土壤酶指标测定

土壤生物化学指标测定

一、 土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）

（一） 分析意义 脱氢酶能酶促脱氢反映，它起着氢的中间传递题的作用。在土壤中，碳

水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。

（二） 方法选择与原理 Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进

行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。

后来对上述的方法做了不同的改进和完善。用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。

（三） 试剂配制

1、0.5%TTC溶液 2、甲苯

3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHCl 38.5ml混合后，用水稀释至100ml。

4、硫化钠

5、0.1mol/L葡萄糖溶液。

（四）实验步骤

1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。分别向6支50ml比色管中依次注入1、2、3、4、5、6mL mg/ml标准 TTC溶液，用蒸馏水定容，是为工作液：取7只带塞比色管（50ml）依次加入2 mL Tris-HCl演算缓冲液，1 mL不同浓度的TTC工作液，1 mL10%硫化钠新配溶液，摇匀，放置20分钟；反应完全后，准确加入10ml甲苯，振摇。完全提取TF，稳定数分钟，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞（在比色皿中也需稳定2分钟）绘制标准曲线。 2、操作过程：取0.5g新鲜土壤，置于50ml 比色管中，依次加入2mlTris-HCl盐酸缓冲液、1ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。

3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g — 土壤含水量

脱氢酶活性，以24h后1g干土中 TF的生成量表示。

二、 土壤过氧化氢酶（catalase）活性的测定（滴定法）

(一) 分析意义 过氧化氢酶广泛存在于土壤汇总和生物体内。土壤过氧化氢酶促过氧化氢

的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关，与微生物的数量也有关。一般认为，土壤中催化过氧化氢分解的活性，有30%或40%以上是耐热的，即非生物活性，常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比。

(二) 方法选择与原理 本法是基于用 高锰酸钾滴定酶促反应前后，过氧化氢的量，由二者

之间的差求出分解H2O2的量，以此来表示酶的活性。 2KMnO4+5 H2O2+3H2SO4------2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2

(三) 试剂配制

1、0.3% H2O2 2、3N硫酸

3、0.1N高锰酸钾（优级纯）溶液。 （四）实验步骤

1、操作过程：取2g 新鲜土壤，置于小口100 ml小口三角瓶中，并注入40ml 蒸馏水和5ml 0.3% H2O2，塞上塞子，将三角瓶放在恒温振荡机上（25 0C）,震荡20 分钟。而后迅速加入5ml 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤。然后，吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

2、结果计算：用于滴定的、土壤滤液所消耗的高锰酸钾量为B，用于滴定25ml原始过氧化氢混合液的所消耗的高锰酸钾量为A。

过氧化氢酶活性=(A — B)/2g — 土壤含水量

酶活性以1g敢图分钟内消耗0.1N高锰酸钾ml数表示。

三、 土壤多酚氧化酶（polyhphenol oxidase）活性的测定（比色法）

（一） 分析意义 多酚氧化酶参与土壤有机组分中 芳香族化合物的转化作用。土壤中的酚

类物质在多酚氧化酶作用下氧化生成醌。醌与氨基酸等通过一系列生物化学过长鞥所合成最初的胡敏酸分子。所以，多酚氧化酶是腐殖化的一种媒介，他是土壤氧化还原酶中了解的较多的一种酶。

（二） 方法选择及原理 在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚、三元

酚氧化成醌。根据基质的变化，测定多酚氧化酶的三种方法如下：

1、 比色法：多酚氧化酶酶促邻苯三酚，用乙醚提取生成的紫色没食子素；比色着色的

乙醚相，用紫色没食子素表示酶活性。此种方法具有速度快的优点，闭塞技术要求求严，培养PH值要准确，并且范围较窄。是目前广为应用的一种方法。

2、 碘量滴定法：本法根据多酚氧化酶酶促基质生成的醌，在酸性条件下，用标准碘液

滴定生成稳定的蓝色络合物，以碘的体积表示酶的活性。此法要注意保证反应所需要的酸度，对碱性土壤应加过量的酸，才易于判断滴定终点。

3、 测压法：本法用Warburg呼吸器，测定在多酚氧化酶作用下消耗用于氧化多酚化合

物的氧量，表示酶活性。此法要求仪器设备，且测定样品所需要时间较长。 测定多酚氧化酶常用的基质有邻苯二酚和邻苯三酚，由于测定多分氧化酶是基于测定加入土壤的多酚的演化速度，一般邻苯三酚氧化得最快，故常用邻苯三酚为基质，以比色法进行测定。

（三） 试剂配置

1、1%邻苯三酚溶液 2、乙醚

3、0.5N盐酸

4、重铬酸钾标准溶液：取0.75g K2Cr2O7 (优级纯)溶解於1L0.5N HCl(相当于50ml醚中含5mg紫色没食子素)

5、PH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液：0.2M磷酸氢二钠.2 H2O（分子量=178.05，35.61g/L）9ml与0.1N柠檬酸. H2O（分子量=210.14，21.01g/L）11ml混合而成。

（四）实验步骤

1、标准曲线的绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml重铬酸钾标准溶液于50ml比色管中，用0.5N HCl补足至35ml 制成相当于含汗0、100、300、500、700、900、1100、1300ug 没食子素的系列溶液，在分光光度计上于430nm处闭塞测定，制作标准曲线。 2、操作过程：取1g新鲜土样，置于100ml小口三角瓶中，先加4mlPH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液，然后加入10ml 1% 邻苯三酚溶液，摇荡三角瓶后盖上橡胶瓶塞，并放在30 C恒温箱中培养2h。培养结束后，加入35ml乙醚，在恒温振荡器上振荡15

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分钟（25C），静置5分钟。最后，将含有溶解的紫色没食子素的着色乙醚相在430nm 处进行比色。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色槽一次。 为了削除土壤中原油的醚溶性有机物质引起的误差及校正没食子酚的纯度，需设无土基质土壤对照和无土壤的及基质作对照，无基质的对照用水来代替。 3、结果计算：多酚氧化酶活性= 没食子素含量/1g — 土壤含水量

多酚氧化酶活性，以2 h 后1g干土紫色没食子素的含量表示。

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四、 土壤过氧化物酶（peroxidase）活性的测定（比色法）

（一）分析意义 过氧化物能氧化土壤有机质。一些过氧化物是土壤微生物生命活动的结果，也与某些氧化酶（如尿酸盐氧化酶）的作用有关，所以与多酚氧化酶一样，过氧化物在腐殖质的形成过程中具有重要的作用。 （二）方法选择及原理 过氧化物酶是一种含**铁的氧化酶，它按照下面两步与过氧化氢起反应：

过氧化物-----“氧化剂” 此步在过氧化氢酶催化下进行。

“氧化剂”+DH2------过氧化物酶+H2O+D

第一步是颇有选择性的、仅有氢、甲基化的过氧化氢与乙基过氧化物才能与这种酶结合，从而生成活泼的酶-----基质氧化物，然后此“氧化剂”再与还原型化合物（DH2）反应，而完成这一酶促反应。

由于土壤微生物生命活动而在土壤中积累一定过氧化物和其他还原型有机物质（多元酚、胺及杂环化合物），促使这一酶促反应的进行。它的活性在碳酸盐土壤中最高，并取决于土壤微生物的数量。

测定过氧化物美的方法原理与多酚氧化酶的相同。利用多分氧化物的、作为氢的受体，在经过氧化物酶的参与下，通过过氧化氢中氢的作用，多酚被氧化为着色的醌类化合物，颜色的深度与醌类化合物相关，据此表示酶活性。 （三）试剂配制

1、1%邻苯三酚溶液 2、0.5% H2O2溶液 3、乙醚

4、0.5N盐酸

5、重铬酸钾标准溶液：配制方法同多酚氧化酶活性测定。 6、PH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液：配制方法同多酚氧化酶活性测定 （四）实验步骤

1、标准曲线的绘制：参见多酚氧化酶测定。

2、操作过程：取1g新鲜土样，置于100ml小口三角瓶中，先加4mlPH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液，然后加入10ml1% 邻苯三酚溶液和2ml 0.5% H2O2溶液。振荡后按测定多酚氧化酶步骤萃取比色测定。与此同时设定无基质对照和无土壤对照，无基质对照用水替代。

3、结果计算：过氧化物酶活性=没食子素含量/1g — 土壤含水量

过氧化物酶活性，以2h后，1g干土中生成的紫色没食子素含量表示。

五、土壤脲酶（urease）活性的测定（比色法）

（一）分析意义 脲酶广泛存在于土壤中，是研究的比较深入的一种土壤酶。脲酶酶促产物————氨是植物氮源之一。尿素氮肥水解于脲酶密切相关。有机肥料中也有游离尿美的存在。同时脲酶与土壤其他因子（有机质含量、微生物数量）有关。研究土壤脲酶转化尿素的作用及其调控技术，对提高尿素氮肥利用率有重要的意义。

（二）方法选择及原理 脲酶是一种转性较强的酶。它能酶促尿素水解成氨、二氧化碳和水，Rotini(1935)，首先提出研究测定土壤脲酶，研究证明，中型介质中脲酶活性最强。故测定土壤脲酶时，一般采用中性缓冲体系，也有的研究者也用碱性缓冲液测定脲酶。测定土壤脲酶均采用尿素做基质，浓度范围为2——10%。 （三）试剂配制

1、PH6.7柠檬酸缓冲液：取368g柠檬酸溶于600ml蒸馏水中，另取259g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液混合，用1NNaOH讲PH调至6.7，并用水稀释至2L。

2、苯酚钠溶液：称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml（A液），保存在冰箱中，称27g氢氧化钠溶于100ml水中（B液），保存在冰箱中，使用前，取A、B两页各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。

3、次氯酸钠溶液：用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

4、10%尿素液。 5、甲苯

6、氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于睡并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液，绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。

（四）实验步骤

1、标准曲线的绘制：吸取西式10倍的标准液0、1、3、5、7、9、11、13ml，移于50ml比色管中，然后加蒸馏水20 ml。先加4 ml苯酚钠溶液，再立即加入3 ml次氯酸钠溶液，每加入一种试剂后均将混合物仔细混合。20分钟后显色，1h 内在分光光度计上于578nm处比色，制作标准曲线。

2、操作过程：取相当于5g 新鲜土壤置于100ml广口三角瓶中，加1ml甲苯。15分钟后加10ml 10%尿素液和20ml PH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀封口后在370C恒温箱中培养24h.取出过滤，过滤后取3ml滤液注入50ml比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行闭塞测定，实验需设无基质对照和无土壤对照，无基质对照用水替代。

3、结果计算：脲酶活性以24h后1g突然中氨基氮的含量表示。

NH3----N(ug) =a*10/5g — 土壤含水量

a ——测得的氨基氮的含量

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