细胞冻存与复苏

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。

细胞的复苏

【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水 【步骤】

（1） 从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。

（2） 从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。 （3） 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代。

细胞复苏时细胞数可以做10~20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。 1 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。

2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即

可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7 何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。

10 悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。 12 细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。 13 细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使 用前先行配制完成。

14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade 之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤

膜。

15 冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*)→ -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C以下， 再放入液氮槽vapor phase 长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 16 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106cells/ml vial 为宜。 17 应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。 18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 直接灭菌后丢弃之。

19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 20 支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。 故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 21 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

23 为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH 值会越来越偏碱性？ 培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。 24 各种细胞培养用的dish板，flask瓶子 是否均相同？

不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer聚合物不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。

25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？

研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80 °C 太久。 27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？

冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。

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