【CN110079620A】使用高分辨率熔解曲线法同时鉴别三种诺卡氏菌的

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910356416.X

(22)申请日 2019.04.27

(71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防

控制所

地址 102206 北京市昌平区昌百路155号

(72)发明人 李振军　徐帅　侯雪新　

(74)专利代理机构 北京市众天律师事务所

11478

代理人 李新军

(51)Int.Cl.

C12Q 1/689(2018.01)

C12Q 1/6851(2018.01)

C12Q 1/04(2006.01)

C12N 15/11(2006.01)

(54)发明名称使用高分辨率熔解曲线法同时鉴别三种诺卡氏菌的方法(57)摘要本发明提供了一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别诺卡氏菌菌种的方法，以及用于该方法的基因扩增引物。所述方法包括如下步骤：(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增诺卡氏菌SecA1基因的区间序列，所述区间序列为鼻疽诺卡氏菌SecA1的181-451bp，盖尔森基兴诺卡氏菌SecA1的181-451bp，或者星形诺卡氏菌SecA1的182-452bp；(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。本发明提供的高分辨率熔解曲线法扩增条件简单，反应快速，具有优异的灵敏度和特异性，可特异性的检出鼻疽诺卡氏菌、盖尔森基兴诺卡氏菌和星形诺卡氏

菌。权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图3页CN 110079620 A 2019.08.02

C N 110079620

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110079620 A

1.一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别诺卡氏菌菌种的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增诺卡氏菌SecA1基因的区间序列，所述区间序列为鼻疽诺卡氏菌SecA1的181-451bp，盖尔森基兴诺卡氏菌SecA1的181-451bp，或者星形诺卡氏菌SecA1的182-452bp；

(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；

(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因扩增为荧光定量PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的上下游引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高分辨率熔解曲线法的反应条件为：95℃10s，60℃1min，0.025℃/s升温至95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述高分辨率熔解曲线法中使用的荧光染料为Evagreen。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诺卡氏菌种包括鼻疽诺卡氏菌、盖尔森基兴诺卡氏菌和星形诺卡氏菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(3)所述判读中，鼻疽诺卡氏菌的Tm 值为90.692℃，盖尔森基兴诺卡氏菌Tm值为90.098℃，星形诺卡氏菌Tm值为90.233℃。

9.一组用于高分辨率熔解曲线法鉴别诺卡氏菌菌种中基因扩增引物的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

10.一种使用权利要求9所述核苷酸分子并以高分辨率熔解曲线法鉴别诺卡氏菌菌种的检测方法。

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