Southern Blotting技术总结

Southern Blotting技术总结

Southern Blotting溶液的配制： ※、变性缓冲液

1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液

1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L

3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:

0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS ※、Washing Buffer:

0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5） ※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；

※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm

离心

Anti-Digoxigenin-AP (vial 4) 5min，小心从表面吸取所需剂量，用1×Blocking Solution按1:5000 稀释Anti-Digoxigenin-AP，2-8℃可稳定保存12h.

※、NBT/BCIP 用前37℃水浴溶解。

一、基因组DNA的制备 要点：

1、DNA纯度要高，最好有除去多聚糖的纯化步骤，如醋酸铵等。 2、DNA 完整性好； 3、酶切体积要大：

反应体积1ml，可分2个0.5ml离心管进行，每个离心管的DNA量至少25μg（尽量少留空气，防止蒸发，盐浓度增加）；

4、两管的DNA量30—40μg，最高50μg；

5、内切酶用量：按照说明加入内切酶，消化期间颠倒混匀，可于反应中间再加1-2μl酶量（总体积的1/10），消化时间：12小时左右。最后的1-2小时加RNase酶。

二、探针制备（试剂盒） 1、标记原理

Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下，经基因特异的引物PCR 指数扩增，可掺入到新合成的DNA 分子中，从而完成DNA 探针的标记。在延伸反应中，每20~25 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链9中。

2、操作步骤 （1）、PCR扩增

目的基因序列PCR扩增 （2）、PCR扩增产物的纯化与回收

胶回收，分光光度计测浓度和OD值纯度（定量） （3）、探针标记（随机引物法）

①取回收纯化的目的基因扩增产物（待标探针）1μg(1μl)，加无菌蒸馏水

定容至16μl。

②变性：水浴锅中煮沸（100度）10min，快速置冰上5 min；

③混匀PIG-High Prime（Vial 1），取4μl到变性DNA，混匀并稍离心。37°C反应20 h。

④加2μl 0.2 M EDTA(pH 8.0)终止反应（65°C，10min），-20°C保存备用。

三、DNA（gDNA）酶切产物回收纯化 1、将酶解产物装入2ml离心管中；

2、加入1ml酚：氯仿：异戊醇去蛋白，比例25:24:1（可以现买，去最下层）；离心1200rmp，室温，10min，留下上清液。

3、加入等体积异丙醇（-20度保存），1/10总体积NaAC（3mol/L）沉淀DNA，12000rmp，室温，20min;

（NaAC：在400mL双蒸水溶解123.045g无水乙酸钠，用冰乙酸挑PH5.2或用稀乙酸调PH7，加水定容至500mL，再高压灭菌，待用）

4、75%酒精1ml洗管2—3次，悬浮DNA；

5、转到一个新的2mL的离心管中，待吹干酒精后再加50 μl ddH2O溶解沉淀。测浓度！

四 凝胶处理

1、制备100ml 0.85%琼脂糖胶，胶板尾垫2层纸（加样孔增厚，加入80 ml，放8孔梳子）；

2、将回收酶切DNA 50μl分两份，加6×loading Buffer，每份加5μl； 3、梳子和电泳槽使用前用0.5-1.0 M NaOH处理30-60min，去EB； 4、每个泳道DNA上样30μl（至少20μg），每份样品分两孔。样多时，一半胶加样，另一半做重复，Marker加中间（最好每半块胶有一个

Marker/15000+2000），用于EB染色检测，阳性对照可用质粒（PCR目的片段等），阴性可用转基因受体品种。

5、按1V/cm电压在琼脂糖（TBE电解液）上进行小伏电泳过夜，待溴酚兰跑至胶4/5处（不能过头），切胶，一半胶EB染色检查，拍照，看条带是否跑出边界。另一半用于杂交。将用于杂交的半块胶放入0.25M HCl中置15min，直至蓝色变为浅黄色（目的片段较大时，在用这一步）。无菌/去离子水冲洗3次（洗胶容器“培养皿”预先用1M NaOH 处理30分钟）；

△ 加入变性液浸没凝胶，定温（22~25℃）轻摇15min（双链变单链），再加入变性液，轻摇15min。无菌/去离子水冲洗三次。

△ 加入中和液，定温轻摇20min，更换中和液，摇20分钟，无菌/去离子水冲洗2~3次；

△ 加入20×SSC室温轻摇10~20分钟，预渗透凝胶（20×SSC转移中到小分子量；10×SSC转中至大分子量）。 五、制桥与转膜

（带无粉手套，用于20×SSC转移槽，预先用1M NaOH浸泡）

① 剪3层Whatman 3 mm滤纸（长可垂及槽底，宽应比吸光度长0.5cm）; ② 用20×SSC浸透，用1M NaOH处理过的玻棒滚动赶走气泡； ③ 在滤纸上加足20×SSC，同时从一边慢慢孔朝下沿与滤纸垂直方向放置凝胶，胶与滤纸边各留0.5cm；

④ 剪宽2cm左右Parafilm，手勿接触，干净面盖胶四周，加样孔可全遮盖，其它边不得遮盖样品。

⑤ 剪与胶大小一样的尼龙膜，去角作标记，沿胶一边向另一边慢慢放尼龙膜

（注意，①不能有气泡，如有，玻棒赶尽；②不能移动）。

⑥ 将2张与膜大小相同的Whatman 3 mm滤纸置20×SSC中湿润，盖在

膜上，排除气泡。

⑦ 滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（8~10cm），吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板，上压0.5kg左右重物（此250g），可用瓶装适量水调整，先轻（200g）后重，过夜。吸水纸可更换。 六、探针标记效果测定

①按下表，分别稀释标记DIG的对照DNA标准（vial 2）和DIG标记的探针。 首先把标准DNA和标记探针稀释到1ng/ul。

管号DNA（ul） 吸取管 （1.5ml） DNA稀释稀释比 buffer（vial 3, ul） 198 35 45 45 45 45 45 50 1：100 1：3.3 1：10 1：10 1：10 1：10 1：10 终浓度 管1 管2 管3 管4 管5 管6 管7 管8 管9 2ul 15 5 5 5 5 5 0 母液 管1（母液） 管2 管2 管3 管4 管5 管6 1ng/ul 10 pg/ul 3 pg/ul 1 pg/ul 0.3 pg/ul 0.1 pg/ul 0.03 pg/ul 0.01 pg/ul 0 ②将两种稀释液混匀后按顺序在尼龙膜上点样（戴手套）

尼龙膜长6cm左右，可在中间用铅笔轻点标记，吸1ul 管2--管9混合液，DNA标准与探针对应点好。稍干后放两张干净滤纸间，120℃烘干30min，放以干净自封袋中，4℃可长期保存。

③将点探针尼龙膜放一尺寸合适的塑料袋中（自封，勿太大），先加20 ml Maleic Acid Buffer，15~25℃轻摇2~5min；

④加入10ml Blocking solution（吸1ml vial 6+ 9ml Maleic Acid Buffer）（vial 6要提前溶解）, 室温轻摇30min, 倒掉；

⑤加入10 ml（本试验20 ml ）Antibody Solution（用1×blocking Solution，按10ml：2ul vial 4配制），室温轻摇30min, 倒掉；（vial 4用前4℃ 10000rp离心5min，从表面吸）；

⑥用10 ml （本试验20 ml）Washing buffer洗膜15min，2次。 ⑦在10 ml（本次20 ml）Detection buffer平衡2-5min。

⑧ 暗配置2ml显色液（Color substrate solution，40 ul NBT/BCIP （vial 5）+2ml Detection buffer）（可多配制10-15ml）。（本次15ml，300 ul NBT+15ml Detection buffer）。

⑨ 倒样⑦中溶液，加入⑧中显色液，赶尽气泡，暗处室温放置，隔30min观察一次，用相机拍照。根据样品与对照同时出现的点，估算标记探针与标准对照的对应浓度，比较效率与对照的百分比。如：

标准对照 标记探针 10 pg/ul 10 pg/ul 同时出现 3 1 0.3 0.1 0.03 3 1 0.3 0.2 0.0 则标记探针是标准对照的1/3。 七、膜固定与预杂交

① 将转DNA膜用镊子（NaOH处理）去除上层滤纸，在膜加样孔处做标记（测距离）；（所用的胶要EB染色，以确定是否转膜成功）

② 在2×SSC中慢慢放入再拿出，（在边角点阳性对照如质标），小心放入两层滤纸中120℃烘30min；

③ 预热DIG Easy Hyb granules（vial 7）至42℃，取15 ml加入放膜自

封袋中，42℃轻摇预杂交50 min。

④ 探针变性：100℃加热DIG标记探针5min，迅速放冰上。

⑤ 预热（42℃）DIG easy Hyb granules（vial 7）, 加20ml于一新自封袋中，用镊子转膜，加入15ul变性DIG标记探针，混匀，赶尽气泡。）

⑥ 42℃轻摇温育过夜。

八、洗膜（操作过程，转膜要迅速） 1、洗膜（样品面向上）

A：2×SSC+0.1%SDS室温（15-25℃）轻摇洗膜5min，2次； B：0.5×SSC+0.1%SDS 65℃轻摇洗膜15min，洗1次；

C：（G+C含量>40%，探针100%配对）0.3×SSC+0.1%SDS轻摇洗膜（68℃）洗1次15 min；（强洗，降低背景，可再降SSC浓度，但要小心；Antibody是通用的，一是和DIG结合，另一方面带有酶，可发生显色反应）。

九、免疫测定（室温）

①用Washing Buffer (100-200 ml),洗1-5min (膜迅速转入，轻摇)； ②在100 ml Blocking solution中轻摇，室温保育1小时（可延长至2小时，降低背景）；

③在100 ml Antibody solution ,轻摇室温保育1小时（可延长，多结合）； ④用100 ml Washing Buffer轻摇，洗2次各15min； ⑤在60 ml Detection Buffer中平衡2-5min；

⑥配制60 ml Color substrate solution (1.2ml NBT/BCIP+58.8ml Detection Buffer,在超净台上，避光配制)；

⑦倒掉⑤中溶液，加入⑥，赶气泡封口，暗处静止放置，过夜。隔60分钟观察一次，相机拍照，尽量减少震动；

⑧终止反应，50mlddH2O或TE Buffer 洗5min。

(如重复利用此膜，用二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）洗膜，50-60℃，放1小时，直至蓝色消失；ddH2O洗1min，再用stripping Buffer (0.2 M NaOH + 0.1%SDS)洗20min，2次；再用2×SSC洗5min)。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/22d7.html