纤维素酶活力的测定

生物化学实验报告

题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

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一、

实验目的：

掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。

二、

实验原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、

实验试剂：

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，

加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，

此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待

测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）

四、

实验器材：

1. 比色管10支。 2. 722型分光光度计。 3. 滴管。 4. 水浴锅。 5. 移液枪。 6. 电炉。 五、

实验步骤：

1. 标准曲线的绘制：分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的葡萄糖于5支

1

比色管中，均用蒸馏水稀释至1ml，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水21ml，摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线。

2. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样

品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。

3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴

中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm测OD值。

六、

实验结果：

在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成葡萄糖微克数定为一个活力单位。

N×OD值对应的葡萄糖量

纤维素酶活力单位＝

30×1

N---酶液的稀释倍数 30---糖化所用时间 1---反应酶液ml数 实验测得的数据记录如下：

表1 各比色管550nm OD值

比色管 标准葡糖液/ml 葡萄糖/μg 550nm OD值

1 0 0 0

2 0.2 200 0.109

3 0.4 400 0.228

4 0.6 600 0.351

5 0.8 800 0.487

6 1.0 1000 0.594

空白 -- 0 0

样品1 样品2 样品3 -- 未知 0.433

-- 未知 0.431

-- 未知 0.431

样品550nm OD值平均值= 作出标准曲线：

0.433+0.431+0.431

= 0.432。

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2

图1 葡萄糖溶液550nm OD值标准曲线

通过标准曲线可求得样品中葡萄糖量为732μg，所以：

100×732

纤维素酶活力单位＝ =2.44×103u/mg

30×1所以每克固体酶的活力=2.44×103×103=2.44×106u

七、

注意事项：

1. 在测定OD值过程中，绘制标准曲线时要用1号葡萄糖标准液（葡萄糖

浓度为0）调零，测定样品OD值时要用样品空白液调零。从实验原理上看，这样做的目的是：无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。得到的标准曲线经过坐标原点。 2. 用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/27of.html