质粒抽提详细步骤
更新时间:2023-10-06 05:22:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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质粒提取实验步骤
摇菌:(先倒入锥形瓶再消毒)
1 将配好的LB培养液高温消毒后,放入40C冰箱,冷却;
2 在酒精灯旁操作,向锥形瓶中加入100mlLB,加入150ul氨苄(看抗性); 3 再向锥形瓶中挑入少量菌(液体:60~80ul;固体:绿豆大小); 4 放入摇床,摇一夜。
LB培养液的配方
1)胰化蛋白胨() 10g/L(tryptone) 2)酵母提取物 5g/L(yeast extract) 3)Nacl 10g/L
4)去离子水(双蒸水)950ml 终体积为1000ml 5)配好后,需高温消毒(纱布或报纸包)
质粒提取:QIAGEN plasmid Midi kit(25)试剂盒
准备2个50mlEP管,提2个质粒一共要6个50mlEP管。 使用前注意事项:
1)P1在使用前要加入RNAase,终浓度为100ug/ml,P1一直放40C。 2)事先溶解P2(天冷时P2会出现沉淀,应放37 0C水浴溶解)。 3)预冷至P1、P3(P2作用为裂解细胞)至4 0C。
4)提质粒前一天消毒50ml,20ml管子及2mlEP管及LB,干燥待用。
5)摇菌和保菌都要开酒精灯,尽量保持无菌,用酒精灯擦桌子和瓶口,不能讲话或者戴口罩。
步骤:
1 摇菌100ml过夜(100ml菌分两次离心,锥形瓶中剩余的菌留作保菌用); 2 酒精灯旁操作,倒入50ml管子,6000g、15min(离心力/RCF)、40C(配平及记得更换转子/Rootor),离心完后弃去上清收集细菌;
3 用3ml P1重悬细菌沉淀物(充分溶解,沉淀可通过枪反复上下吸打混匀) 分两管离心,各加3ml P1,后再混合为一管,保证100ml菌液用了3ml P1重悬。 4 加3ml P2(P2比较粘稠,用之前要晃匀),充分混匀到整个液体都变蓝(上下轻柔颠倒4~6次),室温放置5min(混匀时不可过猛,以免弄断genemic DNA;裂解物是粘性的,溶解时间切勿超过5min,一旦加入P2就应立即将管子盖上,以防酸化);
5 加入预冷的P3 3ml,立即温和的混匀至蓝色消失(上下轻柔颠倒4~6次),放置冰上避光孵育15~20分钟 加入P3后,产生蓬松白色物质,沉淀物变得不粘(沉淀物包括genemic DNA、蛋白质、细胞碎片、SDS);
6 4 0C、≥20000g、30min离心,将上清液放入另一10ml的EP管(注意移动时不能晃,以免将沉淀转入),直接在离心室加,加完一个扔一个,注意一点沉淀都不能吸进去,吸时用双枪头,黄枪头套在蓝枪头外,减少冲击;
7 离心同时,用4mlQBT润洗QIAGEN-tip100(平衡膜),弃去脱下上液;
8 用2×10mlQC洗QIAGEN-tip100两次,弃去滴下的液体(注意滤膜不要干燥,管中液体满了就弃去,液面不要触及TIP下部,如果触及则用双蒸水冲洗),加入离心后并经过萃取
的上清液,萃取步骤如下图;
A A B B 离心后把上清液吸到干净的50ml的EP管,两管变一管,管盖和管壁上都标记。 加入等体积的氯仿上下颠倒混匀(萃取提纯) A B
20000g、15min、4 0C离心 把离心后的上清液直接加到TIP中过滤(TIP标记);
9 待液体差不多滤过时,用5ml的QF洗脱膜上的DNA,用10mlEP管收集洗脱物(最先流出来的3~4滴弃去),收集后混匀,可用摇床10min;
10 每管用3.5ml的室温异丙醇沉淀DNA,混匀10min,然后4 0C、≥15000g、离心30min,沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观,非常松软,弃去上清时小心;
11 先加1ml的70%乙醇洗DNA沉淀,移入1.5ml的EP管(把沉淀打散后再移入,能不用2mlEP尽量不用,TIP的架子要回收),15000g离心10分钟,倒去上液,不要触及沉淀,重复洗一次(把沉淀吹打到液体中,轻柔);
12 空气中干燥沉淀5~10分钟,待干燥后(无色透明)用合适体积(50ul)的AE溶解沉淀(560C水浴10min,加快溶解),放入4 0C冰箱过夜; 13 第二天测浓度(DNA),稀释到1ug/ul,待转染用。
提质粒和保菌:
1 将摇菌过夜后变浑浊(培养基加入抗生素)的锥形瓶取出,分别装到2个50ml的EP管中,离心4 0C、6000g、5min。把上清液倒掉,放入—800C保存,等待有时间再提。
2 锥形瓶中剩余的菌液可以保菌,将其转入1.5mlEP,菌:甘油=7:3,上下颠倒混匀后—80 0C保存(现加700ul菌液,后剪掉蓝枪头的尖端加300ul甘油)。
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