生物单分子 中国科学院 张竹青 荧光和显微镜部分

第二章 荧光

1荧光产生原理：

光致发光：物质分子吸收光能后，其电子由基态跃迁到激发态，激发态的分子以电磁辐射的形式释放能量回到基态称为光致发光。

荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：受光激发的分子从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

2荧光发射的决定因素：

激发光谱（excitation spectrum） 和 发射光谱（emission spectrum） （1） 斯托克斯位移 （Stokes shift ）：指荧光光谱较相应的吸收光谱红移

固体吸收光子（吸收）的能量将大于辐射光子（发光），因此发光光谱与吸收光谱相

比，将向能量较低的方向偏移（红移），两个光子能量的差值称为斯托克斯谱位移。

（2） Mirror Image Rule 镜像原则 （3） 发射光谱的形状

3 荧光的一些参数和概念

（1） Quantum yield (量子产率) ：Φ = 发射的光子数/吸收的光子数

（2） Fluorescence lifetime （荧光寿命）: 当激发停止后,分子的荧光强度降到激发时最

大

强

度

的

1/e

所

需

的

时

间

称

为

荧

光

寿

命

（3） Brightness (荧光强度)：

（4） Quenching（荧光淬灭）：指导致特定物质的荧光强度和寿命减少的所有现象。

常用作分子信标

（5） Photobleaching（光漂白现象）：指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度

随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。

（6） Fluorescence blinking (intermittency) （荧光眨眼现象）：

The phenomenon of random switching between ON (bright) and OFF (dark) states of the emitter under its continuous excitation.

4 荧光及荧光团分子结构

（1）共轭效应 (highly conjugate)：一般而言，π电子共轭体系越大，荧光效率越高，且荧光光谱红移。

（2）刚性（Rigidity）平面结构：非辐射缓解(non-radiation relaxation)以“热”的形式消耗掉，而不放出电磁辐射，刚性平面结构可以降低非辐射缓解。刚性结构越强则荧光越强。 （3）取代基效应： 色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、酪氨酸Tyr

给电子基团：如–OH, –OR, –NH2, –CN, –NR2等，增强荧光。 吸电子基团：如–COOH, –NO2, –NO等， 减弱甚至熄灭荧光。

5 细胞内的自发荧光：多为含有NADPH/黄素的细胞器或化学物质 6 荧光应具备的特点

（1）激发和发射在可见光波长范围内 exciting and emitting in the visible wavelength （2）高亮度 high brightness

（3）由激发态—基态的时间相对较短 a relatively short excited-state lifetime （4）较大的斯托克斯位移 a large Stokes shift

（5）稳定的光物理学性质 stable photophysical properties （6）荧光分子相对较小relative small

7 荧光素的种类

1 有机染料Organic dyes： 箐类染料Cy5和Cy3 ；四甲基罗丹明 TMR；AlexaFluor系

列染料

2 荧光蛋白Fluorescent Protein：GFP等

3 量子点Quantum dots：不同尺寸的硒化镉(CdSe)量子点在紫外线的照射下发出荧光，硒化镉尺度越小则发射波长越短，即荧光越强。

第三章 显微镜

1 Resolution limit (diffraction limit)衍射极限：

一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里斑。这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的 d= λ/2nSinα 瑞利判据

NA = n * sin α，其中 n 是被观察物体与物镜之间介质的折射率；

α 是物镜孔径角（2α）的一半。

α越大，则sinα 越大，则d 越小，分辨率越高。

2显微镜的照明和观察视野

（1）显微镜的照明场：透射式照明 和 落射式照明

2显微镜的观察视野 ：明视野观察（Bright field） 和 暗视野观察（Dark field）

3不同种类的显微镜

（1）

相差显微镜（phasecontrast microscope）：利用物体不同结构成

分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。 主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 （2） 微分干涉相差显微镜 DICM：

DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜， DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。 棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），

由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差，

检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。 x和y波的光程差决定着透光的多少。 光程差值为0时，没有光穿过检偏器；

光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值， 于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。

（3） 电镜：改变光波长 波粒二象性 λ=h/p=h/mv eU = 1/2 mv2

A TEM 透射电镜：电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的

是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此

用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。

由照明系统、成像系统、真空系统、记录系统、电源系统5部分构成。

B SEM 扫描电镜：其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激

发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，

次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

目前扫描电镜的分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点，则 扫 描 电 镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。

(4) 扫描隧道显微镜Scanning tunneling microscope (STM)：

它作为一种扫描探针显微术工具，扫描隧道显微镜可以让科学家观察和定位单个原子，它具有比它的同类原子力显微镜更加高的分辨率。此外，扫描隧道显微镜在低温下（4K）可以利用探针尖端精确操 纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。

（5）原子力显微镜（Atomic Force Microscope ，AFM）：利用范德华力通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究

物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。

4 荧光显微镜：

（1）荧光显微镜与普通显微镜的不同：

A 光源不同：汞灯、氙灯、卤素灯、LED、激光 (laser)

B 滤光系统不同：激发滤光片、阻断滤光片(压制)、双色向滤光镜 (dichroic filters)

（2）激光扫描共聚焦显微镜Confocal Microscopy：照明针孔与探测器针孔

及焦平面形成共聚焦 利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

（3）全内角反射荧光显微镜

Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) ：

利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

（4） 近场光学显微镜Near-field scanning optical microscopy (NSOM)

光探针和样本距离在1个波长之内，不再受远场衍射极限限制。

近场光学显微镜是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫描成像的技术。如利用孔径在20-90nm的近场探针在样品上进行扫描而同时得到分辨率高于衍射极限的形貌像和光学像的显微镜。

第四章 单分子荧光共振能量转移 smFRET

1 FRET产生的条件：

? 供体和受体都能发光

? 供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠 ? 供体和受体的距离必须小于100? （< 10 nm） ? 供体和受体的取向状态合适

2 能量转移效率：

K2取向因子：一条线上= 4 平行时= 2 垂直时= 0 通常采用2/3 3 smFRET的优点:

1)可实时观测生物分子结构变化，甚至一些短暂存在的中间态结构;

2)与其它单分子技术比，不易受环境噪音影响; smFRET

的缺点:

1) 至少需要两种外部染料

2) 可测相对距离<10nm

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