胚胎实验室操作手册

附件6-01 胚胎实验室操作手册 第一节 胚胎实验室每日工作流程

第二节 胚胎实验室安全与质量控制

一、 实验室安全与感染控制

实验室必须有完善的安全制度和防患措施，必须有关于火、电意外引起紧急情况时的应急方案，实验室人员必须了解灾情中的救援措施。为避免停电影响设备正常运转，应备有双重供电系统，或不间断电源（UPS），以确保二氧化碳培养箱和显微镜等关键设备在意外停电时满足正常工作。

1. 所有体液样本（精液、血液、卵泡液等）必须视同潜在污染源，

所有的供体组织和体液应有适当的传染病监测。

2. 实验室工作人员应清楚乙肝疫苗的必要性并接受乙肝疫苗接种。 3. 特别小心不要被那些受体液污染的仪器或设备意外损伤。 4. 避免将体液溅到眼中。

5. 当接触体液或盛放体液的容器时，应带一次性无粉橡胶或塑料手

套。离开实验室时，将手套脱下丢掉，决不可重复使用。 6. 离开实验室时，脱掉实验室衣服，不能穿着出入公开场所或餐厅。 7. 被体液沾染时，必须马上用消毒液或肥皂清洗。 8. 接触配子和胚胎的耗材必须使用一次性用品。

9. 因体液溢出污染实验室设备时，应在操作完成后用75%酒精消毒。 10. 在实验室体液操作中必须使用机械抽吸装置，禁止用口吸。 11. 所有操作步骤和体液处理应小心，尽量减少浮滴和烟雾生成。例

如离心时必须用带盖的试管。

12. 实验室中严禁吃东西、吸烟等。

13. 所有丢弃的体液和用后的一次性物品必须按污染物品处理。 二、 实验室质量控制 (一)

培养箱的质量控制

专人管理，每日确认以下各项内容并予以记录： 1. CO2的控制：6%±0.2%； 2. 温度的控制：37℃±0.2℃；

3. 湿度：大于80%RH，水盘内水的深度始终保持在大约1cm 以上。

培养箱内的水盘使用超纯水，根据不同培养箱要求定期更换，换水当天培养箱不放卵子或胚胎；

4. 培养箱显示器温度与培养箱内温度计的温度应一致。不一致时应

及时调整校正。

5. 消毒清洁：每隔3个月消毒培养箱。消毒时拆卸培养箱内所有钢

架，以75%酒精和超纯水分别擦拭消毒，再送高压消毒。培养箱内壁以75%酒精和超纯水分别擦拭。消毒清洁完成后，需开机运行稳定后方可使用。 (二)

培养用气体的质量控制

1. 使用有合法资格的气体供应厂家，气瓶使用前需检查是否有合格

证标签。

2. 使用医用高纯度CO2（99.995%以上）培养胚胎。每天记录气瓶

的压力，定期检查气瓶有无漏气并更换培养箱外气体过滤器。

3. CO2进入培养箱之前，必须经过CODA过滤器对CO2进行过滤。

CODA过滤器应定期更换，根据供气量，每3-6个月更换一次。 4. CO2分压应与培养箱要求的压力相符，当气瓶CO2气体接近用完

时，应及时更换新的气瓶，记录更换气瓶时间。 (三)

UPS的质量控制

重要仪器如培养箱、显微镜、冰箱等必须连接到UPS上，每日观察UPS工作状态，如有异常及时找工程师维修。 (四)

液氮罐的质量控制

1. 胚胎冷冻液氮罐需每天查看外观，每周至少两次检测剩余量，按

时添加液氮，使液氮深度保持在25cm以上。 2. 液氮运输罐需专人更换。 3. 液氮罐应存放于固定位置。 4. 液氮罐应每3年进行一次校验。 (五)

超净工作台的质量控制

1. 超净工作台层流系统提供洁净环境，用于胚胎培养的准备工作，

如培养液配制、培养皿准备、胚胎操作等，不能进行其它存有污染性的操作。

2. 超净工作台应于每天工作前提前30分钟开启，台面温度应稳定

于设定的温度。

3. 超净台每年应至少检测一次洁净度。 (六)

实验室层流系统的质量控制

1. 体外受精实验室温度维持在24±2℃之间，湿度在40%以上，每

日观察并记录温度和湿度，如果波动过大及时进行调整，若有异常，尽快维护和处理。

2. 在有胚胎的情况下不能关闭实验室净化空调系统。

3. 实验室净化空调系统由专业人士检测维护，新风口滤网每2-4周

更换一次，回风口滤网每月更换一次，初效过滤器每1-3个月更换一次，中效过滤器每3-6个月更换一次，高效过滤器每1-2年更换一次，并做好维护检测记录。如遇特殊情况，及时更换。 4. 每日观察并记录胚胎实验室与冷冻间、缓冲间、移植手术室及取

卵手术室之间的压差。如果压差＜5Pa，应查找原因，及时检修和维护。

5. 每月进行实验室空气细菌培养。 (七)

冰箱的质量控制

专人管理，每天检测并予以记录。 1. 冷藏层：2?8℃； 2. 冷冻层：-15?-20℃。 (八)

热台的质量控制

专人管理，每天操作前检测并予以记录。 要求：38℃±0.5℃。 (九)

实验室仪器设备的使用和维护

1. 建立设备常规操作程序，并严格按照操作程序执行。 2. 保存各种设备的使用说明文件。

(五) TESA精子处理操作常规

1. 术前一天准备4管G-IVF Plus，每管3ml，置37℃、6% CO2培

养箱平衡。

2. 术前，为临床医生准备2个加3ml G-IVF Plus 的Falcon3001皿，

2个1ml的注射器。

3. 实验室人员和临床医生同时核对患者姓名及其妻子姓名，在附睾、

睾丸取精/活检手术记录上签名。

4. 用无菌巴斯德吸管在火焰上灭菌，再把吸管尖烧成圆炖，冷却后

待用，并连同15ml、5ml的圆底试管标上患者的姓名。 5. 睾丸穿刺前准备一个小皿，加入2ml G-IVF Plus给医生。准备两

个1ml的注射器和两个小皿，加入2ml的G-IVF Plus。 6. 临床医生从睾丸中抽吸出曲细精管放于盛有G-IVF Plus的

Falcon3001皿中，送实验室。用平衡好的G-IVF Plus至少洗涤一次后，将曲细精管移在另一有G-IVF Plus的Falcon3001皿中，在体视镜下，用两个注射器针头，划开曲细精管，在倒置显微镜下观察是否有精子。若精子数量能够满足临床应用，通知男科医生结束手术。

7. 将有精子标本的Falcon3001皿置室温培养箱孵育2h。 8. 将睾丸组织混悬液转移至离心管中，静置2分钟，用巴斯德吸管

将大块组织移走，300g离心5分钟，去上清，留取0.1~0.2ml沉渣，混匀松盖后置37℃、6%CO2培养箱，备用。 9. 完成相应实验室记录和病历。

二、 捡卵操作常规 (一)

捡卵前配液准备

1. 配液在取卵前一天进行。

2. 卵泡冲洗培养液（G-MOPSTM）：取G-MOPSTM10ml放入圆底试

管（Falcon 2001）中，加入肝素300IU/100ml，紧盖后置37℃培养箱中平衡过夜，备用。

3. 捡卵皿的准备：吸取G-MOPS Plus3ml培养液加入培养皿（Falcon

3001）内盖矿物油2ml，每个患者准备2个，放在不通CO2气体、37℃培养箱内过夜平衡。

4. 洗卵液的准备：吸取3mlG-IVF Plus培养基放入圆底试管（Falcon

2001）中，每个患者准备2管，置37℃、6% CO2培养箱平衡。 5. 受精皿的准备：准备四孔板，每孔加入受精培养液（G-IVF Plus）

800?l，盖矿物油0.5ml，准备的四孔板个数依据各个患者的卵泡数估算，≤8个准备一块四孔板，8-16个准备2块四孔板，依此类推，放置37℃、6% CO2培养箱平衡。

6. 如为ICSI授精方式，准备卵裂液培养皿：用G1 Plus做成10个

微滴，每滴25?l，盖矿物油3.0ml，每个患者准备数目参照四孔板数，置于37℃、6% CO2培养箱内平衡。 (二)

捡卵

1. 根据患者卵泡数目，在IVF工作站台面上预热一定数量Falcon

3003培养皿。

2. 检查实验室记录单上患者的姓名，并与患者和临床医生当面核对，

确保无误。

3. 检查已平衡好的培养液，包括冲管液，洗卵培养液和受精培养液。 4. 收集在试管内的卵泡液倒入Falcon 3003培养皿内，形成一薄层

液体，轻轻振荡，迅速扫描卵冠丘复合物（OCCC）的存在，用巴斯德吸管吸起后在解剖显微镜下确认。典型的OCCC用肉眼可看到，为灰色透亮的粘液团，中央见到的小的白点为卵母细胞和放射冠，通常直径在2-4mm大小。在体视镜下（20-50倍）观察，确诊粘液团内是否有卵母细胞存在，如有OCCC附于血凝块上，可直接用巴斯德吸管分离。将选出的卵子先置于捡卵皿中暂存。

5. 取出平衡好的洗卵液加入已预温的小培养皿中（Falcon 3001）；

更换巴氏吸管，将捡卵皿中的卵子转入洗卵皿中洗涤2次，再转移至受精皿中，每孔不超过3枚卵子，立即将受精皿置于培养箱内培养。在记录表上记录取卵情况及卵子所放置培养箱编号，并在培养箱贴上标签。

6. 为保持卵母细胞的活性，应尽可能缩短卵子暴露在培养箱外的时

间，要求整个操作过程必须无菌、快速，并注意避光，温度维持于37℃，以尽量减少培养液的pH值和渗透压变化。

7. 取卵过程如发现异常，如未见卵母细胞，获取数明显少于卵泡数，

及时与医生沟通。

8. 捡卵结束后，粗略评估卵母细胞的质量和成熟度，确定合适的授

精时间，通常需培养3-6小时。

并继续进针，至卵中心或越过中心位置（卵母细胞直径的50-75%），轻微回吸注射针，当胞浆和精子出现快速返流的过程，指示卵膜已破，停止回吸，将精子缓慢注入卵子胞质内，缓慢退出注射针。退出注射针后，调节持卵针负压，释放卵子。 14. 重复上述步骤至所有的成熟卵子都注射完毕，将ICSI皿从显微

镜热板转移至解剖镜下，从培养箱取出卵裂培养皿，每个卵子在培养皿中央两个液滴中漂洗数次，再转移至旁边微滴中放回培养箱。 15. 注意事项

（1） 将精子和卵子加入操作皿中都必须双人核对皿上的患者姓名、

精子、卵子的标记，并签名确认。

（2） ICSI操作皿制备要快速，同一时间只能准备1个皿，要避免

微滴蒸发脱水，临近ICSI操作时准备。

（3） 尽量减少PVP注射入卵子中。 （4） 用注射针制动精子要避开其颈部。

（5） 精子注射进入胞浆的深度约为卵子直径的50-75%。 （6） ICSI操作时动作要轻柔快速，从制动精子至精子被注入一枚

卵子胞质中的时间宜控制在3分钟内。

五、 卵子与胚胎评分系统 （一） 卵子评分

1. 卵－冠－丘复合物评分：

Ⅰ级：这级卵子通常为不成熟或退化的卵子，有的是异常卵子。卵细胞呈浅透明状，放射冠完全没有分开，卵丘细胞紧密排列，颜色偏浅或卵丘细胞团很小。

Ⅱ级：这级卵子通常为接近成熟的卵子。卵细胞外观颜色较深，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘细胞排列变稀松，颜色变浅。

Ⅲ级：这级卵子通常为成熟卵。卵细胞外观颜色偏深，形态为规则的圆形，放射冠呈完全分散状，卵丘细胞团通常较大，排列松散，颜色很淡。

Ⅳ级：这级卵子通常为过熟卵子。卵细胞颜色变深，放射冠分散，但外周的卵丘细胞团很小或缺失。 2. 卵细胞成熟度的判断

MII期卵子：细胞核的结构消失，第一极体已排出。此时胞浆中看不到细胞核的结构，在卵黄间隙中可见第一极体。

MI期卵子：细胞核的结构消失，但第一极体尚未排出。在此阶段的卵子中既看不到细胞核也看不到第一极体。

GV期卵子：外观颜色清淡，细胞核的结构尚未消失，在此阶段的卵子胞浆中可看见细胞核结构。 3. ICSI破膜方式

A：破膜顺利。胞质回吸后在透明带附近破膜。

B：破膜困难。胞质回吸后明显超过透明带才发生破膜。 C：无弹性。注射针刺入卵子后，卵子无明显变形，破膜感觉不明显。

（二） 受精卵评分

1. 正常受精卵（2PN）：表现为胞质内有两个原核，可见第二极体。

根据两原核的大小、形态、核仁数目、大小和分布等，分为Z1-Z4级。

Z1级：每个原核核仁数3-7个，核仁在原核相交处排列成线； Z2级：原核大小相等，但核仁不成线排列在原核相交处； Z3级：两原核特征不同，核仁的大小、数目不等，不排列在原核相接处；

Z4级：原核大小明显不等，原核相离。 2. 异常受精卵

多PN、1PN或者卵质内没有原核，此类受精卵不适合进行移植。 3. 原核的出现和消失是一个动态过程，不同的时间评估可能会有不

同的结果。应在相对固定的时间授精（取卵后3-6小时），相对固定的时间观察原核（授精后16-20小时），并记录好这两个时间。

（三） 卵裂期胚胎评分

I级：细胞大小均匀，形状规则；胞质均匀清晰，没有颗粒现象；碎片在0－5％之间。

II级：细胞大小略不均匀，形状略不规则；胞质可有颗粒现象；碎片在6－20％之间。

III级：细胞大小明显不均匀，可有形状的明显不规则；胞质可有明显颗粒现象；碎片在21－50％之间。

IV级：细胞大小严重不均匀，胞质可有严重颗粒现象；碎片在50％以上。

（四） 囊胚的评分 1. 分期

1期：早期囊胚，囊胚腔不到整个胚胎的1/2。 2期：囊胚腔超过了胚胎体积的1/2。

3期：扩张囊胚，囊胚腔完全占据胚胎的总体积。 4期：囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大。 5期：正在孵出囊胚，滋养外胚层通过透明带向外凸出。 6期：孵出囊胚完全从透明带孵出。 2. 3-6期囊胚再评估项目

内细胞团：

A：包裹紧密，大量细胞 B：结构松散，少量细胞 C：极少量细胞 滋养外胚层：

A：许多细胞形成紧密结合的上皮 B：少量细胞形成结构松散的上皮

C：极少量细胞

（五） 解冻胚胎的评分

1. 解冻后所有卵裂球存活的胚胎，按新鲜胚胎的评分标准进行评分； 2. 解冻后如有卵裂球死亡，则仅记录存活的卵裂球数，不再进行评

分；

3. 冻融胚胎一半以上卵裂球存活，胚胎可判断为存活，可用于移植。

（六） 注意事项

1. 观察过程应迅速，尽量减少胚胎在培养箱外暴露的时间。在实验

室记录上记录每个胚胎的情况。

2. 原核的观察在受精后的16-20小时进行，D2胚胎观察在受精后

的40-44小时进行，D3胚胎观察在受精后的64-68小时进行，D5胚胎观察在受精后112-116小时进行。

（七） 优质胚胎定义 1. Day1为2pn；

2. Day2（授精后40-44小时）：2－5细胞，碎片? 20％，大小比较

均匀；

3. Day3（授精后64-68小时）：6-10细胞，碎片? 20％，大小比较

均匀；

4. Day5-6（授精后112-140小时）：3BB及以上。

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