完整word版2015药典生物样品定量分析方法验证指导原则

生物样品定量分析方法验证指导原一、范

准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药浓度，对于药和制剂研发非常重要这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性或根据动学药动学

和生物等效性试验的结果做出关键性决定因此必须完整地验记录应用的生物分

析方法，以获得可靠的结果

本指导原则提供生物分析方法验证的要求也涉及非临床或临床试验样品际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法

生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求应该在相应的生物样品分析中遵GL原则GC原则

二、生物分析方法验

（一）分析方法的完整验

分析方法验证的主要目的是证明特定方法对于测定在某种生物基质中分物浓度的可靠性此外方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂一般应对个新分析方

法和新分析物进行完整验证当难于获得相同的基质时可以采用当基质替代，但要说明理由

一个生物分析方法的主要特征包括选择性定量下限响应函数和校正围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶中储存和处理全过程中的稳定性

有时可能需要测定多个分析物这可能涉及两种不同的药物也可能涉及个母体药物及其代谢物或一个药物的对映体或异构体在这些情况下验证分析的原则适

用于所有涉及的分析物

对照标准物

在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基中。此外，色谱方法通常使用适当的内标

应该从可追溯的来源获得对照标准物质应该科学论证对照标准物质的适性分析证书应该确认对照标准物质的纯度并提供储存条件失效日期和批号对于内标

只要能证明其适用性即可例如显示该物质本身或其相关的任何杂不产生干扰。．当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的标它们必须具有足够高的同位素纯度并且不发生同位素交换反应以避免果

的偏差

1.选择

该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品其他组分应该使用至个受试者的适宜的空白基质来证明选择（动物空基质可以不同批次混合它们被分别分析并评价干扰当干扰组分的响应低分析物定量下限响应20，并低于内标响应5时，通常即可以接受

应该考察药物代谢物经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物起干扰的程度在适当情况下也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母分析物的

可能性

2.残

应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度应通过在注射高浓度样品或校正标样后注射空白样品来估计残留高浓度样之后在

空白样品中的残留应不超过定量下限20并且不超过内标5如残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证检验并在试验样品分析时应这些措施以确保不影响准

确度和精密度这可能包括在高浓度样品后注射空样品，然后分析下一个试验样品 3.定量下

定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度具有可接受的准度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的

4.标准曲

应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应获得标准曲线通过入已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基应该与目标试验样品基质相同方法验证中研究的每种分析物和每一分析批应该有一条标

准曲线

在进行分析方法验证之前最好应该了解预期的浓度范围标准曲线范围该尽量覆盖预期浓度范围由定量下限和定量上（校正标样的最高浓度来定。该范围应该足够描述分析物的药动学

应该使用至个校正浓度水平不包括空白样（不含分析物和内标的理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质）。每个校正标样可被多次处理和分析

应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式空白和零浓度品结果不应参与计算标准曲线参数。．应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在法验证中，至少应该评条标准曲线校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±1以内，定量下限处应该±20%内。至75校正标样，含最个有效浓度，应满足上述标准。如果个校正标样结果不符合这些标准应该拒绝这一标样不含这一标样的标准曲应被重新评价，包括回归分析

最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线但如果有稳定性数据支持也可使用预先配制并储存的校正标样

5.准确

分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表为：（测得真实值xl00。应采用加入已知量分析物的样品来评估准确度即质控样品

质控样品的配制应该与校正标样分开进行使用另行配制的储备液

应该根据标准曲线分析质控样品将获得的浓度与标示浓度对比准确度报告为标示值的百分比。应通过单一分析批（批内准确度）和不同分析批（批准确度）获得质控样品值来评价准确度

为评价一个分析批中不同时间的任何趋势推荐以质控样品分析批来证明确度，其样品数不少于一个分析批预期的样品数

批内准确

为了验证批内准确度应取一个分析批的定量下限及低中高浓度质控品，每个浓度至少个样品。浓度水平覆盖标准曲线范围：定量下限，在不于定量下限浓倍的低浓度质控样品标准曲线范围中部附近的中浓度质控品，以及标准曲线范围上限75处的高浓度质控样品。准确度均值一般应在控样品标示值的±15%之内，定量下限准确度应在标示值的20范围内

批间准确

通过至个分析批，且至少两天进行，每批用定量限以及低、中、浓度质控样品每个浓度至个测定值来评价准确度均值一般应在质控样标示值的±15%范围内，对于定量下限，应在标示值的±20%范围内

报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果但是已记录

明显失误的情况除外

6.精密

分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度定义为测量值的相对准差（变异系数）。应使用与证明准确相同分析批样品的结果，获得在同批内和不同批间定量下限以及低、中、高浓度质控样品的精密度。．对于验证批内精密度，至少需要一个分析批的4个浓度，即定量下限以及低中、高浓度，每个浓度至个样品。对于质控样品，批内变异系数一般不得15，定量下限的变异系数不得超20

对于验证批间精密度，至少需个分析批（至天的定量下限以低、中、高浓度，每个浓度至个样品。对于质控样品，批间变异系数一般得超15，定量下限的变异系数不得超20

7.稀释可靠

样品稀释不应影响准确度和精密度应该通过向基质中加入分析物至高于量上限浓度，并用空白基质稀释该样品（每个稀释因子至个测定值），来明稀释的可靠性。准确度和精密度应在±15%之内，稀释的可靠性应该覆盖试样品所用的稀释倍数

可以通过部分方法验证来评价稀释可靠性如果能够证明其他基质不影响密度和准确度，也可以接受其使用

8.基质效

当采用质谱方法时应该考察基质效应使用至批来自不同供体的空基质，不应使用合并的基质。如果基质难以获得，则使用少批基质，但应说明理由对于每批基质应该通过计算基质存在下的峰面（由空白基质提取后加分析物和内标测得与不含基质的相应峰面（分析物和内标的纯溶液比值计算每一分析物和内标的基质因子进一步通过分析物的基质因子除以内标的质因子计算经内标归一化的基质因子批基质计算的内标归一化的基质子的变异系数不得大15。该测定应分别在低浓度和高浓度下进行

如果不能适用上述方式例如采用在线样品预处理的情况则应该通过分至批基质分别加入高浓度和低浓（定量下限浓倍以内以及接近定上限），来获得批间响应的变异。其验证报告应包括分析物和内标的峰面积，及每一样品的计算浓度。这些浓度计算值的总体变异系数不得大15

除正常基质外还应关注其他样品的基质效应例如溶血的或高血脂的血样品等 9.稳定

必须在分析方法的每一步骤确保稳定性用于检查稳定性的条件例如样基质抗凝剂容器材料储存和分析条件都应该与实际试验样品的条件相似用文献报道的数据证明稳定性是不够的

采用低和高浓度质控样（空白基质加入分析物至定量下限浓倍以内由新鲜在预处理后以及在所评价的条件储存后立即分析及接近定量上限）．备的校正标样获得标准曲线，根据标准曲线分析质控样品，将测得浓度与标示度相比较，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15% 范围内

应通过适当稀释考虑到检测器的线性和测定范围检验储备液和工作溶的稳定性

稳定性检查应考察不同储存条件，时间尺度应不小于试验样品储存的时间通常应该进行下列稳定性考察

·分析物和内标的储备液和工作溶液的稳定性

·从冰箱储存条件到室温或样品处理温度基质中分析物的冷冻和融化稳性·基质中分析物在冰箱储存的长期稳定性

此外，如果适用，也应该进行下列考察

·处理过的样品在室温下或在试验过程储存条件下的稳定性

·处理过的样品在自动进样器温度下的稳定性

在多个分析物试验中特别是对于生物等效性试验应该关注每个分析物含所有分析物基质中的稳定性

应特别关注受试者采血时，以及在储存前预处理的基质中分析物的稳定性以确保由分析方法获得的浓度反映受试者采样时刻的分析物浓度可能需要根分析物的结构，按具体情况证明其稳定性

（二）部分验

在对已被验证的分析方法进行小幅改变情况下根据改变的实质内容可需要部分方法验证可能的改变包括生物分析方法转移到另一个实验室改仪器校正浓度范围样品体积其他基质或物种改变抗凝剂样品处理步骤储存条件等。应报告所有的改变，并对重新验证或部分验证的范围说明理由

（三）交叉验

应用不同方法从一项或多项试验获得数据或者应用同一方法从不同试验点获得数据时需要互相比较这些数据时需要进行分析方法的交叉验证如可能应在试验样品被分析之前进行交叉验证同一系列质控样品或试验样品被两种分析方法测定。对于质控样品，不同方法获得的平均准确度应在±15%围内，如果放宽，应该说明理由。对于试验样品，至67样品测得的两组数差异应在两者均值的±20%范围内

三、试验样品分在分析方法验证后，可以进行试验样品或受试者样品分析。需要在试验样分析开始前证实生物分析方法的效能

应根据已验证的分析方法处理试验样品以及质控样品和校正标样以保证析批被接受

（一）分析

一个分析批包括空白样品和零浓度样品，包括至个浓度水平的校正样，至个浓度水平质控样品（低、中、高浓度双重样品，或至少试验样品数5，两者中取数目更多者），以及被分析的试验样品。所有样品（校正样质控和试验样品应按照它们将被分析的顺序在同一样品批中被处理和取一个分析批包括的样品在同一时间处理即没有时间间隔由同一分析者继处理，使用相同的试剂，保持一致的条件。质控样品应该分散到整个批中，

此保证整个分析批的准确度和精密度

对于生物等效性试验建议一名受试者的全部样品在同一分析批中分析减少结果的变异

（二）分析批的接受标

应在分析试验计划或标准操作规程中，规定接受或拒绝一个分析批的标准在整个分析批包含多个部分批次的情况应该针对整个分析批也应该针对分批中每一部分批次样品定义接受标准。应该使用下列接受标准

校正标样测定回算浓度一般应在标示值的±15%范围内定量下限应在±20范围内。不少个校正标样，至75标样应符合这些标准。如果校正标样有一个不符合标准则应该拒绝这个标样重新计算不含该标样的标准曲线进行回归分析质控样品的准确度值应该在标示值的±15%范围内。至67质控样品，每一浓

度水平至50样品应符合这一标准。在不满足这些标准的情况下，应拒绝该分析批，相应的试验样品应该重新提取和分析

在同时测定几个分析物的情况下，对每个分析物都要一条标准曲线。果一个分析批对于一个分析物可以接受而对于另一个分析物不能接受，则受的分析物数据可以被使用但应该重新提取和分析样品测定被拒绝的分析物

如果使用多重校正标样其中仅一个定量下限或定量上限标样不合格则正范围不变

所有接受的分析批每个浓度质控样品的平均准确度和精密度应该列表在分析报告中给出。如果总平均准确度和精密度超15，则需要进行额外的察，说明该偏差的理由。在生物等效性试验情况下，这可能导致数据被拒绝

（三）校正范如果在试验样品分析开始前，已知或预期试验样品中的分析物浓度范围窄则推荐缩窄标准曲线范围调整质控样品浓度或者适当加入质控样品新的浓度以充分反映试验样品的浓度

如果看起来很多试验样品的分析物浓度高于定量上限在可能的情况下该延伸标准曲线的范围，加入额外浓度的质控样品或改变其浓度

至个质控样品浓度应该落在试验样品的浓度范围内如果标准曲线范被改变，则生物分析方法应被重新验证（部分验证），以确认响应函数并保证确度和精密度

（四）试验样品的重新分析和报告值选

应该在试验计划或标准操作规程中预先确定重新分析试验样品的理由以选择报告值的标准在试验报告中应该提供重新分析的样品数目以及占样品总的比例重新分析试验样品可能基于下列理由

·由于校正标样或质控样品的准确度或精密度不符合接受标准导致一个析批被拒绝

·内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著

·进样不当或仪器功能异常

·测得的浓度高于定量上限或低于该分析批的定量下限且该批的最低度标样从标准曲线中被拒绝，导致比其他分析批的定量下限高

·在给药前样品或安慰剂样品中测得可定量的分析物

·色谱不佳

对于生物等效性试验，通常不能接受由于药动学理由重新分析试验样品

在由于给药前样品阳性结果或者由于药动学原因进行重新分析的情况下该提供重新分析样品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析获得值、最接受值以及接受理由

在仪器故障的情况下如果已经在方法验证时证明了重新进样的重现性和样器内稳定性则可以将已经处理的样品重新进样但对于拒绝的分析批则要重新处理样品

（五）色谱积

应在标准操作规程中描述色谱的积分以及重新积分任何对该标准操作规的偏离都应在分析报告中讨论实验室应该记录色谱积分参数在重新积分的况下，记录原始和最终的积分数据，并在要求时提交。．（六）用于评价方法重现性的试验样品再分析

在方法验证中使用校正标样和质控样品可能无法模拟实际试验样品。例如蛋白结合、已知和未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异可能

影响这些样品在处理和储存过程中分析物的准确度和精密度因此推荐过在不同天后在另外一个分析批中重新分析试验样品来评价实际样品测定准确度检验的范围由分析物和试验样品决定并应该基于对分析方法和分析的深人理解。建议获附近和消除相样品的结果，一般应该重新分10ma品，如果样品总数超100，则超出部分重新分5样品

对于至67的重复测试原始分析测得的浓度和重新分析测得的浓度之的差异应在两者均值的±2范围内

试验样品再分析显示偏差结果的情况下应该进行考察采取足够的步骤化分析方法

至少在下列情形下，应该进行试验样品的再分析

·毒动学试验，每个物种一

·所有关键性的生物等效性试

·首次用于人体的药物试

·首次用于患者的药物试

·首次用于肝或肾功能不全患者的药物试

对于动物试验可能仅需要在早期关键性试验中进行实际样品的再分析如涉及给药剂量和测得浓度关系的试验

四、配体结合分

配体结合分析主要用于大分子药物前述的验证原则以及对试验样品分析考虑一般也适用。但是由于大分子固有的特点和结构复杂性，使其难以被提取所以常常在无预先分离的情况下测定分析物此外方法的检测终点并不直接自分析物的响应而来自与其他结合试剂产生的间接信号配体结合分析中个校正标样质控样品以及待测样品一般都采用复孔分析如无特殊说明本以双孔分析为原则（―）方法验证前的考

1.标准品选

生物大分子具有不均一性其中成分的效价与免疫反应可能存在差异因用于配制校正标样应尽量使用纯度最高的标准品应对标准品进行充分表征。．质控样品的标准品应尽量与临床和非临床试验使用的受试品批号相同。标准品号变更时，应尽量对其进行表征和生物分析评价，以确保方法性能不变

2.基质选

一般不推荐使用经碳吸附免疫吸附等方法提取过的基质或透析血清白缓冲液等替代实际样品基质建立分析方法但在某些情况下复杂生物基质可能存在高浓度与分析物结构相关的内源性物质其高度干扰导致根本无法测分析物。在无其他可选定量策略的前提下，可允许使用替代基质建立分析方法但应对使用替代基质建立方法的必要性加以证明

可采用替代基质建立标准曲线但质控样品必须用实际样品基质配制应过计算准确度来证明基质效应的消除

3.最低需求稀释度的确

分析方法建立与验证过程中可能需要对基质进行必要的稀释以降其产生的高背景信号在此情况下应考察最低需求稀释度它是指分析方法为提高信噪比减少基质干扰优化准确度与精密度而必须使用缓冲液对生物进行稀释的最小倍数。应使用与试验样品相同的基质来配制加药样品来确最低需求稀释度

4.试

方法的关键试剂，如结合蛋白、适配子、抗体或偶联抗体、酶等，对分析果

会产生直接影响因此须确保质量如果在方法验证或样品分析过程中关试剂批次发生改变须确认方法性能不因此改变从而确保不同批次结果的一性无论是关键试剂，还是缓冲液、稀释液、酸化剂等非关键试剂，都应对维其稳定性的保障条件进行记录，以确保方法性能长期不变

（二）方法验

1.完整验

）标准曲线与定量范

标准曲线反映了分析物浓度与仪器响应值之间的关系在配体结合分析方中，标准曲线的响应函数是间接测得的，一般呈非线性，常型曲线

应使用至个有效校正标样浓度建立标准曲线校正标样应在预期定量围对数坐标上近似等距离分布。除校正标样外，可使用锚定点辅助曲线拟合验证过程中，须至少个独立的分析批进行测定，结果以列表形式报告以确定标准曲线回归模型整体的稳健性拟合时一条标曲允许排除由于明确的校正标样回算浓度在标示75排除后应至少不明原因产生失误的浓度点。．的±20%（定量下限与定量上限在±25%）范围内。定量下限与定量上限之间的度范围为标准曲线的定量范围。锚定点校正样品是处于定量范围之外的标样点用于辅助拟合配体结合分析的非线性回归标准曲线因其在定量范围之外可遵循上述接受标准）特异

特异性是指在样品中存在相关干扰物质的情况下分析方法能够准确专地测定分析物的能力结构相关物质或预期合用药物应不影响方法对分析物的定如在方法建立与验证阶段无法获取结构相关物质特异性评价可在最初方验证完成后补充进行应采用未曾暴露于分析物的基质配制高浓度与低浓度质样品加入递增浓度的相关干扰物质或预期合用药物进行特异性考察未加入析物的基质也应同时被测量要求至80以上的质控样品准确度在±20% 范内（如果在定量下限水平，则在±25%范围内），且未加入分析物的基质的测值应低于定量下限）选择

方法的选择性是指基质中存在非相关物质的情况下，准确测定分析物的力由于生物大分子样品一般不经提取基质中存在的非相关物质可能会干扰析物的测定。应通过向至1个不同来源的基质加入定量下限和定量上限水的分析物来考察选择性也应同时测量未加入分析物的基质选择性考察要求80以上的样品准确度在±20%围内（如果在定量下限水平，则在±25%围内且未加入分析物的基质的测量值应低于定量下限如果干扰具有浓度赖性则须测定发生干扰的最低浓度在此情况下可能需要在方法验证之前整定量下限根据项目需要可能需要针对病人群体基质或特殊基（如溶血质或高血脂基质）考察选择性

）精密度与准确

应选择至个浓度的质控样品进行准确度、精密度以及方法总误差考察包括定量下限浓度、低浓度质控（定量下限浓度倍以内）、中浓度质控（准曲线中段）、高度质控（定量上限浓75以上）以及定量上限浓度质控低中高浓度质控标示值不得与校正标样浓度标示值相同质控样品应经过冻并与试验样品采用相同的方法进行处理不建议采用新鲜配制的质控样品行精密度与准确度考察。批间考察应在数日内进行至个独立的分析批测定每批内应包含至套质控样（每套含至个浓度的质控样品对于批和批间准确度，各浓度质控样品的平均浓度应在标示值的±20%（定量下限和量上限为±25%）范围内。批内和批间精密度均不应超20（定量下限和定上限25）。此外，方法总误差（即％相对偏绝对值与％变异系数之和不应

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