质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻 T-DNA旁邻序列的效率比较

质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻 T-DNA旁邻序列的效率比较

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2004,12渊1冤院13~18

·研究论文·

质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻T-DNA旁邻序列的效率比较

张帆金维正陈双燕

吴运荣刘非燕吴平*

（浙江大学生命科学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室，杭州310029）

摘要：获得突变体中T-DNA的旁邻序列是通过反向遗传学进行功能基因研究的重要手段。实验比较了用质粒营救法和TAIL-PCR法获得T-DNA在水稻(

基因组中旁邻序列的效率。利用质粒营救法获得T-DNA在水稻中的旁邻序列

效率可高达90%左右，而利用TAIL-PCR法的效率只有62%。质粒营救法和TAIL-PCR法获得的旁邻序列中水稻基因组DNA水稻基因组DNA的效率是的效率分别是80%左右和89%左右。根据实验结果，质粒营救法从转基因植株获得的旁邻序列，72%，比TAIL-PCR法高18%。

关键词：水稻；T-DNA；质粒营救法；TAIL-PCR

ComparisonoftheEfficiencyBetweenPlasmidRescueandTAIL-PCRMethods

forObtainingFlankingSequenceofT-DNATagInsertioninRiceGenome

ZHANGFan

JINWei-ZhengCHENShuang-YanWUYun-RongLIUFei-YanWUPing*

(StateKeyLaboratoryofPlantPhysiologyandBiochemistry,CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,

China)

ToobtainflankingsequenceofT-DNAtaginsertioningenomeisastrategyforinvestigatingfunctionalgenomicsby

usingreversegenetics.

Inthisstudytheplasmidrescueandtail-PCRmethodswerecomparedfortheirefficiencytoobtainthe

)genome.TheresultsfromT-DNAinsertionlinesshowedthatthe

flankingsequencesT-DNAtaginsertioninrice(

efficiencyofplasmidrescuewasabout90%,andthatofTAIL-PCRwas62%.About80%offlankingsequenceofT-DNAtaginsertioninricegenomebyplasmidrescuewasricegenome,whileabout89%byTAIL-PCR.ThereforetheefficiencyofobtainingflankingsequenceofT-DNAtaginsertionfromtransgenicplantsbyplasmidrescuewasabout72%,whichwas18%higherthanthatby

TAIL-PCR.

T-DNA;plasmidrescue;TAIL-PCR

基因插入失活被认为是目前研究基因功能最直接的方法，因此建立大规模的模式植物插入突变体库是植物功能基因组研究的基础工作。目前建立突变体库的方法有T-DNA直接插入法[1]、玉米Ac/Ds转座子系统插入法[2]、反转座子标签法[3]和增强子标签法等[4]。Jong-Seong等[5]预计水稻约需471000个T-DNA独立插入株才有可能找到99%的基因，但实际所需的数目要小的多。从最近拟南芥的FSTs（flankingsequenceofT-DNAtags，T-DNA旁邻序列）研究发现T-DNA插入子在染色体上的分布和染色体上的基因区分布极度相似[5~7]，推测T-DNA

张帆:1978年生,硕士研究生。*通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail:收稿日期：2003-02-27接受日期：2003-03-19

在拟南芥基因组中并非随机插入，而是发生在基因

（约100Mb）富集区。因为水稻基因区只占水稻基

因组的25%，相当于拟南芥基因组的大小，所以水稻实际需要的T-DNA插入饱和库大小和拟南芥差不多[6]。

FSTs的高效获得是通过反向遗传学方法研究功能基因组的重要方法。现在获得FST一般都采用PCR系统,如thermalasymmetricinterlaced(TAIL)PCR和质粒营救系统。TAIL-PCR由Liu等[13]首创并逐步完善。Sessions等[7]用改进的TAIL-PCR法获得了拟南芥大量的FSTs。Perucho等[8]在1980年用

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14农业生物技术学报2004年

质粒营救法克隆到鸡胸苷激酶基因。Kiessling等[9]改进了该系统。质粒营救法作为一种克隆基因的方法被广泛用于果蝇、真菌、哺乳动物和拟南芥中，特别是常被用于从突变体中克隆基因。Nakazawa等[10]从拟南芥的矮化突变株中营救到一个和芽伸长和侧

Migeon等[11]从果蝇幼虫中根发生相关基因

营救到生长相关的Mathur等[12]也高效营救到拟南芥的FSTs。

本实验采用质粒营救方法和TAIL-PCR分别分析了150株转基因水稻植株的FSTs，比较两种方法的效率。

上，26益分化培养（14h/10h）至有绿芽冒出。绿芽长到2~3cm移至1/2NB培养基上生根培养10~15d，苗长至瓶口移栽至温室培养。

图1.双元植物表达载体pBsBar结构图Fig.1.DiagramofthebinaryplasmidpBsBar

notdrawntoscale

LB，T-DNA左边界；RB，T-DNA右边界；HPT，潮霉素磷酸转移酶表达盒；BAR，BASTA抗性基因表达盒；pBsSk，pBluescriptⅡSK(+)载体；B酶切位点Ⅰ酶切位点；HⅢ酶切位点；XⅠ

1材料和方法

1.1菌种和双元载体的构建

)根癌农杆菌(

（转基因，根癌农杆EHA105用于水稻

菌（）DH5琢是营救质粒的转化宿主。双元植物表达载体pBsBar（15.6kb）是在pCAMBIA1300(8.9kb)基础上改造的(图1)。pCAMBIA1300提供抗性愈伤组织筛选基因和阳性克隆筛选基因基因。用和HⅠ将pBluescriptⅡSK(+)插入pCAMBIA1300的多克隆位点中。除去pCAMBIA1300上的Ⅲ位点。pBluescriptⅡSK(+)提供营救质粒筛选基因、营救质粒在

中的和测序引物M13（-）引物。将BAR基因表达盒插入pBluescriptⅡSK(+)的位点。BAR基因表达盒提供BASTA抗性基因用于转基因植株筛选。用电击法（使用BioRad基因融合仪，电压2.5kV，电阻200赘）将载体pBsBar转入EHA105电击感受态细胞中，28益在Sp+和Kan+的YEP双抗培养基上生长36h，阳性克隆用于转化水稻愈伤组织。

1.2获得水稻转基因植株

实验以粳稻()的2个品种中花-11和Nipponbare的幼胚愈伤组织为外植体和含pBsBar的EHA105菌液共培养3d后，愈伤组织移至含2.5mg/L2,4-D、500mg/Lcefotaxime和40mg/Lhygromycin的NB（N6大量元素+B5微量元素+B5有机，pH5.8）培养基上，26益暗培养10~14d。抗性愈伤组织移至含500mg/Lcefotaxime和50mg/Lhygromycin新鲜NB培养基上继续培养10~14d，抗性愈伤组织移至含3mg/L6-BA,0.5mg/LNAA和250mg/Lcefotaxime的NB培养基

氨苄青霉素抗性基因；M13(+)和M13(原)，

pBluescriptIISK(+)载体上M13正、反向引物位点。LB,leftborderofT-DNA;RB,rightborderofT-DNA;HPT,hygromycinphosphotransferaseexpressioncassette;BAR,BASTA-resistranceexpressioncassette;pBsSk,pBluescriptⅡSK(+)vector;B,digestionsite;

HⅠdigestionsite;H,

Ⅲdigestionsite;X,

Ⅰ

Ampilicin-resistrancegene;M13(+)andM13(原),

M13directsequenceprimerandM13reversesequenceprimer.

1.3BASTA筛选抗性转基因植株

BASTA溶液（含PPT8mg/L）涂抹转化植株的叶片中部，4~5d后观察涂抹处的叶片颜色变化。1.4利用质粒营救法获得FSTs

提取150株BASTA抗性植株的基因组DNA，方法见文献[14]。取5滋g基因组DNA，在50滋L酶切体系中用20U限制性内切酶37益反应9h以上。用Ⅲ（TaKaRa公司）酶切获得T-DNA右边界的FSTs。取5滋L酶切产物，0.8%的琼脂糖凝胶检测酶切是否完全，剩余的酶切产物用氯仿/异戊醇纯化，1/10体积的3mol/LNaAc和2体积无水乙醇沉淀。为提高营救效率，所有的酶切产物都被用于自连反应。200滋L连接反应体系中用450UT4连接酶（TaKaRa公司）15益反应8h。连接产物用1/10

沥体积3mol/LNaAc和2体积的无水乙醇沉淀，

干，用3滋LddH2O溶解沉淀。用电击法（电压2.5kV，电阻200赘）将其转化到DH5琢电击感受态细胞中[15]。在Amp+（50mg/L）LB固体培养基上筛选抗性克隆，37益培养16h。为检测克隆是否假阳性，挑取单克隆在Amp+（50mg/L）LB液体培

（5忆

-GTA养基中振荡培养5~6h，用M13（+）引物

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第1期张帆等:质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻T-DNA旁邻序列的效率比较

表1根据T-DNA边界内侧序列设计的嵌套式特异引物

15

AAACGACGGCCA-3忆）和M13（-）引物(5忆-AAACAGCTATGACCA-3忆)进行菌液PCR，程序如下：94益5min，94益30s，56益30s，72益1min，72益5min。抽取阳性克隆的

以M13（原）质粒，引物为测序引物，用MEGBACE1000测序。

1.5利用TAIL-PCR方法获得FSTs

本实验同时用TAIL-PCR法从上述150株转基因植株中获得FSTs。根据pCAMBIA1300的T-DNA边界内侧序列设计嵌套式特异引物，左边界引物分别为3TR1、3TR2和3TR3，右边界引物分别为5TR1、5TR2和5TR3（表1），简并引物为AD1、AD2和AD3[13]。引物由TaKaRa公司合成。PCR程序参照Liu等[13]。第三轮PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶检测，割胶回

测序引收（使用QIAGENKit回收）。

物是第三轮PCR引物3TR3或5TR3。

1.6数据分析

为确定T-DNA在水稻染色体上的插入位点，获得的水稻FSTs和NCBI的水稻基因组数据库（http:）进行BLASTN同源性比较。用DNASTRA的MegAlin软件分析获得的FSTs中的T-DNA边界序列。

Table1T-DNAborader-basednestedprimersforTAIL-PCRanalysis

边界右边界

引物5TR215TR3

pCAMBIA1300位点170/191186/208215/2376896/68726671/66496673/6651

引物序列（5忆~3忆）gcaccgatcgcccttcccaacaccaacagttgcgcagcctgaatggctagagcagcttgagcttggattcgtccgagggcaaagaaatagataaaatccagatcccccgaattaccgcaatgtgttattaagttgtc

Rightborder5TR2左边界Leftborder

3TR13TR23TR3

表2利用质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻中FST效率比较Table2ComparisonofefficiencytoobtainflankingFSTbetweenplasmidrescue

andTAIL-PCRmethods

序列类型PatternofFSTs转基因株系数

No.oftransgenicplantsFSTs水稻序列数Ricesequence总效率

FinalefficiencyT-DNA载体Vector

质粒营救法Plasmidrescue插入子数目

150136109

90.780.172.7

207

14.75.1

10

效率/%1）

TAIL-PCR

1509383

62.089.255.310.81）

NumberofinsertsEfficiencyNumberofinsertsEfficiency

1）

总效率=水稻序列数/转基因植株数。

Finalefficiency=Numberofobtainedricesequence/Numberoftestedtransgenicplants.

1）

2结果

2.1转基因植株获得

共得到1022株独立转化植株，所有成活的植株用BASTA溶液筛选。2个品种的转化植株对筛选剂表现出了不同的抗性，93%左右中花-11转化植株表现抗BASTA的性状，而Nipponbare只有84%左右。但是用潮霉素筛选抗性愈伤组织时，Nipponbare获得抗性愈伤组织比率是80%左右，中花-11只有65%左右。这表明不同的品种对不同的筛选剂的敏感性各有不同。

2.2用质粒营救法和TAIL-PCR获得水稻FSTs的效率比较

载体pBsBar有2个酶切位点，位于

（图1）用BAR基因表达盒两边，酶切可以

获得完整的pBluescriptⅡSK(+)载体和T-DNA的右边界，所以选用来营救T-DNA右边界的FSTs。用质粒营救法从150株转基因植株中获得

用TAIL-PCR法共得到136个FSTs，效率是90.7%。

93个FSTs，效率是62%。因此质粒营救法与TAIL-PCR法从转基因植株中获得FST为水稻基因组DNA的效率分别是72.5%与55.3%（表2）。2.3T-DNA边界分析

T-DNA左右边界序列在T-DNA转移中起着重

除去7个载体序列，要的作用。分析营救获得的129

个FSTs的T-DNA边界序列，可以分为5种类型。

淤有正常的T-DNA边界。当T-DNA右边界插

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16农业生物技术学报2004

年

入水稻基因组时多在TGA裂开，大部分FSTs有完整的TGA序列。CB406、CB584等的FSTs中T-DNA序列在TG（缺少A）后隔一至两、三个碱基还有部分边界序列。虽然有些FSTs的边界序列有若干碱基的缺失（缺失30

，但仍然保持明确边界序列，属个以内碱基）

于典型的T-DNA整合方式（图2）。②右边界缺失碱基大于72个。NB284和NB324-2的FSTs中T-DNA右边界从209~280nt的序列发生缺失，随后是水稻基因组DNA，定位在第4条染色体上。这类序列有7个。③有双元载体的主干序列。载体主干序列是指双元载体的细菌复制子区域，一般认为这部分载体序列不会转移到植物细胞中。CB368、NB246、NB374的FSTs中和边界序列紧接着是一段水稻基因

图2.T-DNA/水稻DNA的交界序列

Fig.2.SequencesofT-DNA/ricegenomeDNAjunction

T-DNA整合时保留右边界，但有部分右边界碱基缺失。第一行的右栏是pBsBar中的T-DNA右边界序列，第一个大写字母对应pCAMBIA1300的第280nt。其余行的左栏是转基因植株编号，右栏是以从该植株中获得的FSTs，小写字母表示T-DNA序列，大写字母表示T-DNA/水稻DNA交接

处，黑色粗线表示水稻基因组DNA。

TherightborderisretainedbyeachT-DNAmoleculeduringtheintegrationprocess,

withmissingsomebias.

ThefirstlineistheT-DNArightborder

sequenceofbinaryvectorpBsBar,andthefirstcapitallettercorrespondedthe组DNA，分别定位在第10、11和12条染色体

280ntofbinaryvectorpCAMBIA1300.TherightotherlinesareFSTsfromthe上。水稻基因组DNA后是载体主干序列。这类

T-DNAinsertionlinesshowedintheleft.SmalllettersaretheT-DNA序列有12个。④右边界倒置。在14个FSTs

中，T-DNA右边界的242~282nt发生倒置。sequences,andcapitallettersarethejunctionsequencesofT-DNA/ricegenome

DNAjunction,thericegenomeDNAshowedbythefollowedblackthicklines.CB395、CB524和CB544的FSTs中先是水稻

基因组DNA，分别定位在第7、2、6条染色体

（图2）列的完整性。T-DNA右边界整合到水稻染色体时一上，紧随着是倒置的边界序列。⑤无边

般是在TGA断裂，对应pCAMBIA1300280nt。大部界序列。20个FSTs无边界序列，是水稻基因组

分FSTs留有T-DNA边界，会有部分碱基发生缺DNA，分别定位在第1、2、3和6和12号染色体上。

失，一般碱基缺失少于30个。第三轮TAIL-PCR引

3讨论

物位于TGA内第66~44nt，所以大部分植株可用

质粒营救法的效率主要取决于基因组DNA转TAIL-PCR法获得FSTs。当边界序列碱基缺失的位化到宿主细胞的效率。1滋g水稻基因组中约含有2置大于66nt时会影响TAIL-PCR效率，甚至失败。伊106个DNA取部分TAIL-PCR第二轮产物测序，发现有7个序酶切水稻基因组DNA最多可

列中边界序列在210nt开始发生缺失，造成第三轮获得4000bp的片段，1滋g被完全酶切的水稻基

PCR反应的非特异性扩增。这些植株可用质粒营救因组中含有2伊1014个自连质粒。所以理论上从1滋g

结果方法获得FSTs。检测营救得到的水稻基因组中营救到1个营救质粒所需的转化效克隆，

率是1伊108。本实验使用新鲜的电击感受态显示100%的克隆可以得到>200遭责条带（图猿）。

使转化效率提高细胞并提高了感受态细胞的浓度，有些营救获得的FSTs中的边界碱基缺失大于72

到5伊109，每个转化有60个左右的营救质粒。个，有的甚至没有边界序列。由于测序引物M13Behringer等[16]认为营救效率和营救质粒大小成反（原）位于T-DNA右边界内部，所以得到序列肯定比。为了减小营救质粒片段，酶切位点选择位于是FSTs。造成这种现象可能一是由于边界序列很T-DNA内部，只获得T-DNA一边界的FSTs。最近短，二是由于测序时最前部分序列会测不出。有14拟南芥的85和108个FSTs都邻近T-DNA的左边个FSTs发现有边界序列倒置的现象，可能是串联界[7]。由于T-DNA的右边界在T-DNA转化过程中的另一个T-DNA的边界序列。T-DNA边界缺失现起重要的作用，它在整合时是相对保守的，所以我象在拟南芥等双子叶植物中亦有存在[17]。部分营救们营救T-DNA右边界的FSTs。本实验中营救效率的FSTs中还整合了T-DNA外部的载体序列。方进是90%左右，比TAIL-PCR法效率高29%左右。等[18]获得水稻FSTs中也有类似的情况。有人认为这

影响TAIL-PCR效率关键在于T-DNA边界序是由于在双元转化系统中，VirD2蛋白少于T-DNA

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第1期张帆等:质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻T-DNA旁邻序列的效率比较

图3.菌液PCR检测阳性营救质粒(A)和1.0%

琼脂糖凝胶检测TAIL-PCR产物(B)

17

Fig.3.AgarosegelanalysisofPCRproductsfromAmp-resistantrescueplasmidsbyM13primers(A)and1.0%agarosegelanalysis

ofTAIL-PCRproductsfromT-DNAinsertionlines(B)

M，DL2000marker；1~11克隆。所有克隆都扩增得到>200bp的条

带。S，第二轮PCR产物；T，第三轮PCR产物。编号相同的PCR产物的模板是同一个植株。特异性扩增是指第三轮PCR产物片段要比第二轮PCR产物相对应的片段小；当第三轮PCR产物片段和第二轮PCR产物大小相

等或是条带模糊的视为非特异性扩增。M,DL2000marker;1~11,Amp-resistantclone.AllPCRproductsfromthemwerelargerthan200bp.S,theproductsofthesecondaryreaction;T,theproductsofthetertiaryreaction.Theproductsfromthesametemplateshadthesamenumbers.ThetertiaryTAIL-PCRbandsweresmallerthanthesecondaryreactions,indicatingthesebandswerespecificproducts.ThetertiaryTAIL-PCRbandswerethesameasthesecondaryreactionsorweak,indicatingthesebandswerenon-specific

products.

拷贝的边界数时，造成双元载体的拷贝数高于辅助

质粒的情况，使得T-DNA和宿主染色体整合时跳过了边界，T-DNA区和非T-DNA区组成了新的T-DNA区发生转化[19]。T-DNA在整合时边界序列发生缺失或异常都可能导致TAIL-PCR的失败。由于质粒营救法的测序引物M13(原)位于TGA内第280nt，所以T-DNA边界序列完整与否不会影响营救效率。

营救获得的FSTs中有7个是载体序列。因为质粒营救法中采用基因组DNA酶切法，所以当T-DNA插入水稻基因组的位点附近有相应的酶切位点时，易造成得到的FSTs是载体序列。Mathur等[12]

营救到的拟南芥FSTs中有10%是载体序列。质粒营救法和TAIL-PCR获得的FSTs中分别有14.7%和10.8%是T-DNA序列。Mathur等[12]从拟南芥中营救到的FSTs中有40%T-DNA序列。因为T-DNA序列中含有明确的应酶切位点，易被酶切得到营救质粒，所以营救获得的FSTs中是T-DNA序列比率要略高于TAIL-PCR。上述两种情况造成营救获得的FSTs中是水稻基因组DNA的效率比TAIL-PCR法低9%左右。根据本实验结果从转基因植株中营救获得的FSTs是水稻基因组DNA的效率要比TAIL-PCR高18%左右，进一步的结论需大规模实验验证。

质粒营救法包括酶切、连接和转化反应，这些需手工完成。TAIL-PCR法在样品配置后可由仪器自动完成程序，减少了手工操作时间，这是目前许多实验室选择用TAIL-PCR的原因之一。质粒营救法中有两步用到酶，其耗费要高于TAIL-PCR，这是原因之二。因此需大规模获得FSTs时，选用TAIL-PCR

比较方便实用。但是对于量少的时候，可选用质粒营

救法以提高获得FSTs的效率。

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