
质粒抽提试剂盒基本原理
碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒,是每个分子生物学实验室都要用到的常规技术,但是大家对碱法抽提质粒的原理知之甚少。
一、碱法抽提质粒用到的三种溶液及硅酸纤维膜(超滤柱)
溶液I:50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0; 溶液II:0.2 N NaOH / 1% SDS;
溶液III:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。
二、溶液I中各成分的作用 葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底
部,因此有些试剂厂商的溶液I没有葡萄糖成分;EDTA是Ca和Mg等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。
2+
2+
三、溶液II中各成分的作用 NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性
的情况下,细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的变化;但NaOH易和空气中的CO2发生反应,形成碳酸钠,降低了NaOH的碱性,所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS能很好地结合蛋白,产生沉淀。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA会断裂。
四、溶液III中各成分的作用 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的
纳离子而形成了PDS,因为十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被 PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase;同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
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