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一株海带内生菌的鉴定及活性研究

目录

摘要 ................................................. Ⅰ Abstract ............................................. Ⅱ 第一章 前言 ....................................... - 1 -

1.1 植物内生菌 ................................... - 1 - 1.2 内生菌的研究现状及存在问题 ...................... - 1 - 1.3 研究的目的及意义 .............................. - 1 -

第二章 实验方法 .................................... - 3 -

2.1抑菌活性培养条件的优化 .......................... - 3 - 2.2鉴定 ........................................ - 4 - 2.3抗氧化活性培养条件的优化 ........................ - 8 -

第三章 结果与讨论 ................................. - 10 -

3.1抑菌活性条件的优化结果 ......................... - 10 - 3.2菌株鉴定的结果 ............................... - 13 - 3.3抗氧化活性条件的优化结果 ....................... - 21 -

第四章 结论 ...................................... - 24 - 致 谢 ........................................... - 25 - 参考文献 ......................................... - 26 - 附录Ⅰ 文献综述 ................................... - 27 -

附录Ⅱ 外文翻译 ................................... - 31 - 附录Ⅲ 外文原文 ................................... - 39 -

摘要

植物的内生菌能够产生丰富的生物活性物质。本研究以一株海带内生菌为研究对象,对其抑菌活性和抗氧化活性进行检测，采用正交试验法对该菌株抑菌活性培养条件进行优化，得到较佳优化条件为：温度35℃，pH值9，培养时间7天，培养基中牛肉膏浓度为7 g/L，蛋白胨浓度为10g/L；同样采用正交试验法得到抗氧化活性较好的条件为: 温度35℃，pH值9，培养时间1天，培养基中牛肉膏浓度为3 g/L，蛋白胨浓度为12 g/L；采用显微镜观察、培养特征鉴别方法、生理生化鉴别方法对菌株进行鉴定。结果表明：此菌株为革兰氏阳性，有芽孢，V.P反应为阳性,对溶菌酶没有抗性,在pH5.7的培养基下生长较好，能产生过氧化氢酶，可水解淀粉,能利用柠檬酸盐，在厌氧条件下可以生长，卵磷脂酶实验为阴性，在7% NaCl的培养基中生长良好，硝酸盐还原反应为阳性，苯丙氨酸脱氨实验为阳性，与巨大芽孢杆菌符合率为90%，因此将其鉴定为巨大芽孢杆菌。

关键词：海带内生菌；抑菌活性；抗氧化活性；鉴定

大连海洋大学本科毕业论文（设计） Abstract

Abstract

Endophytes in plants can produce a wealth of biologically active substances. In this study, we detected the antimicrobial activity and antioxidant activity of a kelp endophyte. Using the orthogonal experiment method, the cultured conditions were definite. The best optimal conditions: The concentration of the beef extract and petone was 7 g/L and 10 g/L and the vaule of pH was 9 and it was cultured at 35℃ for seven days. Also using the orthogonal experiment method obtained the best conditions of antioxidant activity : The concentration of the beef extract and petone was 3g/L and 12g/L and the vaule of pH was 9 and it was cultured at 35℃ for one day. The marine strain was identified by using the microscope view methods, culture characteristics,physiological and biochemical methods and molecular biology. The results show that this strain was Gram-positive, has bacillus , V.P reaction is positive and there is no resistance on the lysozyme. The strain grows well in the pH value 5.7. it could produce catalase, hydrolysis of starch and use of citrate. It also can grow under anaerobic conditions. Its lecithinase test was negative. In 7% NaCl grew well in the medium. Its nitrate reduction and phenylalanine deaminase test were positive. Bacillus megaterium was found with 90%, so it was identified as Bacillus megaterium.

Key words: Kelp endophyte, Antibacterial activity, Antioxidant activity, Identification

Ⅱ

大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第一章 前言

第一章 前言

1.1 植物内生菌

内生菌(Endophyte)指那些在其生活史的某一段时期生活在植物组织内部而不引起植物组织明显症状改变的菌[1]，植物内生细菌的早期研究始于1876年Pasteur提取的无菌葡萄果汁[2],1992

年，克洛珀第1次提出了“植物内生细菌”的概念[3].目前, 对植物内生菌的定义仍然有不少争论, 但Hall mann 等人依据内生菌与植物的相互关系提出的概念是目前使用最广泛的,他认为植物内生菌应满足两个条件：一是从表面消毒的植物组织或植物组织内部获得的；二是它们的存在不会造成植物出现可见的伤害或功能的改变

[4]

1.2 内生菌的研究现状及存在问题

目前国内外学者对内生菌的抗菌活性，抗病毒活性，抗肿瘤活性等等都做了系统的研究。 尹建雯等从芦荟中分离筛选出88株内生真菌，其中35株对1种或多种皮肤致病真菌，如毛样枝孢霉(Cladosporium trichoides)、紧蜜单孢枝霉(Hormodendrum con—pactum)、皮炎单孢枝霉(Hormodendrum dermatitidis)等有抑制生长作用[5]，Brady等从来源于Selaginella pallescens植物茎的内生真菌镰刀菌的培养物中分离到一种新型的酮内酯化合物，对白色念珠菌(Candida albicans)有较强活性[6].最近，Strobel研究小组又从澳大利亚北部的一种有叶蕨类植物(Grevillea pteridifolia)中分离到一株新内生链霉菌Streptomyces sp．NRRL 30566，它能产一种被称为kakadumy—cins的新型抗菌素，其对炭疽芽孢杆菌、棘霉素、疟原虫有明显的抑杀活性[7].有研究人员发现内生真菌Cytortaema sp．能够产生一种新物质—— 聚烷基芳烃对人类的HIV有很好的抑制作用[8].

日本学者从甘遂中得到巨大戟烷型二萜酯，并对其进行结构修饰得到一系列化合物，都具有显著的抗艾滋病病毒的活性；从E．fidjiana中分离得到的二萜酯具有很强的抑制HIV-1逆转录酶的活性，其不具有巨大戟烷型二萜酯及巴豆烷型二萜酯的皮肤刺激性及辅助致癌作用[9].

张玲琪等发现长春花的内生真菌尖镰孢(Fusarium oxyspomm)可以产生长春碱[10]。王梅霞等证明从杜仲叶片中分离到的一种内生刺孢壳菌(Chaetomella sp．)产生抗氧化活性成分的黄酮类化合物[11].

存在的主要问题首先是分离纯培养困难，容易被植物表面的微生物污染；其次，对作为未来微生物防腐剂前身的植物内生菌抗菌物质的毒性研究较少，需要对提纯的抗菌物质进行毒理学和临床性试验。

1.3 研究的目的及意义

植物内生菌能产生多种活性物质，具备多种生物学功能，同时又具有微生物易培养、易控制，生长繁殖迅速，不受季节、气候和地域的限制等优点，并可以通过诱变育种、细胞融合和基因工程等手段改良菌种性能，提高产量，是一类开发潜力巨大的生物资源[12],在人和动物病原菌抑制

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第一章 前言

物质的产生方面，由于抗生素的使用，使环境中产生大量的抗药菌株，一般的抗生索已经对这些菌没有抑制作用，因此，寻找新的对抗药菌株有抑制活性的物质迫在眉睫。研究表明，植物内生菌能产生对抗药菌株有抑制活性的新物质，对植物内生菌的开发将具有十分重大的经济意义[13]。因此对一株具有抑菌活性的海带内生菌进行了研究。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

第二章 实验方法

2.1抑菌活性培养条件的优化

2.1.1材料和仪器

材料：一株具有抑菌活性的海带内生菌菌株。 试剂：淡水牛肉膏培养基。

设备： S.HS-1300净化工作台 上海跃进医疗器械厂

YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司 101-2B电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司 HH.BII.420-BS电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂 ZD-85A测速气浴振荡器 苏州威尔实验用品有限公司 微量移液器 大龙医疗设备（上海）有限公司

其他仪器：试管、烧瓶、注射器、酒精灯、三角涂棒、滤纸片、镊子、培养皿等。 2.1.2正交优化实验

利用正交试验[14]方法对具有抑菌活性的菌株的抑菌条件进行优化，其因素水平表见表1，按照正交试验表进行试验，正交试验方案见表2-1, 对不同发酵条件采用滤纸片法[15]，以抑菌圈直径为评价标准，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌为指示菌进行抑菌实验，根据正交试验结果得出具有最优抑菌活性的条件。

表2-1 正交因素水平表

因 素

水平

A 温度/℃

1 2 3 4

25 30 35 40

B PH 3 5 7 9

C 发酵时间/d

1 3 5 7

D

牛肉膏浓度/g/L

1 3 5 7

E

蛋白胨浓度/g/L

6 8 10 12

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

表2-2 抑菌活性发酵条件正交试验表

因 素

试验号

A（温度）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 B(pH)

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 C（时间）

1 2 3 4 2 1 4 3 3 4 1 2 4 3 2 1 D(牛肉膏浓度)

1 2 3 4 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 3 E（蛋白胨浓度）

1 2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2 2.2鉴定

2.2.1菌株形态观察

材料试剂：18-24小时的幼龄菌株，5%番红，95%乙醇，结晶紫，路哥式碘液，美兰，孔雀石绿溶液；

仪器：电子显微镜，载玻片，镜台测微计，接目测微计，香柏油，擦镜纸，接种环，镊子，酒精灯，夹子等；

菌落形态观察：平板划线法。采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，在无菌操作台中接种后，37℃培养24h[16]。革兰氏染色及菌体大小测定：涂片-晾干-加热固定-初染（结晶紫溶液，1~2分钟）-水洗-媒染（路哥式碘液，1~2分钟）-水洗-脱色（95%乙醇冲洗2~3次）-水洗-复染（番红溶液，1分钟）-水洗-吸干-镜检。

测量菌体大小：革兰氏染色后镜检，放置接目测微计-放置镜台测微计-校准接目测微计的长度-计算接目测微计每个的长度-测量菌的大小-用后处理-计算.

两重叠刻度间台微尺格数?10每小格长度?

两重叠刻度间目微尺格数- 4 -

大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

芽孢染色[17]: 涂片-干燥-加热固定-初染（孔雀石绿溶液，10分钟，用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干）-水洗-复染（番红溶液，1分钟）-水洗-吸干-镜检。

美兰染色：涂片-干燥-加热固定-染色（美兰溶液，2分钟）-水洗-吸干-镜检。

2.2.2生理生化鉴定

材料：幼龄菌株

设备： S.HS-1300净化工作台 上海跃进医疗器械厂

YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司 101-2B电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司 HH.BII.420-BS电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂

微量移液器 大龙医疗设备（上海）有限公司 721型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司

其他仪器：试管，培养皿，报纸，棉绳，250ml、500ml三角瓶，酒精灯，镊子，香柏油，擦镜纸等，接种环、移液管，洗耳球等。

试剂：见如下各实验培养基。

所需培养基配方及所需试剂：

运动性实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂8g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

过氧化氢酶实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH7.0-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

试剂：3~5%过氧化氢。 厌氧生长实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，吊白块1g，121℃高压蒸汽灭菌20min。

V.P实验：培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，PH7.0-7.2分装于试管，每管约5ml，8磅高压蒸汽灭菌20min。

试剂：40%NaOH，肌酸。 最高生长温度测定实验：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。 卵磷脂酶测定实验：

培养基[18]：在无菌操作下取出卵黄，加等量的生理盐水，摇匀后，取10ml卵黄液加入到熔化的约50℃的已准备好的肉汤蛋白胨培养基中，混匀后倒制成平板，过夜后可用。

对溶菌酶（0.001%）的抗性实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨20g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml， 121℃高压蒸汽灭菌20min，配制成中性营养肉汤培养基，取1ml溶菌酶溶液与99ml无菌肉汤培养基混合，分装无菌试管，每管约2.5ml。

试剂：溶菌酶溶液。 耐盐性实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨20g，氯化钠7g，蒸馏水1000ml， 121℃高压蒸汽灭菌20min。 在PH5.7的营养肉汤上的生长实验：

培养基：蛋白胨10g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，调节PH5.7，分装试管，8磅灭菌20min。 糖发酵实验：

培养基：磷酸氢二铵1g，七水合硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，酵母膏0.2g，木糖（葡萄糖，阿拉伯糖，甘露醇替换）10g，琼脂17g，蒸馏水1000ml，0.04%溴百里酚蓝20ml，PH7.0-7.2，分装试管，8磅灭菌20min。

淀粉水解实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂17g，蒸馏水1000ml， 15磅灭菌20min。

试剂：路哥氏碘液。 柠檬酸盐利用实验：

培养基：氯化钠5g，七水合硫酸镁0.2g，磷酸氢二铵1g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸钠2g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，1%溴百里酚蓝溶液10ml，PH6.8~7.0，最后加入指示剂，使培养基呈草绿色，分装试管，121℃高压蒸汽灭菌20min，搁置斜面。

硝酸盐还原实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，硝酸钾1g，PH7.0~7.4，15磅灭菌20min。

试剂：格里斯氏试剂，二苯胺试剂。 苯丙氨酸脱氨实验：

培养基：酵母膏3g，L-苯丙氨酸1g，磷酸氢二钠1g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，PH7.0，8磅灭菌20min。

试剂：10%（w/v）的FeCl3溶液。 酪素水解实验：

培养基：取5g脱脂奶粉加入到50ml蒸馏水中，另外称1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，将两液分开灭菌，待冷至45~50℃时，将两液混匀倒平板，制成牛奶平板，将平板倒置过夜，即可使用。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

酪氨酸水解实验：

培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，酪氨酸1g，PH7.0，121℃高压蒸汽灭菌15min后，搁置斜面。

实验方法：

运动性实验：接菌以穿刺法接种于半固体琼脂培养基中，37℃培养1-3天，进行观察。 过氧化氢酶实验：挑取一环培养18~24h的菌苔接于平板培养基中，37℃培养18-24小时后，将适量3~5%过氧化氢溶液倒入培养物中，若有气泡产生，则为阳性反应。无气泡者为阴性。

厌氧生长实验：挑取一环培养18~24h的菌苔接于液体培养基中，37℃培养1天到两天，观察细菌是否生长。

V.P实验：接菌于实验培养基中，适温培养3天，7天，取培养液和等量的40%NaOH混合，加入少量肌酸，充分振荡2~5min，观察，如培养液出现红色，即为V.P阳性。

最高生长温度测定实验：将试验菌株接于实验培养基中，于52℃培养5天，观察细菌生长情况。

卵磷脂酶测定实验：在卵黄平板上接菌，每板上点4-5株菌，适温培养1-2天，在菌落周围和下面有不透明的区域出现，表示卵磷脂被分解生成脂肪，存在卵磷脂酶，该反应为阳性，否则为阴性。

对溶菌酶（0.001%）的抗性实验[19]：在含有0.001%的溶菌酶管及无溶菌酶的营养肉汤管中，各接种一环菌液，37℃培养7-10天，记录2组生长情况并测定OD值。

耐盐性实验：在含有7%NaCl的培养基中接菌，放入37℃培养4~5天，与未接种的对照管对比，目测生长情况。

在PH5.7的营养肉汤上的生长实验：接菌在营养肉汤培养基中，PH值一组为5.7，另一组为7.2，37℃培养1-3天观察生长情况。（要求培养基必须澄清，PH必须准确）。

糖发酵实验：做四组实验，1葡萄糖发酵，2木糖发酵，3甘露醇发酵，4 阿拉伯糖发酵。用18-24小时的幼龄菌种，穿刺法接菌，37℃培养1，4，7天，观察结果。做空白对照，培养基由绿变黄，表示糖发酵产酸，为阳性反应，若出现气泡，则表示产气。

淀粉水解实验：取菌种接菌于平板上，37℃培养2-4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥式碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，如果菌落周围和下面出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，反应呈为阳性。

柠檬酸盐利用实验：取幼龄菌种，接种在斜面上，空白作对照，37℃培养2-7天，培养基变蓝为阳性，不变为阴性。

硝酸盐还原实验：接菌于硝酸盐还原实验培养基中，另一组不接菌做空白对照，37℃培养1天，3天，5天。观察时，取两支干净的试管倒入少许培养液，然后在其中分别各滴一滴试剂A液和B液，在对照管中同样加试剂。当培养液变为粉红色，玫瑰红色，橙色或者棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加少许二苯胺试剂，此时，如呈蓝色反应，则表示培养基中仍有硝酸盐，如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都已经还

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

原成其他物质，故仍按照硝酸盐还原阳性处理。

苯丙氨酸脱氨实验：取试验菌株接种于上述培养基上，37℃培养3~7天。然后用10%三氯化铁溶液4-5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上的冷凝水产生绿色时，为阳性反应，证明了苯丙酮酸已形成。不产生绿色为阴性。

酪素水解实验：将菌种接在已准备好的牛奶平板上，每板点3-5株菌。37℃培养3天，观察菌落周围和下面酪素是否被分解而呈透明。

酪氨酸水解实验：接种于斜面试管培养基，37℃培养3-7天，观察是否产生黑色素，产生为阳性反应。

2.3抗氧化活性培养条件的优化

2.3.1材料和仪器

材料：幼龄菌株

设备：S.HS-1300净化工作台 上海跃进医疗器械厂

YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器 上海三申医疗器械有限公司 101-2B电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司 HH.BII.420-BS电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂

微量移液器 大龙医疗设备（上海）有限公司 721型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司 其他仪器：试管，试管架，移液管，洗耳球等。

主要试剂：Tris--Hcl(50 mmol／L，pH值8.2)缓冲液，邻苯三酚溶液(3 mmol／L），水杨酸-乙醇（3.75 mmol/L），H2O2（8.8 mmol/L），FeSO4（2.5 mmol/L），抗坏血酸5 mg/mL（对超氧阴离子自由基(O2-)清除作用的测定），抗坏血酸0.4 mg/mL（对羟自由基(·OH)清除作用的测定）。

试剂均为分析纯。其中：无水乙醇，沈阳市联邦试剂厂；水杨酸，天津市大茂化学试剂厂；硫酸亚铁，天津市泷船化学试剂厂；30 %过氧化氢，沈阳市联邦试剂厂；抗坏血酸，天津市博迪化工有限公司；Tris，天津市科密欧化学试剂有限公司；邻苯三酚，汕头市西陇化工厂有限公司；浓盐酸，沈阳市联邦试剂厂。 2.3.2 正交优化实验

利用正交试验方法对具有抗氧化活性的菌株的发酵条件进行优化，其因素水平表见表1，按照正交试验表进行试验，正交试验方案见表2, 对不同发酵条件进行两种实验测定，即：邻苯三酚自氧化体系对超氧阴离子自由基(O2-)清除作用的测定和Fenton体系中对羟自由基(·OH)清除作用的测定，根据正交试验结果得出具有最优抗氧化活性的条件。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第二章 实验方法

邻苯三酚自氧化体系对超氧阴离子自由基(O2-)清除作用的测定[20]：取pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液5 mL于试管中，加入不同发酵条件样液0.25 mL，最后加入3 mmol/L邻苯三酚0.1 mL启动反应，迅速混匀。在25℃反应15 min。使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处时测吸光度A i，并测定本底扣除水解液自身的干扰。用5 mg/mL抗坏血酸溶液作对照。多糖液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下：

S(%)=[Ao－(Ai－Aj)]/Ao×100％

式中，Ao为试剂空白的吸光度值（Tris-Hcl+邻苯三酚+蒸馏水）；Ai为样液的吸光度值；Aj

为样液本底的吸光度值（Tris-Hcl+样品液）。

Fenton体系中对羟自由基(·OH)清除作用的测定[21]：取FeSO4 1 mL、水杨酸-乙醇1 mL、样品提取液1 mL，最后加入H2O2 1 mL启动反应。在37 ℃反应30分钟，冷却至室温。以蒸馏水做空白对照，抗坏血酸为阳性对照，用可见光分光光度计在510 nm下测吸光度值。平行做2组试验。提取物对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算：

清除率S(%)=（Ao－Ai） /Ao×100％

式中，Ai为样品组OD值；A0为空白组OD值（不加样液）。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

第三章 结果与讨论

3.1抑菌活性条件的优化结果

依据正交试验方案对实验菌株进行抑菌条件优化，其结果分析如表3-1，图2.1，图根据试验结果表，利用极差分析法得到抑菌活性的最优条件如表3-2 ，即抑菌活性的最优条件是培养温度35℃，pH值为9，培养天数为7天，牛肉膏浓度为7g/L，蛋白胨浓度为10g/L。

表3-1 抑菌条件优化试验结果 因素

试验号

A 温度

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 大肠

K1 K2 K3 K4 ?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R K1 K2 K3 K4

1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 50.5 27 9 4.25 12.63 6.75 2.25 1.06 11.57 31.5 27.75 36.25 33

B p H 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 17.75 23 26.5 25 4.44 5.75 6.63 6.25 2.19 17.75 33.5 33.25 44

C 时间 1 2 3 4 2 1 4 3 3 4 1 2 4 3 2 1 15 17 31.5 27.25 3.75 4.25 7.88 6.81 4.13 39.25 24.25 29 36

D 牛 1 2 3 4 3 4 1 2 4 3 2 1 2 1 4 3 21.5 25.75 16 27.5 5.38 6.44 4 6.88 2.88 25.25 32.75 32.75 34

E 蛋 1 2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2 23.5 30.5 22.25 14.5 5.88 7.63 5.56 3.63 4 32 31.5 35 30 - 10 -

指标（抑菌圈直径） 大肠 杆菌 9 14 14 13.5 0 6 10.5 10.5 6 2 0 1 1.25 1 2 0 T=90.75

枯草芽 孢杆菌 5.25 6.25 8.25 11.75 1 10.25 7.25 9.25 5 10.5 10.75 10 6.5 6.5 7 13 T=128.5

变形 杆菌 3.75 6.5 7 8.5 2 6.75 7.5 5.5 6.5 7 7 7 4 7 7 3

产气 杆菌 1 0 1.5 3.5 1 3 1.5 1 0 1.5 0 0 1 0 1 3

金葡 球菌 1.5 12 9 11 1 7 8.5 11.5 1.5 1 0 1 2.5 0.5 1 0

大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论 枯草

?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R K1 K2 K3 变 形

K4 ?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R K1 K2 K3 K4 产产气

?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R K1 K2 K3 金 K4 金葡

?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R

7.88 6.94 9.06 8.25 2.12 25.75 21.75 27.5 21 6.44 5.44 6.88 5.25 1.63 6 6.5 1.5 5 1.5 1.63 0.38 1.25 1.25 33.5 28 4.5 4 8.38 7 1.13 1 7.38

4.44 8.38 8.31 11 6.56 16.25 27.25 28.5 24 4.06 6.81 7.13 6 3.07 3 4.5 4 7.5 0.75 1.13 1 1.88 1.13 6.5 20.5 18.5 23.5 1.63 5.13 4.63 5.88 4.25

9.81 6.06 7.25 9 3.75 20.5 22.5 26 27 5.13 5.63 6.5 6.75 1.62 7 2 2.5 7.5 1.75 0.5 0.63 1.88 1.38 8.5 15 22.5 23 2.13 3.75 5.63 5.75 3.62

6.31 8.19 8.19 8.5 2.19 25.25 23 19 28.75 6.31 5.75 4.75 7.19 2.44 2.5 2 7 7.5 0.63 0.5 1.75 1.88 1.38 11.5 26 11 20.5 2.88 6.5 2.75 5.13 3.75

8 7.88 8.75 7. 1.75 23.25 23.5 24.75 24.5 5.81 5.88 6.19 6.13 0.38 4.5 4.5 5.5 4.5 1.13 1.13 1.38 1.13 0.25 15 22 19.5 12.5 3.75 5.5 4.88 3.13 2.37

T=96

T=9

T=69

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

图3.1 抑菌条件优化试验结果

表3-2 最优条件

最 优 条 件

大肠 枯草 变形 产气 金葡 综合

A1B3C3 D4E2

A3B4C1 D4E3

A3B3C4 D4E3

A2B4C4D4E3

A1B4C4 D2E2

A3B4C4 D4E3

对优化结果进行验证，得到实验结果，如图3.2:

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

3.2菌株鉴定的结果

3.2.1菌株形态鉴定的结果

菌落形态：菌落呈圆形，白色，容易挑取，边缘光滑，如图3.3:

图3.3菌落形态图

美兰染色：美兰染色后发现菌体上有不着色颗粒。如图3.4：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

3.4美兰染色 图3.5革兰氏染色

革兰氏染色：通过革兰氏染色法染色结果为菌体为紫红色，为革兰氏阳性菌，如图3.5： 大小测定：两重叠刻度间台微尺格数为1，两重叠刻度间目微尺格数为26，所以目微尺每小格长度为0.385微米，如图5，待测菌株长度为13-14小格，宽度为3－4小格，所以长度为5.005－5.39微米，宽度为1.155‐1.54微米。如图3.6

图3.6菌株大小测定 左图为宽度，右图为长度。

芽孢染色：利用芽孢染色法观察到其可产生芽孢，芽孢囊不明显膨大，芽孢中生到端生，如图3.7：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

图3.7 芽孢染色

3.2.2菌株生理生化鉴定

运动性实验：没有沿穿刺线向周围扩散，没有鞭毛，没有运动性。如图3.8：

过氧化氢酶实验：在菌落上滴加过氧化氢溶液后出现气泡，该反应为阳性。如图3.9：

图3.8 运动性实验 图3.9 过氧化氢酶实验 厌氧生长实验：试验菌株在厌氧的条件下可以生长。如图3.10：

图3.10 厌氧生长实验

V.P实验：接菌后培养3d,7d,后，加入奥梅拉氏试剂，摇匀，置于37摄氏度培养箱中4小时，观察结果没有变红，为阴性反应。培养7d后测得PH=4.6 如图3.11：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

3d 7d

图3.11. V.P实验 左：空白，右：接菌。

最高生长温度测定实验：接菌后的试管于52℃培养5天后，观察到细菌可以生长。但是生长的很弱，如图3.12：

图3.12 最高生长温度测定实验

卵磷脂酶测定实验：在菌落周围和下面没有不透明物质，该反应为阴性。如图3.13：

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图3.13 卵磷脂酶测定实验 图3.14对溶菌酶（0.001%）的抗性实验

大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

左：加入溶菌酶，右：正常培养基

对溶菌酶（0.001%）的抗性实验：该菌在加入溶菌酶的培养基中生长很弱，证明该菌对溶菌酶抗性较弱，其吸光度见表3-3，照片如图3.14：

表3-3 溶菌酶对活性菌株生长菌液影响的OD值

样品编号

C+R+DN

1 2

0.122 0.132

C+DN 0.862 0.850

DN

0.037 0.030

注：C+R+DN表示培养基试管中加溶菌酶溶液并接待测菌；C+DN表示培养基试管中不加溶菌酶溶液但接待测菌；DN表示培养基试管中不加溶菌酶溶液且不接待测菌。

耐盐性实验：两组实验中

NaCl浓度分别为7%和0.5%，试验菌株在NaCl浓度为7%的培养基

中生长良好，如图3.15：

在PH5.7的营养肉汤上的生长实验：吸光度分别为：PH5.7：0.443；PH7.2:0.326。所以菌株在PH5.7的培养基中比PH7.2的生长的好。如图3.16：

图3.15 耐盐性实验 图3.16 PH5.7营养肉汤生长实验

左：空白，右：接菌 左：PH7.2，右：PH5.7

糖发酵实验：

a. 葡萄糖：培养基由蓝变黄，为阳性反应。如图3.17-a：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

1d

4d

7d

图3.17-a葡萄糖发酵 左：接菌，右：空白.

b. 木糖：培养基由蓝变黄，为阳性反应。如图3.17-b：

1d 4d 7d

图3.17-b.木糖发酵 左：空白，右：接菌.

c. 甘露醇：培养基由蓝变黄，为阳性反应。如图3.17-c.

1d 4d 7d

图3.17-c甘露醇发酵 左：空白，右：接菌.

d. 阿拉伯糖：培养基变黄，为阳性反应。如图3.17-d.

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

1d

4d

7d

图3.17-d.阿拉伯糖发酵

左：空白，右：接菌.

淀粉水解实验：滴加路哥氏碘液后，在菌落下方出现无色透明圈，反应为阳性。如图3.18： 柠檬酸盐利用实验：接菌后培养基由绿变蓝，该反应为阳性。如图3.19：

中间：空白，两边：接种.

图3.18淀粉水解实验 图3.19 柠檬酸盐利用实验

硝酸盐还原实验：接种后分别在37℃下培养1d,3d,5d. 空白对照加入格里斯氏试剂混合液不变色,在接菌试管中加入格里斯氏试剂混合液也不变色,之后加入二苯胺试剂,不呈现蓝色,为阳性反应。如图3.20：

1d 3d 5d

图3.20 硝酸盐还原实验 左：空白 右：接菌.

苯丙氨酸脱氨实验：滴加FeCl3试剂后培养基没有产生绿色，所以为阴性反应。如图3.21：

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

图3.21. 苯丙氨酸实验 图3.22. 酪素水解实验

左：空白，右：接菌

酪素水解实验：菌落周围出现透明圈，酪素被水解，该反应呈阳性，如图3.22： 酪氨酸水解实验：接菌的试管内培养基上产生黑色素，为阳性反应。如图3.23：

中间：空白，两边：接菌

图3.23. 酪氨酸水解实验

根据生理生化鉴定结果如表3-4与芽孢杆菌属典型菌株的检索表对比，确定待测菌株属于巨大芽孢杆菌。

表3-4 生理生化鉴定结果表

性质

宽（um）

菌体

长（um） 革兰氏反应

椭圆

芽孢椭圆

中生到端生 芽孢囊膨大

运动性 过氧化氢酶

结果 1.155‐1.54 5.005-5.39

+ + + - - +

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

厌氧生长 V.P反应 V.P中的PH值 最高生长温度（℃） 卵磷脂酶 抗溶菌酶（0.001%） 生长在NaCl(7%) pH5.7的培养基生长

木糖 葡萄糖

产酸

阿拉伯糖 甘露醇

淀粉水解 柠檬酸盐利用 硝酸盐还原 苯丙氨酸脱氨 酪素水解 酪氨酸水解

注：具有易变特征的菌株百分数；+=85~100；a=50~84；b=15~49；-=0~14；V=易变特征。

+ - 4.6 52 - - + + + + - + + + + - + a

3.3抗氧化活性条件的优化结果

依据正交试验方案对实验菌株进行抗氧化条件优化，其结果分析如表3-5，图3.24，根据试验结果表，利用极差分析法得到抗氧化活性的最优条件如表3-6 ，即抗氧化活性的最优条件是培养温度35℃，pH值为9，培养天数为1天，牛肉膏浓度为3 g/L，蛋白胨浓度为12 g/L。

表3-5抗氧化条件优化试验结果

试验号

A 温度

1 2 3 4 5 6

1 1 1 1 2 2

B p H 1 2 3 4 1 2

指标（清除率） C 时间 1 2 3 4 2 1

D 牛 1 2 3 4 3 4

E 蛋 1 2 3 4 4 3

超氧阴离子自由基

0.00% 41.95% 50.99% 46.60% 60.91% 65.37%

羟自由基 57.82% 43.90% 37.5% 6.25% 0.00% 11.26%

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 K1

超氧阴离子自由基 羟自由基

K2 K3 K4 ?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R K1 K2 K3 K4 ?K1 ?K2 ?K3 ?K4 R

2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 139.54% 255.86% 256.92% 209.31% 34.89% 63.97% 64.23% 52.33% 29.34% 145.47% 31.36% 156.45% 80.66% 36.37% 7.84% 39.11% 20.17% 31.27%

3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

4 3 3 4 1 2 4 3 2 1

1 2 4 3 2 1 2 1 4 3 169.67% 239.06% 232.74% 220.16% 42.42% 59.77% 58.19% 55.04% 17.35% 148.38% 155.19% 47.85% 62.52% 37.10% 38.80% 11.96% 15.63% 26.84%

2 1 2 1 4 3 3 4 1 2 187.17% 213.39% 243.27% 217.8% 46.79% 53.35% 60.82% 54.45% 14.03% 98.02% 79.16% 109.71% 127.05% 24.51% 19.79% 27.43% 31.76% 11.97%

59.61% 69.97% 55.38% 64.39% 68.69% 68.46% 58.45% 41.60% 52.81% 56.45% T=913.63%

0.00% 20.10% 35.26% 10.35% 70.54% 40.30% 20.65% 50.26% 9.75% 0.00% T=413.94%

174.74% 190.51% 213.31% 224.13% 232.1% 43.69% 53.33% 58.03% 60.37% 16.68% 115.77%

217.94% 47.63% 56.03% 54.49% 57.26% 9.63% 93.95%

241.48% 229.05%

113.73% 139.62%

117.79% 123.02% 66.65% 28.43% 28.94% 29.45% 16.66% 12.79%

37.25% 34.91% 23.49% 30.76% 9.31% 25.6%

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第三章 结果与讨论

图3.24 抗氧化条件优化试验结果

表3-6最优条件表

最优条件

超氧阴离子自由基

羟自由基

A3B3C1D2E4

综合

A3B4C1D2E4

A3B4C4D2E3

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 第四章 结论

第四章 结论

本次实验以具有抑菌活性和抗氧化活性的海带菌株为材料，淡水牛肉膏蛋白胨培养基为基础培养基，运用正交实验法进行优化实验，得到具有较佳抑菌活性的发酵条件和具有较佳抗氧化活性的发酵条件，较佳优化条件为：温度35℃，pH值9，培养时间7天，培养基中牛肉膏浓度为7 g/L，蛋白胨浓度为10g/L；抗氧化活性较好的条件为: 温度35℃，pH值9，培养时间1天，培养基中牛肉膏浓度为3 g/L，蛋白胨浓度为12 g/L；并且还对菌株进行形态鉴定和生理生化鉴定，得出以下结论：该菌株为革兰氏阳性菌，原生质中有不着色颗粒，杆状，菌落呈圆形，白色，有芽孢，无运动性，过氧化氢酶实验为阳性，在没有氧气条件下可以生长，V.P实验阴性，卵磷脂酶实验为阳性，对溶菌酶抗性较弱，在NaCl浓度为7%和PH5.7的培养基中生长良好，能分解淀粉，可以利用柠檬酸盐，可以还原硝酸盐，苯丙氨酸脱氨试验及酪素水解反应都为阳性。通过以上的实验鉴定该菌株，证明该菌为巨大芽孢杆菌。通过本次试验，使我们更加充分的了解了此内生菌的生物学特性，这些研究方法和结果为微生物抑菌活性和抗氧化活性物质的开发利用提供了理论依据。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 致 谢

致 谢

光阴似箭，日月如梭，四年的大学生活在这个季节即将画上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始，这短短的四年，是最真诚的青春，是最纯真的岁月，我在亲爱的老师和同学们的陪伴下共同在大连海洋大学走过，在这里，在老师们的谆谆教诲下，我学会了勤奋学习，诚实做人，踏实做事，指引着我们沿着正确的方向前进。

这次的毕业论文，我在老师和学姐以及同学们的帮助下顺利的完成了，首先我要感谢俞微微老师，本论文是在指导教师俞微微老师的细心指导及严格要求下顺利完成的。从论文的选题、研究计划的制定到技术路线的选择，各个方面都离不开张付云老师热情耐心的帮助和教导，在这几个月实验中，在老师的教导下，我不仅学会了很多专业上的知识，还学会了认真、严谨的处理问题，使我受益匪浅。在这里我要向俞微微老师表示最真挚的谢意。

在此，我也要感谢各位食品工程学院的老师，在这四年的学习当中，是他们让我学习到了很多食品方面的专业知识，为完成毕业设计打下了坚实的基础，也在日后的工作学习中有很大帮助。

另外，我还要感谢实验室各位学长学姐在实验过程中对我的指导，没有你们的帮助，我将无法顺利完成我的实验。

同时，感谢食品07-2的所有同学们，因为有了你们的陪伴，让我的大学生活更加的充实而精彩

最后，深深的感谢呵护我成长的父母，是他们在我的学习和生活当中一直给我支持和关怀，使我信心百倍的应付学习和生活中的困难。

在以后的学习和工作中，我将铭记我曾是一名大连海洋大学的学子，把大连海洋大学的优良传统发扬光大，不怕困难，勇往直前，为社会贡献出自己的力量。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 参考文献

参考文献

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 附录Ⅰ

附录Ⅰ 文献综述

植物内生菌应用研究进展

摘要:内生菌的研究工作已经在全球很多实验室深入开展起来，我国学者曾对国内外内生菌的研

究进展作了较详细的综述。本文仅对近年来该方面的研究进展进行简要综述 关键词:内生菌，生物学作用，应用，农业，医药.

引言: 早在100多年前, 人们就已发现在健康植物组织内部也有微生物的存在。但由于它们生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部, 其存在和作用长期以来一直为人们所忽视, 因而相对于其它学科,植物内生菌的相关研究发展十分缓慢。近年来, 随着研究领域的拓宽, 各学科知识的交融及研究方法的进步, 植物内生菌重要的生理、生态作用, 在农业和医药领域中的巨大应用潜力, 逐渐引起了植物学家、植物病理学家、微生物学家及生态学家的广泛关注和重视, 成为国内外研究的热点。

1.植物内生菌的发现过程和定义

植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到2O世纪30年代， 由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家DeBarry于1886年提出。1986年，Carrol将植物内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物。1991年，Petrini提出植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物。1992年，Kleopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌” 的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。目前, 对植物内生菌的定义仍然有不少争论, 但Hall mann 等人依据内生菌与植物的相互关系提出的概念是目前使用最广泛的, 他认为植物内生菌应满足两个条件：一是从表面消毒的植物组织或植物组织内部获得的；二是它们的存在不会造成植物出现可见的伤害或功能的改变

2. 植物内生菌的分布

内生菌是一个生态学概念，而非分类学单位。它泛指一切生活在植物体内的腐生、寄生和共生的真菌、细菌、放线菌等微生物，包括那些在其生活史中的某一阶段表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌 .植物内生菌包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。在一种植物上就可分离到数种至数十种内生菌

内生菌广泛分布于低等植物和高等植物中，常见的有假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(BaciUus)、微杆菌属(Microbacterium)以及土壤杆菌属(Agrobacterium)等。近年来，研究者已从番茄，辣椒，杜仲，石斛，长春花，云南红豆杉等多种植物中分离到了大量内生菌，内生菌

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[6]

[5]

[4]

[3]

[2]

[1]

大连海洋大学本科毕业论文（设计） 附录Ⅰ

广泛的分布在已研究过的各种植物中，植物体的根、茎、叶、花、果实、种子都可感染内生菌。研究表明植物内生菌种类的多样性与植物的生长环境有关系。一般来说，热带、亚热带地区的植物与生长在较干燥、寒冷环境条件下植物相比，其内生菌种类和数目多。

3. 内生菌的分离

由于内生菌存在于健康植物的内部且难以观察，不能在活体植株内直接进行研究，所以通常用组织学方法分离纯化内生菌后再做进一步的研究。处理内生菌的第一步就是从植物材料中分离，所以寻找合适的植物材料是至关重要的一步。通常植物独特的生物学特性、年龄、地域性、民族植物学历史及所处的环境等都会作为选择植物材料的参考因素。植物内生菌会因这些因素的不同而有所差异，如生长在热带或

亚热带的植物所伴随的内生菌相对于生长在于旱阴冷地区的植物所伴随的内生菌更具多样性 ；同一植物的不同部位(根、茎、花、叶)伴随的内生菌有所不同；同一植物的同一部位在不同的季节所伴随的内生菌也不相同。确定植物材料后，取所要研究的部分，用自来水将表面清洗干净，再分别用75 %乙醇、无菌水、0.1％汞、无菌水处理，晾干，然后去除外部组织，用无菌刀片将内部组织切成0.5 em×0.5 em 大小的薄片植入PDA 培养基中，培养几天之后，会观察到有菌丝长出，挑出菌丝于新的培养基上做进一步分离纯化，直到获得纯化的菌株。同时注意要以同条件处理下的未剥离外部组织的材料进行同步培养作为空白对照，以保证分离出的菌来自于植物内部而不是表面的附生菌。

4.植物内生菌在农业上的应用

研究表明植物内生菌与病原菌具有相同的生态位，在植物体内相互竞争空间、营养，使病原菌得不到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力。另外植物内生菌可以分泌抗生素、毒素等代谢物质，这些代谢物质能够诱导植物产生系统抗性(ISR)。因此，对植物施用植物内生菌产生的抗菌剂、抗虫剂，来增强植物的抗逆性，起到生物防治效果，既减少了化学农药对环境的污染，又保证了植物的产量品质。吴蔼民等间防效及增产作用。田宏先等用。Hinton等

[11]

[10]

[9]

[8]

[7]

。报道了内生菌73a和Ala对棉花黄萎病的田

报道了马铃薯组织内生菌对马铃薯茎基腐病的田间防治及增产作

通过试验证明，玉米内生阴沟杆菌作为种子保护剂，能有效防治玉米病害。夏正

俊等已从棉株分离并用抗菌素标记证明内生细菌对棉花枯萎病具有良好的防效。植物内生菌次生代谢物能够产生植物生长激素类物质或促进植物对养物质的吸收来刺激植物生长。如张集慧等从兰科药用植物中分离出5种内生真菌，并从这些真菌发酵液和菌丝体中分别提取出5种植物激素，如赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸等，它们对兰花的生长发育有较好的促进作用。植物内生菌的次生代谢产物也具有杀虫特性。

此外，内生菌可促进宿主植物的生长，感染内生菌的植物一般具有比未感染植株生长快速的特点，人工接种某些内生菌还能提高植物的存活率，促进发芽

[12]

。已有相关报道内生菌的这种促

植物生长作用可从两方面来理解：一方面，许多内生菌可产生生长素(IAA)、细胞激动素等植物

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 附录Ⅰ

生长激素，从黄花篙中分离到的1株内生真菌在发酵液中也能积累IAA；另一方面，内生菌可增进宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收，禾本科农作物如水稻、甘蔗、玉米上的内生细菌具有很强的固氮能力。感染内生真菌的牧草对氮、磷的摄取能力也有所提高。1991年Mcinroy等从玉米、棉花上分离到具有促进植物生长作用的内生细菌

5. 在医药卫生上的应用

研究表明植物内生菌代谢产物有抗肿瘤、抗菌，抗病毒等作用。Castillo等发现K．nigriscans的一株内生链霉菌能够产生一类活性多肽Munumbicins，这类多肽不仅具有广谱的抗菌活性，而且对有耐药性的病原菌、寄生虫有很好的抑制作用。利用植物内生菌的次生代谢物质开发新的药物将是今后医药方面的研究方向之一

[14]

[13]

.

。

，是目前从植物中发现的最重要的抗癌药物之一，对卵

产抗肿瘤物质 紫杉醇(taxol)是由Wani等分离自短叶红豆杉的一种二萜类生物碱，具有独特的抑制微管解聚和稳定微管的作用

[15]

巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌等均有疗效。至今已从南方红豆杉、中国红豆杉、东北红豆衫、云南红豆杉等多种红豆杉属植物中分离到能够合成紫杉醇类化合物的内生菌。长春花、桃儿七和美登木是三种药用植物，分别含抗肿瘤药用成分长春碱、鬼臼毒素和美登素。长春碱是一种广谱、高效的抗肿瘤药物，可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌及其他癌症，其硫酸盐已经广泛应用于临床，是目前应用最广的天然植物抗肿瘤药物之一

[16]

鬼臼毒素是存在于鬼臼类植物中的一类天然的木脂素，也有显著的抗肿瘤活性，它能

够抑制微管蛋白的解聚作用和阻断中期相细胞分裂，并具有抑制DNA拓扑异构酶活性，是合成多种抗癌药物的前体，其糖苷衍生物etoposide和teniposide毒性较低，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效 6.展望

我国植物内生菌资源丰富，其种的数量庞大，利用其筛选抗菌的菌株，从微生物中寻找发现新型先导化合物，对促进新型生物农药的开发和创制具有十分重要的意义。最新研究表明植物内生菌在病害生物防治、固氮增收方面有潜在的应用和开发价值。总之，植物内生菌会在农业，医药甚至更多应用领域发挥重要作用。

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大连海洋大学本科毕业论文（设计） 附录Ⅱ

附录Ⅱ 外文翻译

从亚马逊雨林上游分离出的内生菌的多种新型生物活性

摘要: 微生物的生物多样性为医学和工业上有用的化合物提供了一个越来越重要的来源, 我们已经从秘鲁亚马逊热带雨林上游中将近300株植物的茎样本中分离出14个放线菌种. 所有人工培养的植株经分离产生的抑制活性的物质被应用于一系列潜在的病原真菌和细菌。对一些生物来说, 这个活性在频谱上非常的宽阔, 而其他的则对有限数目的生物显示出特定的活性。这些生物体中的两个与真核的生物相比优先抑制了细菌试验的生物。 rDNA序列的分析表明这些生物跟任何人工培养的存放在基因库里的生物都不一样。我们的结论为在生物学活性的形式上，微生物呈现在更高级生物组织内部尚未开发的生物多样性提供依据。

介绍：事实上所有的植物都拥有一个微生物群。许多微生物克隆植物的表面特征并且像附生植物一样存活。另一组微生物的克隆者是内生植物，他们占据植物内部组织的空间，并且按定义来说，他们对所栖息的组织没有明显的伤害[4,28,32].在这些生物中最简单的生物学安排就是植物为微生物提供营养，微生物为植物提供某种形式的保护[4,15,32]。在最近的十年里，人们已经非常清楚在植物的组织中存在大量的微生物多样性[2, 13, 15, 18, 24, 27]. 对植物而言，尽管有一些迹象是确定的，即它可以授予植物对热的忍耐力[23,25]、对盐分的忍耐力[25]，以及保护植物不受到真菌病原体的侵害，但是内生植物的生态学角色仍然是不能确定的[3]。

大量的做为内生植物分离的微生物是真菌[4].只有在最近,生物学上有活性的内生植物放射菌类被分离和定性了,(例如: [6–12, 14, 16, 26, 29, 31, 33, 34]), 作为一个组群,放射菌类为全世界提供了将近80%的抗生素[4], 可是在任何情况下,从土地中分离出的有机物是源头. 随着细菌病原体抗药性的到来和真菌感染的增加，引发了人们从链霉菌寻找其他保留着的有生物学活性的化合物，使他们复苏，[5, 21].一个生物学上重要的生态位就如同一个新型链霉菌的起源，被忽视了的，是在世界上各种生态系统中内生植物都可以存在。对于新型抗生素来说，这似乎是一个合理的来源，由于给定了内生植物的链霉菌与真核生物有关联，并且有很小的可能性会对真核寄主产生有毒的化合物。因此，在药品的发现方面，其中一个主要焦虑的问题，并且与药品候选物的毒性有关系的，或许可能通过处理内生植物的链霉菌和他们的生物活性产品而减少。

很多最近所描述的内生植物链霉菌拥有唯一的16S rDNA 序列，这使得全部新型有生物学活性的产品拥有唯一的菌丝结构，并且具有有趣的新型的文化特色[8–11, 14, 34]. 新型的分类可能会突出新型的化学，他为在农业，医疗和工业方面找到新的具有生物学活性的化合物提供了视角[28]。

为了寻找新的内生放线菌,我们在亚马逊-----世界上最大的,具有最多生物学多样性的陆地生态系统,做了一个搜集的探险, 在这些重要的生态系统中,只有一个内生放线菌被报道了[11, 14]. 有人怀疑, 这种生物体必须有庞大的规模和和巨大数量的植物种类做支撑才能存在. 在这个报告中描绘了从上部秘鲁亚马逊热带雨林中分离的一些新型放线菌. 对它们生物学活性的分类和描述方面也做了陈述. 这个工作额外的特色是实验的取样、加工和发现这些有机物都是由未

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毕业的学生完成的，他们对与发现的过程有关的事有着经验和热情。 方法：

种植样品

首先以种族历史为基础种植大约300株样品。样品在两个地点种植，分别为秘鲁亚马逊盆地接近湖( 12°36.377′S~ 12°36.344′S 经度, 69°01.818′W ~69°01.950′W 纬度 ) 和秘鲁的东南方和玻利维亚的交界处(12°39.716′S ~ 12°40.760′S经度 68°42.722′W ~ 68°40.977′W纬度). 直到它们被加工处理之前, 新鲜植物被修剪下来的茎叶都被收集在塑料袋里并且保持低温, 作为证据的样本都做了备份,其中一套放置在秘鲁库斯科圣安东尼阿巴德国立大学植物标本室,另一套放置在美国纽黑文耶鲁大学植物标本室. 植株材料是由Percy Nú?ez Vargas鉴定的.

放线菌的分离

茎样品先用70%酒精的漂洗, 然后经过简短的灼烧以除去表面的微生物. 使用无菌技术, 除去外部的组织, 内部的组织涂布在含有甘油-精氨酸琼脂的平板上[19]. 所有的平板放在塑料的存储箱内，在室温下培养，然后每隔几天检查微生物的生长. 由于在六周的时间内微生物变的明显了，它们被小心的转移到含有十分之一推荐浓度的马铃薯葡萄糖琼脂(1:10 PDA)或者含有十分之一推荐浓度的营养琼脂(1:10 NA)的平板上. 在被稀释浓度的溶液里使用媒介物质用来防止最具有活力的有机体强劲生长. 由于细菌和真菌的分离是理想化的, 媒介物中没有添加抗菌性的化合物. 所有样品都是在室温下生长的. 把所有以放线菌形式出现并拥有壤香的有机物都称为潜在的放线菌候选者. 这些生物在-80℃温度下存放在15%的甘油溶液中. 宿存的根枝是由经过三重高压灭菌的大麦种子定居因子做成的，这些生物在-70℃温度下存放在蒙大拿州立大学的生物收藏室里，并且为他们每个都做了编号。

染色体DNA的分离和rDNA的分析

四毫升的样本在室温(22°C)下以200转/分的速度在营养液体培养基或者马铃薯葡萄糖液体培养基中旋转大概两天的时间，直到观察到显著的生长。使用QiagenDNeasy Plant Mini Kit 提取DNA。将近10ng的染色体DNA被用做模板来扩增一个区域的16S核糖体DNA。扩增是通过使用最原始的变性作用步骤：在95°C时5min，然后做30次循环即95°C1min, 55°C1min, 72°C1.5min .做过30次循环后再做一个72°C5min的扩展。100微升反应的混合物包含将近10ng染色体DNA；1× GoTaq? 弹性缓冲（Promega, Madison, WI, USA）；200 μmol/L（每个）dATP, dCTP, dGTP, dTTP；2.5 mM MgCl2; 2.5U GoTaq? Flexi DNAPolymerase (Promega); 每个引物中放1.5 μM。在任何情况下，除了P801A，引物都是63F (5′-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3′)和1387R (5′-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3′) [22].P801A使用的引物是907R (5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′) 和 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′) [20].增殖的产品使用QIA快速聚合酶链式反应进行提纯(Qiagen)，DNA序列分析是使用应用生物系统公司的3730毛细管仪器。rDNA序列递交给了基因库并且就职号码已经被指定。序列在2008年6月4号被提交给BLASTN分析生物技术信息数据

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库国际中心。最近的物种联系与百分比序列特性一起被记录起来。DNA序列使用分子进化遗传分析（3.3.14.版本）软件对齐并与其他的进行比较。

形态学特征

在营养素或者马铃薯葡萄糖琼脂中生长的分离物的最原始特征是使用V8的体视立体声显微镜测试出来的，菌落形态在生长后的6天，两周，三周后分别进行记录。有些样品确认通过16S rDNA序列分析和初步的形态学观察后被转移到含γ-辐照香石竹叶片的琼脂中来促进孢子结构的生长，这些通过电子显微镜扫描分析的。单个的琼脂塞中包含微生物植入的康乃馨叶子被固定在2％戊二醛，0.1M缓冲卡可酸钠(pH 7.2–7.4)和Triton-X 100中，吸气5分钟并固定一晚，样品像上述的进行处理[9]. 样品在临界点干燥金溅射涂层，图像使用JEOL6100电子显微镜扫描记录下来。

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生物测定

每个放线菌菌株在室温下，1:10PDA或NA中培养14天。被测试的有机体是：水稻纹枯病菌，茄病镰刀菌，白地霉，菌核病，Cerospora藻，肉桂疫，炭疽病，黄萎病，绿色木霉和由G.A.S提供的腐霉ultimum，白色念珠菌和从美国菌种保藏中心获得的表皮葡萄球菌，从耶鲁大学遗传库存中心获得的大肠杆菌，由塔夫茨大学医药学院Dr. A.L. Sonenshein提供的枯草芽孢杆菌。

至于真菌生长抑制实验（除了白色念珠菌），菌株在平板上以“交叉”模式把平板分为四份。14天之后，包含真菌测试有机体的刚刚生长样品的3×3×3-mm琼脂塞子被镀在了中央部分的象限。为了确保连贯性，制作了一个文件的样板用来为真菌测试有机体提供统一的位置并为细菌交叉提供位置。

为了测试白色念珠菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌的生长抑制，放线菌被放置在平板中心下的一条线上。14天之后，每个测试的生物体都垂直于内生菌的生长，从内生菌的附近开始延伸到平板的边缘。文件模板帮助在所有平板上获得微生物一贯的位置。所有测试都做三次。

被测试生物的生长分别在24,48,72小时后做出评估。对真菌来说，被测试生物体菌丝的生长是以毫米为测量单位的，并且与被测试有机物生长相比，缺乏内生菌菌株。在表2里显示出的价值是三次试验的平均值。酵母白色念珠菌和被测试的生物细菌在24,48,72小时后测得的生长状况分别为没有生长，生长和部分生长。

结果:

从亚马逊热带雨林中分离的内生放线菌

总共将近300株的无病植株被采集并且接受表面处理来消除表面上相关的微生物。从内部植物茎中分离提取出内生菌。培养基的放线菌生长形态指标被选作进一步的研究。所有的都呈现丝状生长和产生泥土的气味。与其他rDNA序列分析相结合的形态学观察证实至少这些菌株中的14株是放线菌。其中，一个是小单孢菌，一个是拟无枝酸菌属，其余12株属于链霉菌属。就放线菌的分离来看，只有两个菌株具有相同的rRNA基因序列（P506A和P513A）。其他所有的在呈现rRNA序列，形态和生长抑制模式上都存在差异。此外， 核糖体的16S部分序列没有表现出与GenBank在2008年6月4日（表1）中现有的任何生物体100%的同源性。有来自12个不同植物物种代表10种植物科的14株放线菌，这表明内生放线菌在整个植物系统中有可能是广泛发育的。

源植物和放线菌的识别特征如表1中所示。表1中所示的形态是指当生物体在PDA上生长2周除了一个例外；清液的P1403H菌落当其在营养琼脂上生长时对其表面进行了观察。大多数的微生物显示比PDA更强劲的增长在NA方面，除了P1303B和P1801B之外。所有这些观察显示，除了P503A，都生产长度约1μM的酒桶形孢子。P503A的孢子没有其他所有结构的孢子（表2）钝和圆。

合并后的形态和rDNA序列表明，所有14个生物是独一无二的。虽然P506A和P513A已超过1200个核苷酸序列相同的具有相同的rDNA序列，这两个生物有不同的生长形态和不同的生长抑制情况。随着PDA的生长，P506A产生狭窄肉眼可见的垂直投影的呈黄色到咖啡色的菌落。当1 × PDA

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的增长，P513A，像P506A，产生褐色菌落，但不像P506A，它分泌到培养基中的代谢产物。P513A菌落是圆形的，似乎还在中心开始出现衰退，导致在P506A中用肉眼可见的褶皱的出现在没有垂直投影的情况下。菌落出现潮湿，不是所有都是很白的并且在P506A菌落得四周没有晕圈。

两个其他生物的共同点是P1400C P1400D。虽然培养基是从相同的植物中分离出来的并且表现出类似的增长抑制数据，生长形态和rDNA序列数据有所不同。在PDA和NA，P1400C培养基上出现，产生比P1400D更深的菌丝体，并且随着P1400D的生长分泌出一种不被观察到的橙黄色代谢物。P1400D菌落的背面是红棕色的相对于P1400C的灰色而言。虽然P1400C 和 P1400D在GenBank中分享hygroscopicus方面有最接近的关系，但超出约1200个核苷酸序列，在16个地方有差异。

系统发育分析

标准方法被用于创建一个系统演化树。16S rDNA序列被安置在Megalign中，从DNAStar在默认设置镇南关比较了我们相互有关联的有机体，对于在基因库中最近提起的关系，以及其他已知的链霉菌（图1）没有符合我们已知的生物物种。有趣的是，四个内生菌（P1801B，P1303B，P513A和P506A）在16S rDNA序列中表现出比在 GenBank中任何其他命名的关系都有较高的一致性。正如所料，P801A和P1318F，两个非链霉菌，属于不同的分支。

所有的病原菌产生生长抑制物质

新型生物体代谢途径可能导致产生新的此生代谢产物。以事实为依据，这些来自亚马逊放线菌出现不同于先前所描述的生物体，他可能的情况是，他们生产的新的天然产品包括但不限于抗菌化合物，虽然需要进一步的结构研究是必要的以此来确定是否是这个情况我们的测试，包括子囊菌门和担子菌的植物病菌源真菌。人类致病真菌的机会（白色念珠菌），两种植物病原卵菌纲，革兰氏阳性和代表性和革兰氏阴性菌。

抑制综述

所有的内生真菌测试表现出强大的抗菌活性（≥90％的增长抑制）来对抗六种生物检验生物的最低值。在抑制机体的特异性和目标活性方面伴随每一个内生菌方面上有较大的差异。此外，生长介质的选择影响了一些内生真菌生长的抑制活性谱（表2，图3。）。例如，P1519C在1:10 的PDA平板上生长时显示100％的白地抑制，但在NA上只有22％的抑制。相反，在1:10 PDA上，同样的生物体表现出100％的Cerospora和黄萎病的抑制作用上，在NA平板上生长时没有表现出对这些相同的有机体的显着抑制作用。生物体P503A，P801A，P911A，P1400D，1403H，和P1801B显示出最大的生物体测试小组的广泛的活动范围。P506A抑制真菌生物测试的最低数目。但是，它是仅有的三个内生菌抑制所有三种细菌生物试验之一，并提出了抑制原核生物的优先选择。

真菌的抑制作用

每个内生真菌能赋予至少三个真菌或卵菌试验生物强劲增长的抑制作用。我们量化的抑制活性测试对测试的有机体真菌菌丝表现出的增长（表2）在我们的生物测定中使用媒体，白念珠菌二相性真菌的生长是作为一种单细胞的酵母，而不是作为菌丝形态表现出的其他测试真菌的典

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