近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用的研究进展

第３４卷，第９期　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析２０１４年９月　　　　　　　　　　　　SpectroscopyandSpectralAnalysisVol畅３４，No畅９，pp２３７７‐２３８１September，２０１４　

近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用的研究进展

於筱岚１，徐　宁２，３，何　勇２倡

１畅浙江大学农业与生物技术学院，浙江杭州　３１００５８　　　　２畅浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州　３１００５８３畅浙江工业大学药学院，浙江杭州　３１００１４

摘　要　综述了近红外分析技术在农作物生长及食品加工处理过程中氨基酸检测的应用情况，及其研究进展。对近红外分析食品氨基酸应用中涉及的化学值HPLC检测以及化学计量学方法进行总结，对相关原始文献中的数据、资料和主要观点进行整理和归纳。对氨基酸的HPLC、化学计量学分析方法及其在农作物品质监测、茶叶中氨基酸和茶多酚含量的同时测定、饲料品质鉴定、奶酪火腿肉制品中氨基酸及其他化学成分含量的测定情况进行了综述，分析了方法的优缺点并对近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用进行了展望。近红外光谱在氨基酸检测中应用的发展需基于氨基酸高效液相色谱检测的化学值来建立相应的模型，模型传递的问题是目前制约其大范围推广的主要原因。在线分析可以监测从原料到产品的整个反应变化过程，满足食品从生产到销售等领域中品质实时监控的需求，将是今后重要的发展方向。

关键词　近红外光谱；氨基酸；食品

中图分类号：O６５７畅３　　文献标识码：A　　　DOI：１０畅３９６４／j畅issn畅１０００‐０５９３（２０１４）０９‐２３７７‐０５

引　言

氨基酸分析是食品、农业生产，化学工业以及生命科学研究和应用中最重要的技术之一。对氨基酸检测技术的快速，准确，低耗能的追求是历代科研工作者一直努力的方向。

随着技术的发展，高效液相色谱（highperformanceliq‐uidchromatography，HPLC）法（离子交换或反相）替代甲醛滴定法和凯氏定氮法成为了药典和食品检测中氨基酸定量测定的标准方法。近年来，由于对分析速度、灵敏度、鲁棒性和再现性等要求的不断提高，也得益于仪器仪表的进步，新的氨基酸分析方法不断被开发出来。除了已经建立的气相色谱质谱联用（GC‐MS）分析技术，还有毛细管电泳质谱联用（MS）（capillaryelectrophoresisMS）、元素分析Ultra高效液相色谱（HPLC‐MS）和液相色谱（LC）与其他检测器的联用［１］。这些氨基酸的检测虽然准确程度比甲醛滴定法和凯氏定氮法大大提高，然而繁琐程度依然或更甚。需要专业的技术人员，将样本经过前处理后进行过柱检测，没有经过一定培训的技术人员难以掌握。

　收稿日期：２０１３‐１０‐０４，修订日期：２０１４‐０１‐２０

　基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７１３３２）和国家支撑计划项目（２０１１BAD２１B０４）资助

　作者简介：於筱岚，女，１９９２年生，浙江大学农业与生物技术学院茶学系本科生　　e‐mail：hangzhouyxl＠１６３．com

倡通讯联系人　　e‐mail：yhe＠zju畅edu畅cn

Fig畅1　Developmentandapplicationofthe

samplescalibrationequation

物质的含氢基团（C—H，N—H，O—H等）在波长７８０～

spectroscopy，NIRS）改变了这一状况，其原理是是利用有机

近年来出现的近红外光谱技术（nearinfraredreflectance

２５２６nm的电磁波区域跃迁时产生的光谱变化，结合计算机学与化学计量学测定样品中多种化学成分含量。关键优势在

２３７８光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷

matography，HPCEC），在柱后流出液中加入茚三酮，间接检测由氨基酸生成的具有可见光吸收的衍生物。

柱后茚三酮衍生法［３］准确可靠、重现性高，能测定大量氨基酸及其同系物，但也存在灵敏度不高的弱点，准确分析只可用于１００pmol以上的氨基酸，其对脯氨酸在４４０nm的单独检测也是一个不足。以荧光胺、邻苯二甲醛（OPA）代替茚三酮作为柱后衍生剂可以提高３个数量级的灵敏度，但二者都无法直接与脯氨酸发生反应。

因此，柱前衍生反相高效液相色谱法（reversedphasehighperformanceliquidchromatography，RP‐HPLC）在近年来也得到了长足的发展，逐渐开始取代柱后衍生HPCEC在一些领域的应用。通过选择适宜的衍生剂并与每种氨基酸定量反应生成具有一定稳定性的特定产物，再通过高效液相色谱分析产物以此反推氨基酸，柱前衍生反相高效液相色谱法具有操作简单、色谱分离分辨率高、检测灵敏度高、分析时间短，便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定的优点。目前常用的柱前衍生剂［４］有邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC‐Cl）和丹酰氯（Dansyl‐Cl）。柱前衍生反相高效液相色谱法衍生方法比较如表１所示。

其不需试剂、药品以及前处理，可透过玻璃或塑料直接检测，分析及维护成本比色谱分析技术低得多，因而在食品，水果，农产品等检测领域的研究得到了迅速的发展［２］。

该技术通过采集样品光谱、光谱预处理、建立定标模型、进行外部验证等步骤，建立光谱参数与样品中氨基酸的真实含量之间的一定关系，并以此预测未知氨基酸含量样品中氨基酸含量（见图１）。具有分析快速、无污染、样品无损、重现性好等多种优点（图１）。

本文对近红外分析食品氨基酸应用中涉及的化学值HPLC检测以及化学计量学方法进行了综述，对相关原始文献中的大量数据、资料和主要观点进行整理和归纳，以期反映该技术的发展历史、当前状况与趋势。

１　氨基酸的HPLC分析

自动氨基酸分析仪问世于２０世纪６０年代初，并已实现程控自动化和数据处理电脑化，分析时间缩短至１h以内，此后氨基酸自动分析仪广泛地应用于各行各业。经典方法是以阳离子交换树脂为固定相，酸性缓冲液为流动相，依据高效阳离子交换色谱（highperformancecationexchangechro‐

Table1　Comparisonofpre‐columnderivatizationmethodsforaminoacidanalysisbyRP‐HPLC

柱前衍生剂PITCOPA衍生时间／min

２０４５５１衍生物稳定性

不稳定稳定稳定稳定

衍生操作简单复杂

去除干扰方法真空干燥

无－与二级胺反应

不反应反应反应反应

灵敏度pmolpmolfmolfmol重现性很好好好好Dansyl‐ClFMOC‐Cl简单简单戊烷萃取

归（principalcomponentregression，PCR）［９］是常用的线性数

２　化学计量学方法

化学计量学主要通过统计学或数学方法，将化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系。岑海燕等［６］的综述给予介绍化学计量学方法在近红外光谱分析中的应用，此处聚焦于该作者近红外氨基酸检测应用的方法。2畅1　预处理

为消除因仪器、样品导致的与样品分析无关的光谱噪音，需要对光谱进行预处理来消除噪音。褚小立等

［７］

学算法，在其基础上还有改良的多向偏最小二乘法（multi‐

人工神经网络（artificialneuralnetworks，ANN）［１０］属于

wayPartialleastsquaresmethod，MPLS），使用都较为广泛。

非线性校正算法，是由大量简单处理单元（神经元）广泛互连而成的非线性动力学系统。它不仅结构可变，还有自学习、自适应、巨量并行性、存储分布性的特点。

极限学习机法（extremelearningmachine，ELM）［１１］是从单隐含层前馈神经网络（singlehiddenlayerfeedforwardneu‐入层与隐含层的连接权值和隐含层神经元的阈值，只需要设置隐含层神经元的个数，便可以获得唯一的最优解。2畅3　近红外分析氨基酸技术的影响因素与模型传递

与传统分析手段破坏样品（样品粉碎、消解）、测量时间长（水分３～８h，蛋白质４～６h）、投资大（需多台精密分析仪器及大量高级分析人力）、日常消耗品多（试剂、水电等）及环境污染不同，近红外技术具有快速（１min内得到全部分析结果）、无污染（无化学试剂排放）、样品无损、实验重现性好（无人为误差）、精度较高（定标模型好时决定系数R２高）等优点。既可以检测游离氨基酸也可以检测结合态的氨基酸。但近红外光谱分析技术对小批量样品分析也并不适用。在氨基酸检测范围方面，近红外光谱分析技术也不能完全覆ralnetwork，SLFN）发展而来的一种新型算法。随机产生输

总结了

常用的光谱预处理法，如各种平滑（Smoothing）、一阶、二阶微分（Firstderivative、Secondderivative）、光谱矢量归一化（Vectornormalization）、最大最小归一化（Max‐Minnormali‐zation）和中心化法（Center）、标准归一化法（SNV）、多元散射校正（MSC）法等。2畅2定量校正

近红外光谱技术（NIRS）检测样品需要将光谱参数与样品中化学成分的真实含量建立起一定的关系———标准曲线即定标模块、定标曲线等。在建立定标曲线时，需要使用多种数学算法模型，并从中选择最适的一种进行定标。这些数学算法模型也称为多元校正技术。

偏最小二乘法（partialleastsquare，PLS）［８］和主成分回

第９期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　光谱学与光谱分析盖二十种标准氨基酸，覆盖的范围依据于样品预处理时溶液的性质和氨基酸自身的性质（多数取决于侧链）。另外，由于近红外技术是二次分析，如果其依据的化学值检测方法不能覆盖相应氨基酸，则近红外也不覆盖。

同其他仪器检测一样，近红外技术的准确性也受到样品、仪器及人为的影响［１２］。对于现有的近红外光谱技术，还没有达到可以直接转移模型的情况，往往是模型必须随仪器一同转移。这就使得测量同一物质，如水稻、普洱茶、鱼饲料等，在不同地方就要重新设定模型，增加了检测的时间与程序，其影响因素归纳见表２。

２３７９

谱预处理方法，比较MLR，PCR，PLS，MPLS四种定标模型后选用MPLS对大豆和豌豆中的甲硫氨酸Met、胱氨酸Cys、甲硫氨酸＋胱氨酸总含量Met＋Cys、赖氨酸Lys、苏氨酸Thr、色氨酸Trp、精氨酸Arg、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile和缬氨酸Val进行含量测定。其中大豆NIRS预测值与HPLC的化学检验方法比较，R２都在０畅８３以上，具有较优

的预测效果；豌豆中甲硫氨酸、胱氨酸和甲硫氨酸＋胱氨酸的交叉验证值１‐VR偏低，其余氨基酸预测效果较好。

Bao等［１７］选用可见和近红外光谱对除草剂胁迫下的大麦进行氨基酸总量测定，通过七种不同的光谱预处理方法和六种不同的校准方法比较，认为将征向量最小二乘支持向机Table2　Factorsofnear‐oninfraredinfluencetechnology

theaccuracy

测试样品样品组分相互影响各组分的同分异构体，不同基团相同吸收峰

样品物理状态样品颜色、颗粒大小、表面粗糙度与光滑程度

测试温度

环境与仪器温度，建立温度补偿

仪器自身噪声影响光谱收集波长影响光谱收集

电压

电压不稳造成基线漂移人为操作样品选择样品种类、数量差异

样品处理颗粒粉碎程度、样品水分涵含量

样品填装

填装的紧密程度

３　近红外技术在食品氨基酸检测中的应用

3畅1　农作物品质监测

陈国林等［１３］在对油菜籽饼粕氨基酸含量的分析中，天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸１５种氨基酸中，１３种氨基酸的R２大于０畅８０，其中七种氨基酸的R２大于０畅９０。缬氨酸的定标模型最差，缺少预测能力。

张斌等［１４］选用的MPLS法的全局定标和局部定标对精米粉光谱建立的方程预测标准误差低，均为０畅００７％，而外部验证决定系数则分别为８７畅１％和８７畅４％，完全可用于定量分析。对于稻米中所含的大部分氨基酸，Zhang等［１５］选用了２，８，８，１的数学处理和标准正态变量变换及去趋势算法（SNV＋D）的光谱校正方法来建立糙米粉氨基酸含量的近红外定标方程。以上方法在对大样品量扫描时获得天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸等１４种氨基酸不错的预测效果，且氨基酸总含量的定标模型也表现良好。但酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸则无法使用近红外技术进行含量测定。当样品量微小时，除赖氨酸外的其余１３种氨基酸的预测效果仍十分好Prevolnik等，其结果准确而可靠。

［１６］使用WinISI软件推荐的SNV＋D的光

（torLV‐LS‐SVM）（thelatentvariables‐least‐squares到０machine畅９３７，预测均方根误差）法的预测效果最佳RMSEP，原始光谱的相关系数‐support为０畅５３０。综上所述r值达vec‐，近红外光谱技术对大麦叶中氨基酸总量测定有非常好的预测准确度，同时，该实验结果也显示，近红外光谱技术在监测大麦在除草剂胁迫下不同生长阶段的生长状况十分有用。3畅2　茶叶中氨基酸含量

Center在普洱茶中游离氨基酸的检测中，李若诚等［１８］模型其预测均方根误差，SNV，MSC三种光谱预处理比较了RMSEP小于SNV，Center和预处理的MSC处理PLS，R２则大于后两者，即中心化法预处理效果最好。定标模型阶段RMSEC，李若诚等选用了在与按照国家标准小于PLS法，ELMR法———它的训练集均方根误差２大于PLS法。

GB／T８３１４‐２００２中规定的方法进行的普洱茶中游离氨基酸总量的化学检测值比较之后，李若诚等发现，ELM法定标得到的模型的训练集均方根误差为０畅１０３４，预测集均方根误差为０畅１１５４，均优于PLS法定标模型。

3畅3　饲料品质鉴定

近红外分析在饲料品质鉴定及生产监测中使用最为广泛，技术也比较成熟。

３畅３畅１Johames　鱼粉中氨基酸含量测定

等［１６］对比不同的光谱预处理方法处理２０４份样品，认为采用SNV＋D处理方法较好；他使用WINSI建立定标模型，发现化学检验结果与NIRS定标模块的预测值之间的决定系数R２都达到０畅９２以上，可见近红外技术确实可取得较好的预测准确度。

３畅３畅２　鱼粉中三聚氰胺定量测定

凯氏定氮法测定氨基酸含量时，不能区分有机物中的氮是来自氨基酸还是来自其他高含氮量（如三聚氰胺）物质，给不法商贩可乘之机。但是近红外分析却可以依据三聚氰胺与氨基酸的结构差异而较好地测定出与氨基酸混杂在一起的三聚氰胺。

三聚氰胺结构中含有的基团种类单一，仅为含氮杂环和—NH２，故它的标准品的吸收峰较少且峰尖。刘小莉等［１９］在利用近红外技术分析三聚氰胺标准品的光谱后得出以下结论：三聚氰胺标准品在６８１３cm－１有强烈的吸收峰，且浓度与吸光度具有相关性。因此，混杂三聚氰胺的鱼粉光谱与真鱼粉相比，在６８１３cm－１有明显差异。

２３８０光谱学与光谱分析　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷

RMSEP为０畅３８０mg?g－１，预测集的r为０畅９６２。

故当饲用鱼粉中掺入三聚氰胺量在０畅１％～１５畅０％时，６８７３～６５１４cm－１可作为定性鉴定饲用鱼粉是否掺杂三聚氰胺的特征谱峰。据此谱峰所建的模型能较准确判别鱼粉中是否掺有三聚氰胺，并较准确地预测含量。

3畅4　食品奶酪、火腿、肉制品中氨基酸及其他化学成分含

量的测定

Skeie等［２０］利用近红外技术测定Pr惫st和Norvegia奶酪中氨基酸的含量，并通过氨基酸含量的改变来预测判断奶酪的成熟程度。根据试验比较，选用MSC对光谱进行预处理，定标模型则是选用了PLS。两种奶酪中，Gly和His的外部验证系数r值均较低，Asp，Ser，Met，Thr，Glu，Val和总氨基酸含量的r值则都大于等于０畅９２，表明近红外技术对以上六种氨基酸含量在奶酪中的测定有较优的表现。

Johannes等［１６］采用SNV＋D和MPLS法对肉制品中的甲硫氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸＋胱氨酸总含量、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进行含量测定，NIRS的氨基酸预测值与化学值R２均大于０畅８７，显示出较好的预测效果。

Zhao等［２１］在对酱油中氨基酸态氮和氨基酸总量的测定中，选用了联合区间偏最小二乘法从全光谱中筛选有效光谱区域，而后用遗传算法在有效光谱区域中选择变量并在此基础上建立PLS模型。模型测定结果好，氨基酸态氮Rc＝０畅９９８８，Rp＝０畅９９８８；氨基酸总量Rc＝０畅９９１７，Rp＝０畅９９０２。由上可得，近红外光谱技术可应用于酱油中氨基酸态氮和氨基酸总量的快速测定，而遗传算法联合区间偏最小二乘法的结合也可提高近红外光谱的测定准确度。

同样，Liu等［２２］应用近红外光谱于榨菜中检测氨基酸态氮，SG（Savitzky‐Gday）平滑和移动窗口偏最小二乘法（mov‐ingwindowpartialleastsquare，MWPLS）结合进行波段选择，在（５８７４～４２５８cm－１）波段处得到高精度的预测结果，

４　总结与展望

２０世纪后期，随着化学计量学和计算机软硬件条件的发展，近红外光谱分析技术得以复兴，世界范围内出现了近红外光谱技术与硬件的发展热潮。

与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术只需对被测样品一次近红外光谱的采集，就可完成多项性能指标的测定，分析重现性好且成本很低，对于经常性的质量监控十分经济且快速。但近红外光谱分析也有其固有的缺点，首先它是一种间接测量手段，需要以湿化学法获取一定数量的样品化学值，因此测量精度永远不能达到参考的湿化学法的精度；其次，测试灵敏度比较低，组分含量一般应大于０畅１％；最后，建立方法之前必须先建立一个准确的校正模型，对于偶然做一两次的分析或分散性样品的分析不适用。

近红外光谱技术在氨基酸检测中的应用尚处于起步阶段，其发展首先基于近年来氨基酸高效液相色谱检测技术的广泛应用。选定要测定的氨基酸样品后，并不能马上直接套用已知的光谱预处理方法和定标模型；从检测原理上来说，因为同一种类不同样品之间存在差异，其检测的化学基团不同，最适的数学方法也不同，不同氨基酸亦是同理。从近红外技术准确性的影响因素来说，多种系统误差可能性的存在，目前还没有很好的方法可以解决模型传递的问题，这是制约近红外技术大范围推广使用的主要原因。

基于目前近红外光谱技术发展的现状，在线分析可以监测从原料到产品的整个反应变化过程，将是今后重要的发展方向之一。其次，围绕近红外分析模型的共享，以满足如粮食生产到收购，食品从生产到销售等领域中品质实时监控的需求，也将是重要的发展领域。

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ResearchProgressandApplicationProspectofNear‐InfraredSpectroscopyinAnalysisofFoodAminoAcid

YUCollegeXiao‐lan１，XU１畅ofAgriculture２畅CollegeofBiosystems３畅CollegeofPharmaceuticalAbstractgKnowledgerowthof　TocropsinvestigateandchemometricNetworkterialsmetricandmethodsincastedgreenanalysismaintopicstea，theiropmentthemainlyofapplication，detectingNIR’smaterialsrestrictsitsapplicationportantdirectiontoproductsforKeywords　Near‐infrared倡Correspondingauthor

２，３，HEYong２倡

&BiotechnologyEngineeringandScience，Zhejiangfoodtheprogressand，processingprocessinvolvedsummarizethedetectionapplicationsinrelevantintheoriginalapplicationoftheNIRqualityofinfeeddetectinginindeterminingfutureand‐scaleaminoacidsthuspromotion．

meetstheneedsspectroscopy；Amino，ZhejiangUniversityScience，ZhejiangUniversityofapplication．WithofnearofofchemicalonlinesearchingNIRvalue．Overviewusedtodeterminingthequalityofthecropsdetectionthecontentofaminocontentofreal．Onlineshould‐timemonitoringanalysisbeacid；Food，HangzhouUniversity，spectroscopyusingdatabasesaminohigh，methodsdeterminingacidsofinaminofoodcanonthefoodmonitor（３１００５８，China

，Hangzhou　３１００５８，China　３１００１４，China

（NIR）usedtoperformanceincludingISIacidsliquid（WebofKnowledgedetectchemicalinfoodvalue，meanwhilechromatographydetectionsummarizeandacidsthecontentanalyzedincheeseofwater，aminousingits，meritshamandandthedetectionfromentireproductionreaction，andtheandproblemtosaleschangeOct．４，２０１３；acceptedamino），CNKIacidsin（HPLC（ChinaacidsHPLCtheanddata）chemo，productsandpolyphenol．The．Wefore，andprocessofmodeldevelitwillfromtransferbeanrawJan．２０，２０１４）　‐‐‐

‐‐Ning　FoodTechnologyHangzhouinfraredthe）andanalyzemaliteraturetheofandmeatdrawbacksbasedHPLClargecurrentlyqualityimReceived　

近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用的研究进展

作者：作者单位：

於筱岚， 徐宁， 何勇， YU Xiao-lan， XU Ning， HE Yong

於筱岚,YU Xiao-lan(浙江大学农业与生物技术学院,浙江 杭州,310058)， 徐宁,XU Ning(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058; 浙江工业大学药学院，浙江 杭州310014)， 何勇,HE Yong(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州,310058)光谱学与光谱分析

Spectroscopy and Spectral Analysis2014(9)

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近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用的研究进展

作者：作者单位：

於筱岚， 徐宁， 何勇， YU Xiao-lan， XU Ning， HE Yong

於筱岚,YU Xiao-lan(浙江大学农业与生物技术学院,浙江 杭州,310058)， 徐宁,XU Ning(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058; 浙江工业大学药学院，浙江 杭州310014)， 何勇,HE Yong(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州,310058)光谱学与光谱分析

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引用本文格式：於筱岚.徐宁.何勇.YU Xiao-lan.XU Ning.HE Yong 近红外分析技术在食品氨基酸检测中应用的研究进展[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2014(9)

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