实验八 3 M3 机械搅拌通风发酵罐结构的认识

发酵实验（二）

实验八 3 M3 机械搅拌通风发酵罐结构的认识

机械搅拌通风发酵罐在制药、生物制品的生产开发中起着特别重要的作用。在众多类型的发酵设备中，兼具通气又带机械搅拌的标准式发酵罐用途最为普遍，广泛使用于抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂等领域，在生物制品工厂广泛使用。据不完全统计，占发酵罐总数的70%-80%，故又称通用式发酵罐。

一、实验目的 通过实地观察，了解机械搅拌式发酵罐的内部结构组成，各装置的配备安装及功能。

二、实验原理 机械搅拌式发酵罐主体包括罐身、搅拌器、轴封、消泡器、中间轴承，空气分布器、挡板、冷却装置、人孔等，配套装置：各工艺参数监测系统、空气除菌系统、蒸汽热力系统等。发酵罐主体各装置依据设计规范达到各自设置的作用。 三、实验设备 3M3 机械搅拌通风发酵罐. 四、实验方法与步骤

1. 打开人孔及内视灯观察以下各装置。 1.1罐体的材料、高径比、封头形式。 1.2搅拌器组数、叶轮类型。 1.3挡板的组数及安装。 1.4空气分布装置的形式。 1.5轴封的类型和结构。 1.6消泡装置类型和安装。 1.7冷却装置的类型。

1.8进料、进气、排料、出料、取样装置。 1.9加热、冷却装置。

1.10压力、温度、pH、溶氧控制接口。

2. 作出3 M3机械通风搅拌式生物反应器的结构示意图 3. 考察本设备配备的蒸汽系统组成。

4. 考察本设备所配备的空气除菌系统组成，并作出空气除菌流程示意图。 五、实验结果

1.作出3 M3机械通风搅拌式生物反应器的结构示意图，标注以上各装置名称。

五、思考题 1.小型和大型生物反应器设计上有什么不同点？2.本设备所选用的搅拌叶轮、机械消泡装置、冷却装置分别为何种形？除此之外分别还有哪些类型？3.本设备配备的蒸汽系统蒸汽生产量多大？4.本设备所配备的空气除菌系统为几级？分别采用何种过滤器？

实验九 3 M3 机械搅拌通风发酵罐的操作

发酵车间实地训练是培养技能型人才，增强工程意识的必要途径。通过中试发酵设备全方位的直接操作真正提高学生的适应能力和实战技能。

一、实验目的 1.通过发酵中试车间实训，体验上罐操作的全过程。2.熟悉车间管路布置及各设备性能。3.掌握空气过滤系统操作、冷却系统操作、工艺参数控制。4.加深对分批培养的基本原理及过程的理解。

二、实验原理 微生物技术产品从实验室到工业生产的开发过程中，需要进行小试、中试、生产逐级放大培养，中试培养已经近似于生产发酵。其工艺环节包括：空消、实消、空气除菌、接种、移钟、消泡、进料、取样、出料等； 三、实验设备与材料 1M3 机械搅拌通风发酵罐。 四、实验操作步骤 1 .灭菌：

（1）灭菌之前，通常将与罐相连的空气过滤器用蒸汽灭菌，并用空 气吹干。 （2）先将输料管路的污水放掉冲净。

（3）然后将配好的培养基泵送到发酵罐（及种子罐或料罐），将各排气阀打开。

（4）灭菌前将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80—90℃时，将排气阀逐渐关小。 （5）将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中，使罐温上升 到118—120 ℃，开动

搅拌开始灭菌，维持罐压0.1Mpa（表压），并保持30min左右。

（6）各路进气要畅通，防止短路逆流；各路排气也要畅通，但排气 量不宜过大，以节约用

气量。

（7）保温:凡进口在培养液以下的各管道都应进气；凡开口在培养液以上者均应排汽。不断

地排除管路及罐内的蒸汽冷凝水。

（8）保压:灭菌结束后，先关闭所有的排汽阀，后关蒸汽进口阀， 待罐内压力低于无菌空

气压力后，向罐内通入无菌空气，以防止物料倒流至过滤器，后果严重。 （9）降温:在夹套或蛇管中通入冷却水降温，直至降到发酵温度。

3.操作条件的设定：在无菌条件下连接好酸、碱消泡剂等流入管线。设定好通风量（一般为0.5～2L/min.L）、温度和pH值。

4.. 接种、培养：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火后打开接种口，加入无菌水，调节好罐内培养液量（必要时应加入葡萄糖、磷酸盐等溶液），进而将种子培养液注入。接种 量一般为1%～10%，盖好接种口后，调节搅拌转数至所需值，培养开始。

5. 取样：为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上一次取样时残留在取样管中的培养液去除后在取样。另外，取样后应通入加热蒸汽，以防取样管路污染杂菌。

6.. 培养结束：将电极与培养液 全部取出，培养液在121 ℃下杀菌15 min后，排出到指定地点。罐内应冲洗干净。

五．思考题 1.发酵罐的放大有哪些方法？国内常用的方法有哪些？

实验十 面包酵母流加培养与分批培养试验

流加培养又称补料分批培养，是在分批培养的过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。其优点可使发酵系统中维持很低的限制性底物浓度，减少底物的抑制或其分解代

谢物的阻遏作用，避免出现限制性底物浓度过高影响菌体得率和代谢产物生成速率的现象。本实验通过面包酵母流加培养与分批培养的结果加以验证。

一、实验目的 1. 以斜面菌种活化为起始，经实验室菌种扩大、车间菌种扩大至发酵罐培养，熟悉发酵培养的全过程；2. 对比分批培养与流加培养面包酵母菌生长过程及菌体得率；3. 巩固灭菌、空气过滤、冷却、发酵罐工艺参数控制等操作过程；4. 加深补料分批续培养的基本原理的理解，熟悉流加补料过程的控制方法；5. 熟悉菌体离心分离及真空干燥过程的操作。

二、实验原理 面包酵母在通风供氧充足的前提下，培养基中葡萄糖为限制性基质，葡萄糖的浓度对于提高酵母得率是至关重要的。本实验面包酵母培养的目的是获得最大酵母浓度，因此采用葡萄糖流加培养，并比较同样条件下分批培养的效果。 三、菌种与培养基 1. 菌种：面包酵母 2. 培养基 斜面培养基： (1)

黄豆芽 10g 葡萄糖 5g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH 。

称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100 ml水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。

配制时，按每100 ml10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2 g琼脂，继续加热融化，补足失水。 (2)

马铃薯 20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然pH

20％马铃薯浸汁 取马铃薯200g，切成小块，加水1000ml。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。

液体发酵培养基：葡萄糖3%，酵母膏1.%，KH2PO4 0.5%，pH5.5。 四、实验设备与材料

1.30L、300L 种子罐；3M3全自动发酵罐； 2.摇床； 3.超净工作台； 4.离心机； 5.显微镜； 6.分光光度计 7.灭菌锅 8.培养箱 9.真空干燥箱

10.试管，棉塞， 500ml三角瓶，5L三角瓶，分口膜。 五、实验方法与步骤 1. 分批培养 1.1总流程

斜面培养（斜面培养基配制、灭菌，接种，培养） → 摇瓶种子培养 → 种子罐培养（糖化液稀释至l0%浓度，添加辅料，灭菌，接种。）→ 发酵罐培养 →菌体分离。

1.2 斜面种子制备 自保藏斜面中挑取一环酵母菌体接入新鲜的斜面试管中，于28℃培养箱中培养24h。

1.3 摇瓶种子的制备 将上述培养好的斜面种子接入250ml三角瓶装150ml摇瓶种子培养基中，在28℃，200rpm震荡培养15-20h。

1.4 种子罐培养 于30L发酵罐装入20L发酵培养基，121℃灭菌20min，冷却至30℃，将培养好的摇瓶种子接入发酵罐（接种量2-3%）进行发酵。培养条件为：温度28℃，搅拌转速200rpm，通风量1vvm。

1.5发酵罐培养 按实验八中步骤，进行空罐灭菌（包括空气过滤器灭菌）、实罐灭菌操作。消泡剂灭菌。将种子罐中的酵母菌种压送至发酵罐，通气量在3—5 L/min，搅拌转数200rpm，接种量10％。发酵条件1.4同种子罐培养。

1.6 过程监控 0小时：取样测定总糖和还原糖； 4-24小时：每隔4小时取样镜检、测定还原糖、菌体浓度。 2. 流加培养

2.1 种子制备 同分批培养种子制备过程。

2.2 流加培养前的准备工作 葡萄糖于流加储罐灭菌。

2.3流加培养 通气量3—5 L/min，搅拌转数200 rpm，接种量10％。控制流加储罐压力使达到流加25g/100mL葡萄糖，当发酵罐内葡萄糖浓度达到20—30g/L，滴加0.1 mol/L氨液，控制培养液pH值为5.0。通过调节风量和搅拌转数控制溶氧浓度在10％左右。 2.4过程监控 同1.6步骤。

3. 菌体离心分离 将分批培养与流加培养发酵液用布袋初步过滤，放入离心机，转速1000r/min，10min.。 4. 菌体干燥

4.1 将离心分离后的菌体置于不锈钢托盘放入真空干燥箱，将箱门关上，并关闭放气阀，开启真空阀，再开启真空泵电源开始抽气，使箱内达到所需真空度，关闭真空阀，再关闭真空泵电源开关。

4.2 把真空干燥箱电源开关拨至“I”处，设定温度60℃，箱内温度开始上升，当箱内温度接近设定温度时，加热指示灯突亮突熄，反复多次，一般120min以内搁板层面进入恒温状态。 4.3 当所需工作温度较底时，可采用二次设定方式，如所需工作温度60℃，第一次可以设定50℃，等温度过冲开始回落后，再第二次设定60℃，这样可降低甚至杜绝温度过冲现象，尽快进入恒温状态。（注意：智能型仪表请参照操作方法）

4.4干燥时间12h.当干燥时间较长，真空度下降，需再次抽气恢复真空度，应先开启真空泵电机开关，再开启真空阀。

4.5干燥结束后，先关闭电源，旋动放气阀，解除箱内真空状态，再打开箱门取出物品。（解除真空后，因密封圈与箱门吸紧变形不易立即打开箱门，经过一段时间后，等密封圈恢复原形后，才能方便开启箱门。）

5. 称重 干燥结束后取出菌体，计算菌体总得率。 六、分析方法

1. 菌体量(X) 生物量的测定

生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。比浊法。以空白培养基为对照，在550 nm处测定发酵液的吸光值。酵母浓度测定(湿重法)：吸取5ml菌液，2500rpm离心5min，去上清液，称量菌体湿重。

2. 还原糖的测定 斐林试剂法

3. 发酵活力的测定(选做)：称取0.26g鲜酵母，加5g在30℃下恒稳1h的面粉制成面团。置于30℃水中．测定面团从水底浮出的时间。浮起时间在15min内认为样品合格。 4. 分析决定初始体积V0，比生长速率μ及菌体浓度X的测量，补料速度F与补料浓度SF的计算与控制。

七、实验结果 1. 分别画出分批培养与流加培养过程中培养液中葡萄糖(g/L)、酵母菌体量(g/L))随流加培养时间的变化曲线；2. 分别计算酵母产率(质量分数，葡萄糖)。

八、讨论 1. 流加培养与分批培养菌体浓度的区别何在及原理分析；2.推导理想状况下准稳态恒速流加与与时间参数的方程。

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