人结肠癌HCT_116细胞传代培养的简易方法

人结肠癌ＨＣＴ１１６细胞传代培养的简易方法－

２＊

王　倩１，徐云丹１，赵　刚１，

（湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉４１．３００６５；

）湖北中医药大学中药资源与复方教育部重点实验室，湖北武汉４２．３００６５

摘　要：目的：针对人结肠癌ＨＣ建立一种简Ｔ１１６细胞在体外培养时常出现部分细胞聚团生长的特性，－

——水平震荡法。方法：采用简单高效的水平震荡方法替代胰酶消化法对易的细胞传代培养方法—

利用水平震荡方法传代后的细胞在新瓶中可以正常贴壁。２ＨＣＴ１１６细胞进行传代培养。结果：４ｈ和－

该方法无４８ｈ观察到胰酶消化法传代的细胞生长情况与水平震荡法传代的细胞未见明显差异。结论：

需使用胰蛋白酶，避免了胰酶对细胞的损伤作用，而且操作简便，降低了实验成本和污染的风险。水平震荡传代法可以替代胰酶消化法作为ＨＣＴ１１６细胞的简易传代方法。－关键词：传代培养；水平震荡法ＨＣＴ１１６细胞；－

（）中图分类号：Ｒ３２９．２＋８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７３２１９７２０１３０２００３５０２－－－

ＡＳｉｍｌｅＭｅｔｈｏｄｏｆＨｕｍａｎＣｏｌｏｎＣａｒｃｉｎｏｍａＨＣＴ１１６ＣｅｌｌｓＳｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　　　　　　　－　ｐ

１１１２

，，ＷａｎＱｉａｎＸｕＹｕｎｄａｎＺｈａｏＧａｎ　　ｇｇ＊　

（，Ｈ，Ｗｕ；１．ＣｏｌｌｅｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｈａｎ４３００６５，Ｃｈｉｎａ　　　　　　　ｇｙ　

，２．ＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｏｕｒｃｅａｎｄＣｏｍｏｕｎｄＰｒｅｓｃｒｉｔｉｏｎ　　　　　　　ｙｙｐｐ　　

，Ｗｕ）ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＴＣＭ，ＭｉｎｉｓｔｒｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎｈａｎ４３００６５，Ｃｈｉｎａ　　　　ｙｙ　　

，

：，ＡｂｓｔｒａｃｔＨｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａＨＣＴ１１６ｃｅｌｌｓｏｆｔｅｎｓｈｏｗｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆａｒｅａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ａｓｉｍｌｅｍｅｔｈｏｄａｒｔｌ　　　－　　　　　　　　　　ｇｇｇｐｐｙ　

，ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌｖｉｂｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｗａｓｅｓｔａｂａｌｉｓｈｅｄｗｉｔｈｏｕｔｕｓｉｎｔｒｓｉｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｃａｎａｖｏｉｄｔｈｅｄａｍａｅｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓｂ　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｙｐｇｙ　

，ｔｒｓｉｎａｎｄｉｓｅａｓｔｏｏｅｒａｔｅｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｃｏｓｔａｎｄｒｉｓｋｏｆｔｈｅｏｌｌｕｔｉｏｎ．　　　　　　　　　　　　ｙｐｙｐｐ　

：；；ＫｅＷｏｒｄｓＨＣＴ１１６ＣｅｌｌｓＳｕｂｃｕｌｔｕｒｅＨｏｒｉｚｏｎｔａｌＶｉｂｒａｔｉｏｎ－　ｙ　

Ｔ１１６细胞是Ｂｒａｔｔａｉｎ等人在１９７９年从　　人结肠癌ＨＣ－

一例男性结肠癌患者的癌组织中培养建立起来的低分化型

１］

，广泛应用于恶性肿瘤细胞的生物学特性、抗腺癌细胞株［

［］２５－

。近肿瘤药物作用机理和抗癌药物的筛选等领域的研究

年的研究表明，大多数ＨＣＴ１１６细胞具有肿瘤干细胞的特－

６］

。在体外培养条性，可作为肿瘤干细胞研究的理想对象［

传代培件下，ＨＣＴ１１６细胞一般呈梭形或多角形贴壁生长，－

养时通常采用胰蛋白酶消化法进行。但经典的胰酶消化法传代对细胞可能产生一定的损伤，且操作相对繁琐。我们在实验时发现，ＨＣＴ１１６细胞在体外培养中常出现部分细－

胞聚团堆积生长的现象，且部分细胞相对容易脱落。为了

避免胰酶对细胞的损简化ＨＣＴ１１６细胞传代培养的操作，－

伤，我们针对该细胞容易聚团并易脱壁的特点，建立了简单高效的水平震荡方法替代胰酶消化法对ＨＣＴ１１６细胞进－行传代培养，收到良好的实验效果。

１　材料与方法

１．１　细胞株

人结肠癌ＨＣＴ１１６细胞株购自武汉大学生命科学学－

院中国典型培养物保藏中心。

１．２　试剂

、美国Ｈ新生牛血清（武ＰＲＭＩ１６４０培养基（Ｃｌｏｎｅ公司）－ｙ

、汉三利生物技术有限公司）青霉素与链霉素（华北制药股份有

、。美国Ｈ限公司）０．２５％胰蛋白酶消化液（Ｃｌｏｎｅ公司）ｙ

１．３　器材

，电动震荡仪（浙江金坛仪器厂）倒置显微镜（ＣＫ４０型，

，日本Ｏ超净工作台（苏州净化设ｌｍｕｓ公司）ＹＪ８７５型，－ｙｐ

，日本Ｓ备有限公司）ＣＯＭＣＯ１５ＡＣ型，ＡＮＹＯ公－２培养箱（

，；司）上海大龙医疗设备有限公司）数显５ｍＬ可调移液器（

，恒温水浴锅（国华电器公司）小型台式离心机ＨＨ－４型，

（；国华电器公司）一次性塑料培养瓶（日本８００型，Ｔ２５型，

。ＩＷＡＫＩ公司）

１．４　细胞培养

按无菌操作，将ＨＣＴ１１６细胞接种到含有１０％的新生－

／牛血清、１００ＵｍＬ青霉素和链霉素的ＰＲＭＩ１６４０培养基－

（，置恒温３饱和湿度的二氧化Ｔ２５型培养瓶）７℃、５％ＣＯ２、

碳培养箱中静置培养。每日观察细胞的生长情况，待细胞

收稿日期：２０１２１１１０－－

，作者简介：王倩（女，医学硕士，湖北中医药大学基础医学院讲师。１９７７－），通讯作者：赵刚（男，理学博士，湖北中医药大学基础医学院教授，硕士生导师。１９５９－）

—３

５—

长满培养瓶底面后用传统的胰酶消化法进行传代，共传至８瓶时进行实验。将８瓶细胞分为胰酶消化传代组和水平震荡传代组，每组４瓶，对ＨＣＴ１１６细胞进行两种传代方法－的比较。

１．５　胰酶消化组传代操作

往培养瓶中加入１晃动培养瓶使胰酶均匀分ｍＬ胰酶，

，布到细胞培养面，将培养瓶贴靠在手掌心消化１然后用ｍｉｎ

加入含１５ｍＬ移液器的长吸头吸去胰酶，０％的新生牛血清

用长吸头吹打培养液的ＰＲＭＩ１６４０培养液５ｍＬ终止消化；－

吸取２．１ｍｉｎ使贴壁的细胞脱落下来混成细胞悬液，５ｍＬ细

胞悬液转入另一只入无菌新培养瓶中，在原培养瓶中留下

往两只培养瓶中各补充１２．５ｍＬ细胞悬液，６４０培养液

２．５ｍＬ。将传代后的培养瓶置于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条

每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况。件下静置培养，

１．６　水平震荡组传代操作

往培养瓶中加入５盖紧瓶盖，手握培养瓶沿ｍＬ培养基，

，或者将培养瓶置于电动振荡器上震水平方向快速震荡１ｍｉｎ

，荡３使瓶底面聚团堆积生长的细胞脱落下来并离解为单０ｓ

，细胞状态。震荡结束后将培养瓶在超净台中静置５使震ｍｉｎ

荡过程中产生的泡沫基本消散。用５ｍＬ移液器吸取瓶内的细胞悬液转入另一无菌培养瓶中，这样原瓶中约有一半的细

浸没瓶底胞被转移到新瓶中。再往老瓶中加入５ｍＬ培养液，

完成简易传代过程。将传代后细胞培养瓶贴壁生长的细胞，

每天观察细放置于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条件下静置培养，

胞的生长情况并与胰酶消化法传代的细胞进行比较，利用数码相机徒手显微摄影记录细胞的生长状态。

图３　水平震荡组传代后４８ｈ×２００

３　讨论

胰酶消化传代法是动物与人体细胞培养中广泛应用的

］７

，常用技术［具有对细胞的消化分离效果好等优点，但也存在

可对细胞造成一定损伤等缺点。因此，消化时间不易控制、

针对不同细胞的特点探索新的传代方法在细胞培养实验中具有一定的意义。人结肠癌细胞株ＨＣＴ１１６细胞在生长过－

细胞团一端贴附在培养瓶底面，另一程中会出现聚团现象，

故可利用摇晃培养瓶产生的液体冲击力端游离在培养液中，

分装到新瓶后完成传将细胞团冲刷下来并形成单细胞悬液，

代。本文建立的ＨＣＴ１１６细胞水平震荡传代法具有操作简－无需胰酶等特点，简化了细胞传代的操作步骤，避免了胰单、

同时也降低了实验成本。酶对细胞的损伤，

对于ＨＣ也Ｔ１１６细胞这种部分贴壁部分悬浮的细胞，－

但开瓶操作的可采用吸管或移液管直接吹打法进行传代，

步骤增多，且需要使用吸管或吸头等器材，可能增加污染的机会。而水平震荡传代法在使细胞脱壁时无需开瓶操作，降低了污染的风险。参考文献：

［］卞晓翠．实验细胞资源目录［北京：人民军医出１Ｍ］．　刘玉琴，

版社，２０１０：６５６６．－

［］高凯，刘学丽，等．人结直肠癌细胞ＨＣ２Ｔ１１６红色和　李小颖，

］绿色荧光标记肿瘤模型的建立［中国比较医学杂志，Ｊ．（）：２００９，１９９７１２．－

［］郭莲，彭勇，等．Ｔ３ＳＴＡＲ基因对结肠癌细胞系ＨＣＴ　张玲，－－

］１１６端粒酶活性的影响［Ｊ．世界华人消化杂志，２００５，１３（）：１１１２６７１２７１．－

［方淯靖，卢震海，等．吲哚美辛对结肠癌细胞４］　王国强，

］ＨＣＴ１１６的影响及机制探讨［Ｊ．实用医学杂志，２０１２，２４（）：１１１７５６１７５８．－

［］赵刚．姜黄素对结肠癌ＨＣ５Ｔ１１６细胞生长的抑制作用　王倩，－

［］（）：湖北中医药大学学报，Ｊ．２０１２，１４１１８２０．－

２　结果

在倒置显微镜下观察结果显示，人结肠癌ＨＣＴ１１６细－

胞在培养瓶中部分呈贴壁生长，形态为梭形或多角形，部分细胞则呈半贴壁的聚团生长，细胞团一端贴壁，另一端漂在

）。水平震荡后聚团细胞脱落，图１贴壁细胞数量培养液中（

减少，细胞变圆游离于培养基中。利用水平震荡方法传代后的细胞在新瓶中可以正常贴壁。２４ｈ和４８ｈ观察到胰酶消化法传代的细胞生长情况与水平震荡法传代的细胞未见

），明显差异（图２、图３说明水平震荡传代法可以替代胰酶消

化法作为ＨＣＴ１１６细胞的简易传代方法

。－

图１　传代前ＨＣＴ１１６细胞×２０

０－

［］江恒，陈建芳，等．人结肠癌ＨＣ６Ｔ１１６细胞系肿瘤干　陈克力，－

］：细胞特性研究［Ｊ．解放军医学杂志，２００９，３４（１１）１２９２－１２９６．

［］叶孟，王少敏，等．槲寄生通过抑制Ｎ７ＦＢ活性来诱导　林蕾，－κ

］人大肠癌ＨＣ中国临床药理学与治疗学，Ｔ１１６细胞凋亡［Ｊ．（）：２００８，１３７７３０７３４．－

（责任编辑：王尚勇）

图２　胰酶消化组传代后４８ｈ×２０

０

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2bxe.html