MTT实验跟踪总结

MTT实验

MTT实验第一阶段 细胞培养：细胞传代与冻存…（此处略，苹果你已会！）

MTT实验第二阶段（自己总结）

细胞种板：往96孔板中接种适宜数量的细胞，并保证细胞在96孔板小孔中均匀分布，正常生长，是MTT实验成功的首要条件。

主要步骤：

（1）.细胞生长：保证细胞处于对数生长期，简而言之就是将已基本铺满培养瓶底的细胞进行消化，但不传代，就是将旧的培养基换掉，让贴壁的细胞悬浮，并培养一天。此时细胞处于对数生长期，细胞活力最好，有利于MTT实验的结果。

（2）.细胞消化：将昨天的细胞吸去旧的培养基（将死细胞吸走，可用过滤灭菌的PBS溶液轻轻冲洗细胞），加入胰酶消化，随后加入适宜培养基（不宜过多，勿将细胞稀释的过稀，达不到种板所需的细胞浓度要求）。切记利用吹打管将细胞吹打均匀（大量细胞会聚集在一起，细胞分散不均，吹打不匀会影响细胞计数的准确性及随后种板的均一性）；但吹打过猛过多也会影响细胞活力。

（3）.细胞计数：计数之前，应用75%酒精将计数器其载玻片擦拭干净，以免上面残留杂质影响细胞计数。取一小滴（估计20ul左右）吹打均匀的细胞培养液沿细胞计数器上端凹槽轻轻缓慢打出滴下，此时小液滴会自动（虹吸原理）铺满细胞计算器的上部小方块（如图1）；将细胞计算器放置于显微镜下观察计数，找到左上、左下、右上、右下各4块16格的区域（如图2），数下各块区域的细胞数目，并记录数据（计数原则：当有细胞压16格外线时，记上不记下，记左不记右）。得到细胞浓度。

计算公式为：细胞浓度=[（A1+A2+A3+A4）/4]*104/ml

（4）.细胞稀释：就是将细胞稀释到接种于96孔板时细胞接种数目浓度。每孔加入200ul，细胞数目（5000左右，个人认为）。在稀释细胞是既要考虑接种浓度，也要考虑接种总共所需的细胞培养液体积（避免细胞浓度适宜，但体积不够接种于所需加样的小孔）

（5）.细胞加样：每次加样前需要将细胞培养液振荡，加几孔最好吹打一下细胞培养液（防止有的细胞沉降），目的是将细胞混合均匀，保证种板的均一性。根据自己设计的96孔板加样方式，一般一种药物的浓度可配6个浓度，每个浓度加5个重复孔，另外需设有对照组，空白组（一般情况下96孔板外围的36孔不种细胞，加入相同体积的PBS溶液，从而减少内部的60孔中细胞培养液的挥发，称之为边缘效应）（如图3）。

（6）.96孔板观察：当将细胞顺利接种到对应小孔中后，将96孔板放置于显微镜下观察

各孔中细胞状态及分布是否均匀等（保证为正常存活的细胞，在细胞形态学上符合MTT要求，保证MTT结果的可靠性，也在细胞形态学上论证MTT细胞实验的结果）。 （7）.细胞再培养：将96孔板重新放回孵温箱中培养（设定培养时长为24h及48小时），但可根据细胞的生长状况重新设定加药的时间。一般在种板的第二天即可加药。

苹果，药物灭菌问题还有MTT配制相关的问题，我在查查，然后在问问。 MTT实验第三阶段

（1）.药物灭菌：目前灭菌方式有煮沸灭菌、高压灭菌、紫外灭菌、过滤灭菌、辐射灭菌、无菌制备等。（自己看看吧），可以先冻干在再紫外灭菌试试（紫外照射会破换紫杉醇结构吗？或者会影响纳米晶体的物理性质吗？）

（2）.梯度药物溶液配制：首先查阅文献找到紫杉醇的IC50值。两种梯度配制方法（一般5-6个梯度）：以IC50作为中间梯度，上下各配两梯度，梯度浓度一般相差10倍；或将IC50作为最高浓度梯度，往下配制几个梯度浓度（确保无菌操作）。此外配制药物溶液所用培养基是否加入血清，众说纷纭，培养基是保证细胞存活的基本条件，血清加入是保证细胞增殖的要求，个人觉得应用含血清的培养基来配制溶液。

（3）.96孔板加药：加药时，应将旧培养基全部吸掉，将96孔板呈30°角放置，利于将培养基吸尽，且不影响细胞。具体操作：一个梯度浓度的5个孔吸掉培养基，再往5个孔中加入含药物的培养基（防止在将全部孔中的旧培养基吸掉的过程中，前面孔中细胞由于缺少培养基而干死）。加样量为200ul。 MTT溶液配制

MTT，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，为强致癌物质，在称取过程中需要格外小心，苹果！MTT浓度为5mg/ml，一般每孔加20ul，因此一块板最多需要1200ul，即1.2ml。可多配制，锡箔纸包住避光4℃保存。MTT配制多用生理盐水或PBS溶液。MTT水溶性不好（虽为季铵盐类，但结构式周围苯环及噻唑无形之中降低其水中的溶解度），50mg溶于10ml水，超声半天都不能完全溶解（这个问题我现在还没找到解决方法，苹果）。

MTT实验第四阶段

（1）.96孔板加MTT：一般都是将加药后的96孔板培养至24小时，使药物充分对细胞进行作用。而实际情况下有些药物会很快抑制细胞生长，见效时间短，那么在这种情况下再将药物与细胞放置培养24小时的话，最终的结果中梯度浓度的肿瘤抑制率上就不会有梯度效果，无法计算IC50，更无法知晓哪个浓度为最有效浓度或最接近有效浓度。判断上述现象可以通过细胞形态学来，即将96孔板放置于显微镜下进行观察，如果发现细胞大量死亡应终止培养，加MTT（情况不可一概而论）。

具体操作：在适宜的时间点吸掉旧培养基，如果你的药物与MTT可以反应（将MTT还原成甲赞）,用无菌的PBS（200μl-300μl）冲洗加药孔，冲洗应注意勿将活细胞带走。清洗完后，每孔在加入100μl完全培养基，随后每孔加入20-50μlMTT,对照组与空白组也执行以上操作。加完MTT将96孔板放入孵温箱培育4h，拿出后先离心，防止吸掉液体时也将甲赞沉淀吸走，影响最终的OD值。

肿瘤细胞抑制率=1-（加药孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白空OD）

一般情况下，最终96孔板颜色越深，该浓度下该药物的肿瘤抑制率越低。但也会有其它原因造成紫色加深，例如染菌、药物自身与MTT发生反应等。前期种板的细胞数目的均一性，加样的准确性等也会影响最终的实验结果。

Eto不同剂型癌细胞抑制率比较100Free EtoEto NPsPEG-Eto NPs80A549抑制率604020012345123451234CAAAAABBBBBCCC不同剂型不同浓度（ug/ml）C5

Free EtoEto NPsPEG-Eto NPs10080A549抑制率6040200-1012浓度（ugml)

这是我们第二次MTT实验结果。

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