纤维素降解菌研究概况及发展趋势

纤维素降解菌研究概况及发展趋势

赵斌

（山东农业大学 生命科学学院 2010级生物工程三班）

摘 要

纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，因为难分解大部分未被人类利用。另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一。分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径。筛选高效纤维素分解菌，确定其酶学性质是降解纤维素的关键。 关键词：微生物；纤维素；降解；纤维素酶

Abstract

Cellulose is the earth's most abundant renewable organic resources, because the

majority is not difficult to break down human use. In addition, the cellulose is one of the main sources of the papermaking wastewater COD and SS. Into the animal's susceptibility to absorption or utilization of energy, food, feed or chemical raw materials decompose cellulose and cellulose reasonable application. Screening cellulolytic to determine the nature of its enzymatic degradation of cellulose. 纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的碳水化合物，同时也是地球上最大的可再生资源，占地球生物量的约50%[1]。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿吨, 工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物, 但都没有得到充分利用,相当大的一部分被废弃、焚烧, 不仅严重污染环境，同时也浪费了可利用的有用资源和能源。另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一，造纸废水中含有大量的纤维素，造纸黑液难以处理，严重污染水环境[2]。

因此有效的开发利用纤维素资源已是目前的一个研究热点，分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径[1]。目前纤维素降解主要是酸解、酶解和微生物降解，无论是酶解还是微生物降解都离不开高效纤维素降解菌株。微生物对纤维素的降解与转化不仅是自然界中碳素转化的主要环节，也是土壤微生物能量代谢的主要来源。纤维素的分解主要依靠微生物产生的胞外酶完成，纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称[3]。

一、纤维素降解菌的研究现状

1.1纤维素的结构及微生物降解过程

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纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物总重量的一半，是自然界最丰富的有机化合物。纤维素绝大多数由绿色植物通过光合作用合成，是植物体内结构多糖，植物的枝叶和秸杆等都含有大量的纤维素。纤维素是葡萄糖以β-1, 4糖苷键结合形成的高分子化合物，包括葡萄糖单位2000~10000个[2]。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。与淀粉一样，纤维素也由葡萄糖单元聚合而成。两者的区别在于淀粉以?-糖苷键连接，而纤维素则以β-糖苷键连接。此外，纤维素分子比淀粉大，更难溶于水。纤维素不能直接透过细胞质膜，只有在微生物合成的纤维素酶作用下，水解成单糖后，才能被吸收至细胞内利用。纤维素酶有细胞表面酶和胞外酶两种。细菌纤维素酶一般为细胞表面酶，位于细胞膜上，分解纤维素时，细菌必须附着在纤维素表面。真菌和放线菌的纤维素酶为胞外酶，它们可以在胞外环境中起作用，菌体无需直接与纤维素表面接触。根据对真菌的研究，纤维素酶是多种作用于纤维素的酶的总称，它包括如下三种酶：

①C1酶（内-β-葡聚糖酶）：此酶主要水解纤维素分子内的β-糖苷键，产生带有自由末端的长链片段。一种微生物能分泌一种以上的C1同功酶。 ②CX酶（外-β-葡聚糖酶）：此酶作用于纤维素分子的末端，产生纤维二糖。与C1酶一样，一种微生物也能分泌出多种结构不同而功能相同的CX酶。 ③β-葡萄糖苷酶：此酶能将纤维二糖、纤维三糖及低分子量的寡糖水解成葡萄糖。

1.2 纤维素酶高产菌选育研究的发展概况

1906年，Seilliere在蜗牛消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。1912年，Kellerma等首次从土壤中分离出纤维素分解菌，此后，能降解纤维素和能产生纤维素酶的各种微生物被陆续分离鉴定。1933年，Grassman等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出2个组分。20世纪40-50年代，人们对产纤维素酶的微生物进行了大量的分离筛选工作，建立起较为完整的分离筛选方法[5]。20世纪60年代后期，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化工作，加快了纤维素酶的组分、作用方式及诱导作用等方面的研究进展，实现了纤维素酶制剂的工业生产，并在应用上取得了一定成绩。20世纪70年代，提出纤维素酶的三种组分的协同作用机理并提取了这种协同作用的3种酶[6]。1985年，采用腐殖根霉发酵方法，制得了世界上第一个洗涤剂用的纤维素酶。1987年，又推出了一种细菌纤维素酶，并成功地用于At-tack洗衣粉。1997年，美国和韩国科学家研究了里氏木霉及温度突变株所产生纤维素酶的最佳条件，并指出多种酶的协同作用比单独的纤维素酶作用提高了葡萄糖的产率。1998年，瑞典和加拿大科学家用从里氏木霉中提取的纤维二糖水解酶和内葡聚糖纤维素酶对微晶纤维素的水解试验表明，

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复合酶作用所产生的可溶性糖比2种酶单独作用时产糖的总和还要多。

我国纤维素酶的研究开始于于20世纪60年代初，并且选育出一批纤维素酶菌种。1968年北京选育出一批纤维素酶菌种。1970年，中国科学院上海植物生理研究所等单位利用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株，并进行了生产试验。1975年，广东省微生物研究所分离筛选出纤维素酶产生菌株——长梗木霉。20世纪90年代，中国科学院微生物研究所获得一株突变株康宁木霉CP88329。20世纪80年代中期，我国上海市生产出纤维素酶。20世纪90年代初，黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产2千吨纤维素酶生产线投产，我国成为继美国、日本、丹麦之后第4个能生产纤维素酶的国家。目前，纤维素酶已广泛应用于工业生产，获得了可观的经济效益。

菌株选育是纤维素酶生产的基础性工作，国内外进行了大量研究，取得了很大的进展。如王景林等(1996)在吸收前人经验的基础上先后对绿色木霉-10、绿色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉AA-15A采用紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器、亚硝基胍等方法诱变获得了能用于工厂化生产且性能稳定的高产菌株NT15-H[4]。张菩花等(1998)采用康氏木霉W-925，J-931，经浓度为2%硫酸二乙醋和紫外线（15W，30cm，2min）反复诱变后得到了高产的Wu-932菌株，该菌株CMC（羧甲基纤维素）糖化力和滤纸糖酶活性与康氏木霉W-925相比，分别提高了100%和81%。汪履绥等以黑曲霉C10菌株为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍、60Co-γ射线和硫酸二乙醋等物理化学诱变处理，最后得到一株突变株C66，与野生菌株相比，该突变株纤维素酶产量提高了2倍[8]。还有张继泉、王瑞明等对里氏木霉采用亚硝酸和紫外线诱变，选育出了一些高产纤维素酶的优良菌株。

纤维素酶基因克隆的研究起始于20世纪70年代末，发展非常迅速。纤维素酶基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制，以及了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素分解菌开辟了新途径。国内外在这方面展开了大量的研究，取得了许多成果。目前纤维素酶基因克隆研究主要集中在真菌所产的酸性纤维素酶方面，其中对里氏木霉基因研究比较深人。纤维素酶基因的克隆及其表达调控，将有效促进纤维素酶的工业化生产。

二、纤维素酶高产菌选育研究的未来发展趋势

2.1选育高活力优良菌株

目前所选育出来的一些菌种虽具有一定的产酶能力，但是应用于生产还不是很理想，有待进一步选育出更多高活力优良菌株。虽然我们在纤维素酶高产菌的选育方面虽然已具备了一些方法，但是这些方法的局限性就要求我们在今后对其进一步改进，探索更理想的方法去不断选育(包括诱变)纤维索酶高产菌株。选育出优良菌种是提高纤维素酶活力的关键问题。目前纤维素酶的比活力一般都较

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低，因而产酶成本高。据估什，纤维素水解成葡萄糖所需要的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白多100倍，这是影响纤维素酶实际应用重要原因之一，因此筛选纤维素酶比活力高的菌株无疑具有重要意义。

2.2选育多功能高效纤维素酶产生菌

近年来，随着纤维素酶在洗涤剂工业、棉织品水洗抛光整理和制浆造纸等行业上的应用和发展，使得由细菌产生的中性和碱性纤维素酶得到广泛重视，碱性纤维素酶成为世界各国普遍重视的一种极具生命力的新型酶制剂。尤其是一些细菌产生的胞外碱性纤维素酶拥有简化发酵工艺，节约资源的优势，正逐步显示出它良好的使用性能和巨大的工业价值。细菌纤维素酶制剂成为研究热点。其产生菌主要集中在芽孢杆菌属。芽孢杆菌由于芽孢的形成，在耐酸、耐碱、耐高温方面可能有明显的优势。由于耐热细菌可生长于高温环境，培养过程中不易受常温微生物的污染等优点，产生的纤维素酶具有较好的热稳定性，提高反应温度可加快降解速度，因此耐热纤维素酶在实际工业酶领域具有较广泛的用途，在高温领域具有广泛的应用前景。

2.3新型海洋低温酶的研究

迄今为止，对常温和高温纤维素酶的研究较多，涉及低温纤维素酶的研究工作相对较少。应用低温酶，不但可以保证低温条件下的高效酶反应，而且在生产工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活，节约能量与费用，降低生产成本。海洋环境十分独特，分布着数量极其庞大，种类繁多的低温微生物，而且海洋微生物酶具有耐碱、耐盐、耐冷等特性，有着不同于陆源微生物酶的独特应用前景，因而从海洋生物开发低温纤维素酶有利于获得新的低温纤维索酶及其产生菌。

2.4混合发酵生产高活力纤维素酶

目前世界上所选育出来的优良纤维素分解菌几乎都是木霉属菌株，而木霉菌普遍缺乏一种限制因子—β-葡萄糖苷酶，这可以使纤维二糖积聚，从而反馈抑制酶活，降低酶解效率，这一直是阻碍其大规模生产应用的瓶颈问题。应用最广的纤维素酶生产菌—里氏木霉的优良突变株，也存在以上问题。多菌种共生混合发酵相对单菌种发酵有很多优势：提高产酶效率和微生物生长速度；可利用营养成份比较单一的廉价的农副产品；并且可防止发酵污染；主要优点是使不同菌株各自产生的纤维素酶系的组分之间达到互补的效果，使酶系更加全面，三种酶组分比例更加协调，从而更好地发挥协同降解作用，大幅提高纤维素酶酶活和产量，生产出酶系全面、比例协调的高活力纤维素酶。现有关混合菌培养降解纤维素以及它们之间相互作用机理报道较少。选育出大量纤维素酶系组分之间互补的高产菌株，利用混合发酵生产高活力纤维素酶具有十分光明的发展前景。

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2.5开发研究瘤胃真菌高产基因

瘤胃真菌是栖息在瘤胃中的、能够分泌高效纤维素酶的严格厌氧真菌。迄今为止，人们发现瘤胃真菌可分泌包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、半乳糖醛酸酶等13种酶可降解纤维素、半纤维素等物质的酶，因此能高效率降解纤维素。瘤胃微生物不仅产生一系列的酶，而且某些酶，特别是瘤胃真菌产生的酶比现有的酶制剂具有更高的活性。大量研究表明，瘤胃真菌能产生酶活性最高的超级酶。据报道，有机垃圾作为污染环境的重要物质之一，其难以分解的成分主要是纤维素、木质素(纤维素是第一位世界上最丰富的有机物，木质素是世界上第二位最丰富的有机物)，能够产生高效率纤维素酶的瘤胃真菌将成为处理该问题的主要力量，而且瘤胃微生物分泌的纤维素酶对处理家庭垃圾、城市垃圾以及造纸污泥等具有很好的效果。

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