葛根提取物技术要求编制说明 - 图文

葛根提取物技术要求编制说明

为贯彻落实《食品安全法》对保健食品实行严格监管的要求，严格保健食品原料管理，加强保健食品原料的安全监管，提高保健食品准入门槛，做好保健食品许可工作，国家食品药品监督管理局开展了保健食品原料标准的研究工作。按国家食品药品监督管理局食品许可司的要求，我院承担了保健食品原料-葛根提取物技术要求的研究工作。现将编制情况说明如下：

一、编制情况简介

1、通过检索、查阅相关文献资料，收集了全国已有的生产样品，参照已收集的企业生产工艺、制法，经试验确定产品制法并自制部分样品。主要从以下几方面制定产品的技术要求：1 真伪方面。 感官与鉴别。从感官、薄层、特征图谱及所含功效成分等方面鉴别产品的真伪；2 安全方面。按《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求（国家药典委员会）中的规定，注重中药安全性检测方法和指标的建立和完善，加强对重金属及有害元素、残留农药、残留溶剂、残留二氧化硫、微生物、真菌毒素等外源污染物的检测。3 产品质量方面。参考《中国药典》2010年版及相关文献资料，根据产品的实际功效，选定相应的功效成分控制产品的质量。4 根据稳定性研究结果提供产品的贮藏条件。于2010年7月完成了保健食品葛根提取物原料技术要求的试验研究工作。

2、组织有关专家进行评审

2010年7月份，组织相关专家召开了专家论证会。对保健食品葛根提取物原料技术要求进行了论证并提出了修改意见。

3、委托三家检测单位进行了技术复核

2010年9月份，国家食品药品监督管理局食品许可司召开了保健食品原料技术要求制订汇报工作会议。会上对保健食品葛根提取物原料技术要求提出了有关要求。按要求于9月下旬，委托陕西省食品药品检验所，湖北省疾病控制中心及武汉市食品药品检验所三家单位进行了复核。三家检测单位复核结果基本一致，均认为所订葛根提取物原料技术要求整体可行、重现性好。

4、国家食品药品监督管理局食品许可司组织专家进行了技术审评 2010年11月份和2011年1月，国家食品药品监督管理局食品许可司先后

1

两次在北京召开了《保健食品原料葛根提取物质量标准（征求意见稿）》等专家论证会。专家审核认为所建立的技术要求可行，能够有效控制葛根提取物原料的质量。

二、编制说明

名称：按《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求（国家药典委员会）中的规定，本提取物为粗提物，粗提物命名以药材名加提取溶剂加“提取物”构成，提取溶剂为水时可省略为药材名加“提取物”构成。因此本品命名为“葛根提取物”。

制法：参考文献【1、3、4、5、6】，取葛根，粉碎成粗粉，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、80%乙醇为提取溶剂，均加热回流提取两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加8倍量，滤过，合并滤液，滤液于60℃减压浓缩至相对密度为1.10～1.20（室温）的清膏，放冷，每种提取物分别加乙醇使含醇量为60%、70%、80%，静置12小时，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，干燥，即得葛根提取物，计算收率，同时测葛根素及其他异黄酮的含量。结果见表1

表1 不同提取工艺的结果比较表

沉淀用乙提取溶剂 醇浓度 60%乙醇 水 70%乙醇 80%乙醇 60%乙醇 30%乙醇 70%乙醇 80%乙醇 60%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 80%乙醇 80%乙醇 提取收率（%） 25.80 25.70 25.20 32.60 32.50 25.50 31.20 29.00 25.10 33.77 葛根素含量（%） 8.10 9.64 9.99 11.05 11.71 12.28 9.89 11.46 12.98 11.94 其他异黄酮含量 大豆苷（%） 2.78 3.34 3.47 3.83 4.05 4.35 3.27 3.76 4.31 3.67 染料木苷（%） 0.15 0.18 0.18 0.21 0.23 0.24 0.19 0.22 0.25 0.20 大豆素（%） 0.14 0.16 0.16 0.15 0.15 0.17 0.14 0.16 0.18 0.16 染料木素（%） 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 总量（%） 3.074 3.684 3.814 4.194 4.434 4.764 3.604 4.144 4.744 4.034 结果表明：综合考虑提取收率和各提取物中葛根素、其他异黄酮的含量，确定葛根提取物的提取工艺即制法为：取葛根，粉碎成粗粉，加30%乙醇加热回流

2

提取两次，每次2小时，第一次加10倍量，第二次加8倍量，滤过，合并滤液，滤液于60℃减压浓缩至相对密度为1.10～1.20（室温）的清膏，放冷，加乙醇使含醇量为 70%，静置12小时，取上清液，减压回收乙醇，并浓缩至稠膏，干燥，即得。

感官：根据样品的实际外观、性状制定。

鉴别：《中国药典》2010年版收载野葛，其鉴别有显微鉴别和薄层鉴别。因本品为提取物，依据产品的实际情况，只制定薄层鉴别。并对展开剂、薄层板、溶液浓度及点样量进行了实验研究：

1、薄层鉴别方法：

A、对照品溶液的制备：取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

B、对照药材溶液的制备：取葛根对照药材0.8g，加甲醇10ml，放置2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。

C、供试品溶液的制备：取本品0.1g，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。

照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑。

2、展开剂的选择：

A、三氯甲烷：甲醇：水=7：2.5：0.25；见图1

图1

B、甲苯：甲醇：水=7：4：0.1；见图2

3

图2

C、 三氯甲烷：甲醇=4：1；见图3

拖尾、扩散

图3

主斑点Rf值＜0.3，扩散

结果表明：展开剂A的展开效果最好，故展开剂A为实验选定展开剂。 3、薄层板的选择：供试液为不同产地的葛根药材 A、自铺板 结果见图4

图4

B、硅胶G板(青岛海洋化工厂) 结果见图5

4

图5

C、硅胶G板(烟台市化学工业研究所） 结果见图6

图6

结果表明：自制板和青岛海洋化工生产的硅胶G板均可。

4、葛根素最低检出限的测定：取浓度为20ug/ml的葛根素对照品溶液，分别点样0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3μL，葛根素最低检出限为4ng。见图7

1、点样量3μl 2、点样量2μl 3、点样量1μl 4、点样量0.5μl 5、点样量0.4μl 6、点样量0.3μl 7、点样量0.2μl

1 2 3 4 5 6 7 8 图7

5、葛根原药材的薄层鉴别结果 见图8

8、点样量0.1μl

5

图8

1、 厂家D 2、 金贵 3、 神龙

4、 广西（自购） 5、 安徽（自购）

6、 葛根对照药材（中国药品生物制品检验

所，批号：121175-200302）

7、 葛根素对照品（中国药品生物制品检验

所，批号：110752-200912） 8、 四川（自购） 9、 厂家C 10、厂家A 11、厂家B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

6、葛根提取物的薄层鉴别结果 见图9、10

1、葛根提取物（厂家A，批号：A－1） 2、葛根提取物（厂家A，批号：A－2） 3、葛根提取物（厂家B，批号：B－1） 4、葛根提取物（厂家B，批号：B－2） 5、葛根提取物（厂家B，批号：B－3）

6、葛根对照药材（中国药品生物制品检验所，批号：121175-200302）

7、葛根提取物（厂家C，批号：C－1） 8、葛根提取物（厂家C，批号：C－2）

9、葛根素对照品（中国药品生物制品检验所，批号：110752-200912）

10、葛根提取物（厂家C，批号：C－3） 11、葛根提取物（厂家C，批号：C－4） 12、葛根提取物（厂家D，批号：D－1）

13、安徽葛根提取物（自制，批号：20100506） 14、四川葛根提取物（自制，批号：20100504） 15、广西葛根提取物（自制，批号：20100503）

图9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

1 2 3 4 5 6 7 8

图10

1 粉葛20100601-4 2 粉葛 0902 3 葛根素对照品 4 葛根对照药材 5 粉葛0903 6 葛根0901

7 葛根20100601-2 8 葛根20100601-3

检查

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一、水分 取本品，按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H第一法测定，测得结果见表2。

表2 葛根提取物的水分测定结果表

生产厂家 厂家A 厂家A 厂家B 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家C 厂家C 厂家D 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 厂家E 厂家E 厂家E 批号 A-1 A-2 B-1 B-2 B-3 C-1 C-2 C-3 C-4 D-1 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 0901 0902 0903 水分（%） 2.94 4.69 1.21 2.48 2.29 2.66 1.33 2.79 3.07 7.29 3.57 7.59 7.61 2.60 2.66 3.36 2.48 10.1 10.0 10.0 结果表明：葛根提取物的水分绝大部分在5%以下，为了更好控制产品质量，将水分的限度确定为：不得过5.0%。

二、炽灼残渣 取本品，按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ J测定，测得结果见表3。

表3葛根提取物的炽灼残渣测定结果表

7

生产厂家 厂家A 厂家A 厂家B 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家C 厂家C 厂家D 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 厂家E 厂家E 厂家E 批号 A-1 A-2 B-1 B-2 B-3 C-1 C-2 C-3 C-4 D-1 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 0901 0902 0903 炽灼残渣（%） 3.40 9.75 1.12 3.98 0.28 0.09 0.05 0.05 1.28 17.78 3.46 3.06 4.74 3.09 1.54 2.93 2.63 14.0 13.8 14.5 结果表明：葛根提取物的炽灼残渣绝大部分在5%以下，为了更好控制产品质量，将炽灼残渣的限度确定为：不得过5.0%。

三、按《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求（国家药典委员会）中的规定，要注重中药安全性检测方法和指标的建立和完善，加强对重金属及有害元素、残留农药、残留溶剂、残留二氧化硫、微生物、真菌毒素等外源污染物的检测。依据本品的来源及实际情况，本品主要测以下指标：

1 重金属及有害元素 取本品，按照GB 5009.12-2010、GB/T 5009.11-2003、GB/T 5009.13-2003、GB/T 5009.15-2003、GB/T 5009.17-2003测定，测得结果

8

见表4

表4 葛根原药材及葛根提取物的重金属及有害元素测定结果表

注 单位：mg/kg

a 葛根原药材测定结果表

来源 广西（自购） 四川（自购） 安徽（自购） 厂家A 厂家B 厂家C 厂家D 葛根药材-自购（神农） 葛根药材-自购（金贵） 铅 0.3 0.2 0.1 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 镉 0.001 0.0007 0.001 0.0004 0.0004 0.001 0.0004 0.001 0.001 砷 0.05 0.08 0.05 0.02 0.05 0.3 0.06 0.04 0.06 汞 0.02 0.05 0.005 0.02 0.02 0.04 0.04 0.002 0.005 铜 7.0 3.9 4.6 4.7 5.5 5.9 4.6 3.2 3.8

b 葛根提取物的测定结果表

9

生产厂家 厂家A 厂家A 厂家B 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家C 厂家C 厂家D 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 厂家E 厂家E 厂家E 批号 A-1 A-2 B-1 B-2 B-3 C-1 C-2 C-3 C-4 D-1 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 0901 0902 0903 铅 0.3 0.4 0.4 0.04 0.3 0.5 0.5 0.1 0.06 0.3 ＜0.007 0.3 0.03 0.08 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 镉 0.001 0.0006 0.001 0.0006 0.002 0.001 0.002 0.002 0.0007 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002 0.003 0.002 0.002 0.002 砷 0.2 0.06 0.03 0.4 0.03 0.03 0.03 0.03 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 1.3 0.2 0.3 0.3 汞 0.02 0.001 0.009 0.01 0.01 0.001 0.003 0.002 0.002 0.007 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 铜 0.7 4.4 1.1 2.1 0.1 1.0 0.4 0.1 0.9 2.2 6.3 5.0 3.6 3.5 4.1 3.8 4.4 5.0 4.1 3.8

2 六六六、滴滴涕 取本品，按照GB/T 5009.19-2008测定，测得结果见

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表5。

表5葛根原药材及葛根提取物的六六六、滴滴涕测定结果表 a 葛根原药材测定结果表

来源 广西(自购) 四川(自购) 安徽(自购) 厂家A 厂家B 厂家C 厂家D 葛根药材-自购（神农） 葛根药材-自购（金贵）

六六六(mg/kg) 0.007 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 滴滴涕(mg/kg) ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004

b 葛根提取物的测定结果表

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生产厂家 厂家A 厂家A 厂家B 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家C 厂家C 厂家D 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 厂家E 厂家E 厂家E 批号 A-1 A-2 B-1 B-2 B-3 C-1 C-2 C-3 C-4 D-1 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 0901 0902 0903 六六六(mg/kg) 0.004 0.003 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 0.007 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 ＜0.0002 滴滴涕(mg/kg) ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 ＜0.0004 3 微生物 取本品，按照GB 4789.2、GB 4789.3、GB 4789.4、GB 4789.5、GB 4789.10、GB 4789.11、GB 4789.15规定的方法检验，同时微生物的限量依据为“中华人民共和国国家标准 保健( 功能) 食品通用标准 GB 16740一1997”。测得结果见表6。

表6 微生物检验结果

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菌落总数批号 大肠菌群霉菌酵母菌致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、（cfu/g） （MPN/100g） （cfu/g） （cfu/g） 金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌） 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 873 931 865 567 683 605 702 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜30 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 ＜10 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 特征图谱 按照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求（国家药典委员会），通过对所得到的能够体现葛根提取物整体特性的图谱识别，提供一种能够比较全面的控制葛根提取物质量的方法，从化学物质基础的角度保证葛根提取物质量的稳定和可靠。提取物与对照药材特征图谱具相关性，提取物图谱中的特征峰在药材的色谱图上均能指认。进行了专属性、精密性及重现性的试验。

1、仪器与试剂 戴安UltiMate3000高效液相色谱仪，UltiMate3000紫外检测器，Chromeleon色谱工作站；葛根对照品（中检所，批号：110752-200912，含量：96.0%），大豆苷对照品（中检所，批号：111738-200501），染料木苷（中检所，批号：111709-200501），大豆素（中检所，批号：100347-200702，含量：99.7%），染料木素（中检所，批号：111704-200501）；水为纯化水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；葛根药材与葛根提取物的来源及批号见表7

表7 葛根原药材及葛根提取物的样品来源

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a 葛根原药材来源

序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 来源 广西(自购) 四川(自购) 安徽(自购) 厂家A 厂家B 厂家C 厂家D 葛根药材-自购（神农） 葛根药材-自购（金贵）

b 葛根提取物的样品来源

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序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 生产厂家 厂家A 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家D 厂家E 厂家E 厂家E 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 对照药材 批号 A-2 B-1 B-2 C-1 C-4 D-1 0901 0902 0903 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 中检所(121175-200302)

2、色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（AichromBond-AQ

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C18 4.6×250mm 5μ）；流动相：乙腈（流动相A）-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）（流动相B），梯度洗脱，洗脱梯度程序见表8；检测波长：260nm；柱温：35℃。

表8 流动相洗脱梯度表 时间（min）

0.0 9.0 10.0 12.0 18.0 18.5 26.0 3、溶液的制备

3.1 参照物溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每1ml含葛根素0.2mg的溶液，即得。

3.2 对照品溶液的制备 取大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大豆苷0.5mg、染料木苷0.25mg、大豆素0.25mg和染料木素0.25mg的混合溶液，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.3 对照药材溶液的制备 取葛根对照药材约0.5g,置锥形瓶中，加60%乙醇50ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。

3.4 供试品溶液的制备 取本品50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4、测定方法 分别吸取参照物溶液、对照品溶液、对照药材溶液与供试品溶液各10μl，按照“2”项色谱条件，注入液相色谱仪，测定，即得。见色谱图11、12、13、14。

流速（ml/min）

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

A（%） 20 30 30 48 48 20 20

B（%） 80 70 70 52 52 80 80

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图11 参照物溶液色谱图 图12 对照溶液色谱图

图13 对照药材溶液色谱图 图14 样品溶液色谱图

峰1（峰S）：葛根素 峰2：未知峰 峰3：大豆苷 峰4：染料木苷 峰5：大豆素

5、测定方法的确立 5.1 流动相的选择

】参考相关文献【7，，用甲醇-水、甲醇-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）、乙腈-

水、乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）等多种流动相进行试验，结果经过对不同流动相所记录的色谱图的综合分析与比较（保留时间、理论板数、分离度、拖尾因子），以乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6），梯度洗脱为流动相效果最好，故确定流动相为乙腈-0.02mol/L乙酸铵（pH=4.6）进行梯度洗脱。

5.2 检测波长的确定

取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品溶液在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，结果分别在250nm、260nm、261nm、249nm、261nm波

17

长处有最大吸收，综合考虑，确定260nm为本试验的检测波长。见紫外扫描图1

A 葛根素 B 大豆苷 C 染料木苷

D 大豆素 E 染料木素

紫外扫描图1

5.3 专属性试验 取空白溶剂、参照物溶液、对照品溶液、对照药材溶液与供试品溶液各10μl，按照“2”项色谱条件，注入液相色谱仪，结果样品溶剂不干扰测定。

5.4 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，结果各共有峰的相对保留时间的RSD及峰面积的RSD见表9。

表9 精密度试验结果表 a 各共有峰的相对保留时间

进样 相 次数 对保 峰号 留时间 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 1.000 1.065 1.354 1.991 3.210 1.000 1.065 1.351 1.989 3.203 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 18

1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.994 3.210 1.000 1.065 1.354 1.992 3.208 0.000 0.005 0.088 0.090 0.088

b 各共有峰的峰面积

进样 次数 峰 峰号 面积 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 110.215 111.026 111.105 111.786 111.102 111.252 111.047 29.225 47.319 5.882 3.690 28.954 47.734 5.960 3.712 29.274 48.375 5.967 3.689 29.351 48.316 5.952 3.683 29.379 48.297 5.927 3.658 29.322 48.166 5.906 3.649 29.237 48.008 5.938 3.686 0.502 0.579 0.967 0.582 0.524

结果表明精密度良好。

5.5重复性试验 取同一批样品的均匀细粉，取50mg，精密称定，置50ml量瓶中，共6份，照“3.4”项方法制备供试品溶液，结果各共有峰的相对保留时间的RSD 及峰面积的RSD见表10。

表10 重复性试验结果表 a 各共有峰的相对保留时间

供试品 相 溶液 对保 峰号 留时间 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.067 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.985 3.198 1.000 1.065 1.353 1.987 3.198 1.000 1.065 1.353 1.985 3.198 1.000 1.065 1.353 1.986 3.198 0.000 0.082 0.000 0.056 0.000

19

b 各共有峰的峰面积 F值=各峰峰面积/取样量

供试品 溶液 峰号 F值 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 平均 RSD(%) 2.969 0.459 0.860 0.136 0.356 2.943 0.453 0.862 0.137 0.358 2.954 0.456 0.857 0.137 0.358 2.928 0.452 0.855 0.136 0.357 2.927 0.450 0.856 0.137 0.355 2.974 0.459 0.870 0.139 0.359 2.949 0.455 0.860 0.137 0.357 0.685 0.833 0.653 0.753 0.420 结果表明重复性良好。

6、样品测定结果 称取本品适量，照“3.4”项方法制备供试品溶液，按上述方法进行测定，测得结果见表11。

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表11 样品特征图谱测定结果

相对保留时间 生产厂家 厂家A 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家D 自制（广西药材） 自制（四川药材） 自制（安徽药材） 自制（四川药材） 自制（河南药材） 自制（广西药材） 自制（安徽药材） 厂家E 厂家E 厂家E 葛根原药材 葛根原药材 葛根原药材 葛根原药材（厂家B） 葛根原药材（厂家A） 葛根原药材（厂家C） 葛根原药材（厂家D） 葛根原药材（自购-神农） 葛根原药材（自购-金贵） 对照药材(中检所) 批号 峰1 A-2 B-1 B-2 C-1 C-4 D-1 20100503 20100504 20100506 20100601-2 20100601-3 20100601-1 20100601-4 0901 0902 0903 广西 四川 安徽 121175-200302 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 21

峰2 1.06 1.06 1.07 1.06 1.06 1.06 1.05 1.06 1.06 1.06 1.06 1.05 1.06 1.07 1.07 1.07 1.05 1.07 1.06 1.06 1.07 1.06 1.06 1.06 1.05 1.07 峰3 1.35 1.35 1.36 1.35 1.35 1.35 1.35 1.34 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 1.36 1.35 1.35 1.36 1.35 1.35 1.35 1.35 1.35 峰4 1.99 1.98 1.99 1.99 1.98 1.99 1.99 1.98 1.98 1.99 1.99 1.99 1.99 1.98 1.99 1.99 1.99 2.00 1.98 1.99 2.00 1.99 1.99 1.99 1.99 1.99 峰5 3.20 3.20 3.20 3.21 3.20 3.20 3.20 3.18 3.19 3.21 3.21 3.21 3.21 3.21 3.21 3.21 3.21 3.22 3.20 3.21 3.22 3.20 3.21 3.21 3.21 3.20

含量测定 葛根中含有多种有效成分，主要为异黄酮，因此为了有效控制产品质量，制定此项。并以葛根素、其它异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素）的含量作为质量控制指标。

1、仪器与试剂、色谱条件同特征图谱项 2、溶液的制备

2.1 对照品混合溶液的制备 取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含葛根素1mg、大豆苷0.2mg、染料木苷0.1mg、大豆素0.1mg和染料木素0.1mg的混合溶液，摇匀，即得对照品混合溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取本品约60mg，精密称定，置25ml量瓶中，加60%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3、测定法

3.1标准曲线的制备 分别精密量取对照品混合溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0ml,置10ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得对照品系列溶液。分别精密吸取对照品系列溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

3.2 测定 精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按标准曲线法以峰面积计算，即得。

4、测定方法的确立

4.1 流动相的选择及检测波长的确定同特征图谱项。

4.2 专属性试验 取空白溶剂、对照品溶液、与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下分别进行测定，记录色谱图。结果表明：样品溶剂不干扰测定。

4.3 溶剂的选择 取本品适量，共4份，精密称定，分别置25ml量瓶中，分别加30%、50%、60%、70%乙醇适量，超声提取30min，取出，放冷至室温，分别加30%、50%、60%、70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10μl进样，以峰面积与取样量的比值计算比较。结果表明用60%乙醇作溶剂适合。见表12

22

表12 溶剂的选择结果表

峰面积/取样量 提取溶剂 葛根素 30%乙醇 50%乙醇 60%乙醇 70%乙醇 297.6 312.8 310.8 299.4 大豆苷 46.7 51.6 53.1 52.9 染料木苷 6.5 7.3 7.5 7.5 大豆素 16.6 20.0 20.9 21.0 染料木素 1.0 1.3 1.4 1.5 4.4 最低检出限试验：取均约0.1mg/ml 的对照溶液经逐步稀释，进样10μl，记录色谱图，信噪比大于3为最低检出限，测得结果如下：葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素均为0.01μg/ml，即葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素均为0.1ng。

4.5 超声提取时间的确定 取本品适量，共4份，精密称定，分别置25ml量瓶中，加60%乙醇适量，分别超声提取10min、20min、30min、40min，取出，放冷至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10μl进样，以峰面积与取样量的比值计算比较。结果表明超声30min即可，见表13。

表13 超声提取时间试验结果表

超声提取时间（min） 10 20 30 40 峰面积/取样量 葛根素 500.0 541.0 547.8 530.8 大豆苷 80.4 81.1 81.1 82.0 染料木苷 12.2 12.3 12.3 12.4 大豆素 33.5 34.0 33.7 34.3 染料木素 2.4 2.4 2.4 2.4 4.6 线性关系考察 精密称取葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素对照品各约10mg，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液1.0ml，置100ml 量瓶中，用60%乙醇稀

1。11、释至刻度，摇匀，得对照品溶液○分别精密量取对照品溶液○2.5、5、25ml，

置50ml 量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，同时精密量取对照品储备液0.5、5ml，置10ml 量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液系列，浓度分别为0.2、0.5、1、5、10、50、500ug/ml，分别精密量取10μl进样。在上述

23

色谱条件下进行测定，记录峰面积，以对照品溶液浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明：葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆素和染料木素在浓度为0.2～500 μg/ml范围内，线性关系均良好。见表14。 表14 线性关系考察试验结果

组分 对照品浓度（μg/ml） 0.204 0.510 1.021 葛根素 5.104 10.208 51.040 510.400 0.201 0.503 1.006 大豆苷 5.030 10.060 50.300 503.000 0.233 0.582 1.164 染料木苷 5.818 11.636 58.180 581.800 0.201 0.502 1.005 大豆素 5.024 10.048 50.240 502.400 0.195 0.488 0.975 染料木素 4.876 9.752 48.760 487.600 峰面积 0.114 0.305 0.627 2.769 4.774 27.284 310.892 0.116 0.310 0.639 3.169 5.701 31.378 359.146 0.188 0.511 1.049 5.298 10.470 52.063 495.608 0.177 0.476 1.032 5.025 9.985 49.563 431.735 0.241 0.655 1.410 7.111 14.168 71.081 663.344 r=0.9999 Y=1.3592X+0.9806 r=0.9999 Y=0.8576X+1.3806 r=0.9999 Y=0.8512X+0.5529 r=0.9999 Y=0.7154X-1.0561 r=0.9999 Y=0.6103X-0.8967 线性关系 24

4.7 进样精密度试验 取同一对照品溶液连续进样6次，每次进样10μl，记录峰面积，结果表明：此方法的进样精密度良好。见表15

表15 进样精密度试验结果

进样 次数 峰 组分 面积 葛根素 大豆苷 染料木苷 大豆素 染料木素 1 63.596 56.289 14.478 21.051 24.170 2 63.582 56.551 14.500 21.029 24.133 3 63.713 56.264 14.502 21.023 24.203 4 63.754 56.353 14.474 20.992 24.103 5 63.395 56.337 14.478 21.038 24.105 6 63.889 56.372 14.489 20.960 24.119 平均 63.655 56.361 14.487 21.016 24.139 RSD(%) 0.27 0.18 0.08 0.16 0.16

4.8 回收率试验 分别精密称取葛根素对照品24.96mg、大豆苷对照品12.89mg、染料木苷对照品6.32mg、大豆素对照品5.92mg和染料木素对照品6.90mg，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

精密称取本品(自制-安徽，批号：20100506)约25mg，共6份，分别置6个25ml量瓶中，均精密加入对照品储备液2.0ml，再加60%乙醇适量，照“2.2”项方法制备供试品溶液，照“3”项方法测定，按标准曲线法以峰面积计算回收率。结果见表16。

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表16 回收率试验结果

组分

取样量/mg 23.30 25.82 23.66

葛根素

27.26 27.48 25.12 23.30 25.82 23.66

大豆苷

27.26 27.48 25.12 23.30 25.82 23.66

染料木苷

27.26 27.48 25.12 23.30 25.82 23.66

大豆素

27.26 27.48 25.12 23.30

染料木素

25.82 23.66

127.02 128.04 117.05 3.11 3.45 3.16

473.60 473.60 473.60 552.00 552.00 552.00

26

样品含量/ug 加入量/ug 2806.86 3110.44 2850.23 3283.91 3310.41 3026.11 595.97 660.43 605.18 697.26 702.89 642.52 46.10 51.09 46.82 53.94 54.37 49.70 108.57 120.31 110.24

1996.80 1996.80 1996.80 1996.80 1996.80 1996.80 1031.20 1031.20 1031.20 1031.20 1031.20 1031.20 505.60 505.60 505.60 505.60 505.60 505.60 473.60 473.60 473.60

测得总量/ug 4832.45 5157.95 4885.20 5290.25 5339.97 5045.34 1651.67 1720.49 1662.80 1753.52 1760.85 1706.85 547.06 550.39 547.06 552.20 553.74 551.64 575.67 589.64 577.95 592.30 594.57 583.90 556.35 556.47 556.81

回收率/% 101.44 102.54 101.91

平均回收率/% RSD/%

101.52

100.48 101.64 101.12 102.38 102.80 102.56

102.66

102.43 102.60 103.21 99.08 98.75 98.94

98.90

98.55 98.77 99.28 98.63 99.10 98.76

98.64

98.24 98.51 98.57 100.23 100.19 100.30

100.16

0.69

0.30

0.26

0.29

0.20

27.26 27.48 25.12

3.64 3.67 3.35

552.00 552.00 552.00

554.64 555.96 557.41

99.82 100.05 100.37

注：测得量=供试液中各组分测得的总量-样品中所含各组分的量

4.9 重复性试验 取同一批号样品(自制-安徽，批号：20100506)的均匀细粉适量（约相当于葛根素5mg），共6份，精密称定，分别置6个25ml量瓶中，照“2.2”项方法制备供试品溶液，照“3”项方法测定，按标准曲线法以峰面积计算含量。结果见表17。

表17 重复性试验结果

序号 1 2 3 4 5 6 平均 RSD（%）

取样量

（mg） 51.32 50.10 49.45 54.92 48.51 52.19

葛根素含量（mg/g） 121.8022 121.0859 121.5911 119.6439 119.1711 119.5030 120.4662 0.96

其它异黄酮含量（mg/g）

大豆苷 25.7153 25.6903 25.5885 25.5271 25.4796 25.4685 25.5782 0.41

染料木苷 1.9791 1.9841 1.9745 1.9733 1.9784 1.9830 1.9787 0.22

大豆素 4.6495 4.6853 4.6415 4.6426 4.6694 4.6689 4.6595 0.38

染料木素 0.1342 0.1340 0.1335 0.1328 0.1336 0.1333 0.1335 0.39

4.10 溶液稳定性试验 取同一供试品溶液分别在不同时间点0h、5h、10h、20h、30h、40h、60h、80h各进样10μl，记录各色谱峰的峰面积，结果表明在80小时内稳定性良好。见表18

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表18 溶液稳定性试验结果表

时间（h） 0 5 10 20 30 40 60 80 平均 RSD（%）

峰面积

葛根素 175.258 176.508 173.994 173.967 173.979 173.913 174.801 176.588 174.876 0.65

大豆苷 69.742 71.292 70.076 70.787 70.506 70.619 71.626 72.348 70.875 1.20

染料木苷 48.982 49.152 48.935 49.165 48.990 49.092 49.164 49.181 49.083 0.20

大豆素 48.549 48.801 48.729 49.043 48.890 49.042 49.112 49.237 48.925 0.46

染料木素 56.091 56.461 56.327 56.426 56.293 56.369 56.507 56.756 56.404 0.34

4.11 样品含量测定：精密称取本品适量，照“2.2”项方法制备供试品溶液，同时照“2.1”项方法制备对照品溶液，照“3”项方法测定，记录各色谱峰的峰面积，按标准曲线法以峰面积计算含量。结果见表19：

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表19 含量测定结果表

其它异黄酮含量（mg/g） 葛根素含量生产厂家 批号 （mg/g） 厂家A 厂家A 厂家B 厂家B 厂家B 厂家C 厂家C 厂家C 厂家C 厂家D A-1 A-2 B-1 B-2 B-3 C-1 C-2 C-3 C-4 D-1 0.87 153.46 418.05 223.61 959.40 427.14 824.22 922.26 264.56 96.18 8.23 136.32 130.39 134.07 146.15 18.73 20.36 83.67 84.49 77.01 大豆苷 未检出 38.82 51.25 59.42 2.33 52.51 2.76 2.31 67.88 14.58 1.74 34.52 27.69 33.05 36.87 2.37 2.59 25.38 25.34 23.12 染料木苷 未检出 3.42 2.22 5.29 1.57 2.27 1.67 1.57 6.99 1.26 0.16 2.50 2.14 2.57 3.08 0.14 0.21 2.37 2.36 2.13 大豆素 未检出 4.25 1.67 7.83 0.37 1.70 0.46 0.37 9.70 3.66 0.89 3.11 5.04 4.04 3.28 6.14 6.97 1.85 1.84 1.67 染料木素 未检出 0.20 未检出 0.27 未检出 未检出 未检出 未检出 0.31 0.19 0.05 未检出 0.14 0.18 0.17 0.15 0.18 0.06 未检出 0.05 总量 总量的比值 它异黄酮的葛根素与其未检出 46.69 55.14 72.82 4.27 56.47 4.88 4.26 84.89 19.70 2.83 40.13 35.01 39.84 43.40 8.80 9.95 29.66 29.54 26.97 3.29 7.58 3.07 224.68 7.56 168.90 216.49 3.12 4.88 2.91 3.40 3.72 3.37 3.37 2.13 2.05 2.82 2.86 2.86 自制（广西药材） 20100503 自制（四川药材） 20100504 自制（安徽药材） 20100506 自制（四川药材） 20100601-2 自制（河南药材） 20100601-3 自制（广西药材） 20100601-1 自制（安徽药材） 20100601-4 厂家E 厂家E 厂家E 0901 0902 0903 样品稳定性试验 取葛根提取物一批(自制-四川，批号：20100504)，按《中国药典》2010年版二部附录ⅩⅨ C的方法进行稳定性研究—影响因素试验，包括高温、高湿及强光照射试验。

重点考察的项目有性状（外观）、吸湿性及含量。结果见表20

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表20 样品稳定性试验-影响因素试验结果

时间影响因素 （天） 高温 10 5 高湿（75%） 10 高湿（92.5%） 强光 10 5 10 5 性状 （外观） 棕黄色粉末 棕色粉末 棕黑色粉末 膏状、棕黄色 稀膏状、棕黄色 稀膏状、棕黄色 溶液状、霉变 棕色粉末 棕黑色粉末 其它异黄酮含量（mg/g） 吸湿性葛根素含（%）（增、染料木染料木量（mg/g） 大豆苷 大豆素 减重） 苷 素 -3.81 -4.35 23.29 25.62 总量 0 5 136.32 136.18 135.92 135.98 136.39 135.16 136.03 135.77 136.15 34.52 33.87 33.59 34.16 34.61 33.96 34.87 33.91 33.19 2.50 2.45 2.45 2.47 2.52 2.45 2.53 2.44 2.41 3.11 3.06 3.04 3.10 3.14 3.09 3.15 3.05 2.99 未检出 40.13 未检出 39.38 未检出 39.07 未检出 39.73 未检出 40.27 未检出 39.50 未检出 40.56 未检出 39.41 未检出 38.59 48.00 56.90 2.36 3.48 结果表明：本品极易吸潮，同时在高温及强光照射下，性状-外观易发生改变。因此本品应密封，置凉暗干燥处。

葛根提取物技术要求的讨论

葛根素的含量及其它异黄酮总量的限度、葛根素与其它异黄酮总量的比值 所测样品结果表明：自制样品的葛根素与其它异黄酮总量的比值均在2～4之间；购买样品的葛根素与其它异黄酮总量的比值大部分在8以下，但有的葛根素的含量高达96%，而其它异黄酮的总量最低只有0.4%左右，且葛根素与其它异黄酮总量的比值最高达225。据了解，目前市场上已有葛根素的化学合成原料购买。

为了防止不法生产厂家进行葛根素的化学合成原料的非法添加，本技术要求中一方面规定葛根素与其它异黄酮总量的限度，还对葛根素与其它异黄酮总量的比值进行了控制。但自制样品量有限，葛根素含量与其它异黄酮的总量没有充足的数据量。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/2b1.html