Southern Blotting技术总结
更新时间:2024-05-21 03:09:01 阅读量: 综合文库 文档下载
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Southern Blotting技术总结
Southern Blotting溶液的配制: ※、变性缓冲液
1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液
1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L
3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:
0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制: 2×SSC,0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制: 0.5×SSC,0.1%SDS ※、Washing Buffer:
0.1 M Maleic Acid,0.15 M NaCl(pH7.5),0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer:0.1M Maleic Acid,0.15 M NaCl(pH7.5) ※、1×Blocking Solution:10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍(现配现用);
※、Antibody solution:每次使用前,4℃,10000rpm
离心
Anti-Digoxigenin-AP (vial 4) 5min,小心从表面吸取所需剂量,用1×Blocking Solution按1:5000 稀释Anti-Digoxigenin-AP,2-8℃可稳定保存12h.
※、NBT/BCIP 用前37℃水浴溶解。
一、基因组DNA的制备 要点:
1、DNA纯度要高,最好有除去多聚糖的纯化步骤,如醋酸铵等。 2、DNA 完整性好; 3、酶切体积要大:
反应体积1ml,可分2个0.5ml离心管进行,每个离心管的DNA量至少25μg(尽量少留空气,防止蒸发,盐浓度增加);
4、两管的DNA量30—40μg,最高50μg;
5、内切酶用量:按照说明加入内切酶,消化期间颠倒混匀,可于反应中间再加1-2μl酶量(总体积的1/10),消化时间:12小时左右。最后的1-2小时加RNase酶。
二、探针制备(试剂盒) 1、标记原理
Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下,经基因特异的引物PCR 指数扩增,可掺入到新合成的DNA 分子中,从而完成DNA 探针的标记。在延伸反应中,每20~25 个核苷可有一个Dig-dUTP 分子掺入到新合成的DNA 链9中。
2、操作步骤 (1)、PCR扩增
目的基因序列PCR扩增 (2)、PCR扩增产物的纯化与回收
胶回收,分光光度计测浓度和OD值纯度(定量) (3)、探针标记(随机引物法)
①取回收纯化的目的基因扩增产物(待标探针)1μg(1μl),加无菌蒸馏水
定容至16μl。
②变性:水浴锅中煮沸(100度)10min,快速置冰上5 min;
③混匀PIG-High Prime(Vial 1),取4μl到变性DNA,混匀并稍离心。37°C反应20 h。
④加2μl 0.2 M EDTA(pH 8.0)终止反应(65°C,10min),-20°C保存备用。
三、DNA(gDNA)酶切产物回收纯化 1、将酶解产物装入2ml离心管中;
2、加入1ml酚:氯仿:异戊醇去蛋白,比例25:24:1(可以现买,去最下层);离心1200rmp,室温,10min,留下上清液。
3、加入等体积异丙醇(-20度保存),1/10总体积NaAC(3mol/L)沉淀DNA,12000rmp,室温,20min;
(NaAC:在400mL双蒸水溶解123.045g无水乙酸钠,用冰乙酸挑PH5.2或用稀乙酸调PH7,加水定容至500mL,再高压灭菌,待用)
4、75%酒精1ml洗管2—3次,悬浮DNA;
5、转到一个新的2mL的离心管中,待吹干酒精后再加50 μl ddH2O溶解沉淀。测浓度!
四 凝胶处理
1、制备100ml 0.85%琼脂糖胶,胶板尾垫2层纸(加样孔增厚,加入80 ml,放8孔梳子);
2、将回收酶切DNA 50μl分两份,加6×loading Buffer,每份加5μl; 3、梳子和电泳槽使用前用0.5-1.0 M NaOH处理30-60min,去EB; 4、每个泳道DNA上样30μl(至少20μg),每份样品分两孔。样多时,一半胶加样,另一半做重复,Marker加中间(最好每半块胶有一个
Marker/15000+2000),用于EB染色检测,阳性对照可用质粒(PCR目的片段等),阴性可用转基因受体品种。
5、按1V/cm电压在琼脂糖(TBE电解液)上进行小伏电泳过夜,待溴酚兰跑至胶4/5处(不能过头),切胶,一半胶EB染色检查,拍照,看条带是否跑出边界。另一半用于杂交。将用于杂交的半块胶放入0.25M HCl中置15min,直至蓝色变为浅黄色(目的片段较大时,在用这一步)。无菌/去离子水冲洗3次(洗胶容器“培养皿”预先用1M NaOH 处理30分钟);
△ 加入变性液浸没凝胶,定温(22~25℃)轻摇15min(双链变单链),再加入变性液,轻摇15min。无菌/去离子水冲洗三次。
△ 加入中和液,定温轻摇20min,更换中和液,摇20分钟,无菌/去离子水冲洗2~3次;
△ 加入20×SSC室温轻摇10~20分钟,预渗透凝胶(20×SSC转移中到小分子量;10×SSC转中至大分子量)。 五、制桥与转膜
(带无粉手套,用于20×SSC转移槽,预先用1M NaOH浸泡)
① 剪3层Whatman 3 mm滤纸(长可垂及槽底,宽应比吸光度长0.5cm); ② 用20×SSC浸透,用1M NaOH处理过的玻棒滚动赶走气泡; ③ 在滤纸上加足20×SSC,同时从一边慢慢孔朝下沿与滤纸垂直方向放置凝胶,胶与滤纸边各留0.5cm;
④ 剪宽2cm左右Parafilm,手勿接触,干净面盖胶四周,加样孔可全遮盖,其它边不得遮盖样品。
⑤ 剪与胶大小一样的尼龙膜,去角作标记,沿胶一边向另一边慢慢放尼龙膜
(注意,①不能有气泡,如有,玻棒赶尽;②不能移动)。
⑥ 将2张与膜大小相同的Whatman 3 mm滤纸置20×SSC中湿润,盖在
膜上,排除气泡。
⑦ 滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸(8~10cm),吸水纸上放一块大小适宜的玻璃板,上压0.5kg左右重物(此250g),可用瓶装适量水调整,先轻(200g)后重,过夜。吸水纸可更换。 六、探针标记效果测定
①按下表,分别稀释标记DIG的对照DNA标准(vial 2)和DIG标记的探针。 首先把标准DNA和标记探针稀释到1ng/ul。
管号DNA(ul) 吸取管 (1.5ml) DNA稀释稀释比 buffer(vial 3, ul) 198 35 45 45 45 45 45 50 1:100 1:3.3 1:10 1:10 1:10 1:10 1:10 终浓度 管1 管2 管3 管4 管5 管6 管7 管8 管9 2ul 15 5 5 5 5 5 0 母液 管1(母液) 管2 管2 管3 管4 管5 管6 1ng/ul 10 pg/ul 3 pg/ul 1 pg/ul 0.3 pg/ul 0.1 pg/ul 0.03 pg/ul 0.01 pg/ul 0 ②将两种稀释液混匀后按顺序在尼龙膜上点样(戴手套)
尼龙膜长6cm左右,可在中间用铅笔轻点标记,吸1ul 管2--管9混合液,DNA标准与探针对应点好。稍干后放两张干净滤纸间,120℃烘干30min,放以干净自封袋中,4℃可长期保存。
③将点探针尼龙膜放一尺寸合适的塑料袋中(自封,勿太大),先加20 ml Maleic Acid Buffer,15~25℃轻摇2~5min;
④加入10ml Blocking solution(吸1ml vial 6+ 9ml Maleic Acid Buffer)(vial 6要提前溶解), 室温轻摇30min, 倒掉;
⑤加入10 ml(本试验20 ml )Antibody Solution(用1×blocking Solution,按10ml:2ul vial 4配制),室温轻摇30min, 倒掉;(vial 4用前4℃ 10000rp离心5min,从表面吸);
⑥用10 ml (本试验20 ml)Washing buffer洗膜15min,2次。 ⑦在10 ml(本次20 ml)Detection buffer平衡2-5min。
⑧ 暗配置2ml显色液(Color substrate solution,40 ul NBT/BCIP (vial 5)+2ml Detection buffer)(可多配制10-15ml)。(本次15ml,300 ul NBT+15ml Detection buffer)。
⑨ 倒样⑦中溶液,加入⑧中显色液,赶尽气泡,暗处室温放置,隔30min观察一次,用相机拍照。根据样品与对照同时出现的点,估算标记探针与标准对照的对应浓度,比较效率与对照的百分比。如:
标准对照 标记探针 10 pg/ul 10 pg/ul 同时出现 3 1 0.3 0.1 0.03 3 1 0.3 0.2 0.0 则标记探针是标准对照的1/3。 七、膜固定与预杂交
① 将转DNA膜用镊子(NaOH处理)去除上层滤纸,在膜加样孔处做标记(测距离);(所用的胶要EB染色,以确定是否转膜成功)
② 在2×SSC中慢慢放入再拿出,(在边角点阳性对照如质标),小心放入两层滤纸中120℃烘30min;
③ 预热DIG Easy Hyb granules(vial 7)至42℃,取15 ml加入放膜自
封袋中,42℃轻摇预杂交50 min。
④ 探针变性:100℃加热DIG标记探针5min,迅速放冰上。
⑤ 预热(42℃)DIG easy Hyb granules(vial 7), 加20ml于一新自封袋中,用镊子转膜,加入15ul变性DIG标记探针,混匀,赶尽气泡。)
⑥ 42℃轻摇温育过夜。
八、洗膜(操作过程,转膜要迅速) 1、洗膜(样品面向上)
A:2×SSC+0.1%SDS室温(15-25℃)轻摇洗膜5min,2次; B:0.5×SSC+0.1%SDS 65℃轻摇洗膜15min,洗1次;
C:(G+C含量>40%,探针100%配对)0.3×SSC+0.1%SDS轻摇洗膜(68℃)洗1次15 min;(强洗,降低背景,可再降SSC浓度,但要小心;Antibody是通用的,一是和DIG结合,另一方面带有酶,可发生显色反应)。
九、免疫测定(室温)
①用Washing Buffer (100-200 ml),洗1-5min (膜迅速转入,轻摇); ②在100 ml Blocking solution中轻摇,室温保育1小时(可延长至2小时,降低背景);
③在100 ml Antibody solution ,轻摇室温保育1小时(可延长,多结合); ④用100 ml Washing Buffer轻摇,洗2次各15min; ⑤在60 ml Detection Buffer中平衡2-5min;
⑥配制60 ml Color substrate solution (1.2ml NBT/BCIP+58.8ml Detection Buffer,在超净台上,避光配制);
⑦倒掉⑤中溶液,加入⑥,赶气泡封口,暗处静止放置,过夜。隔60分钟观察一次,相机拍照,尽量减少震动;
⑧终止反应,50mlddH2O或TE Buffer 洗5min。
(如重复利用此膜,用二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide)洗膜,50-60℃,放1小时,直至蓝色消失;ddH2O洗1min,再用stripping Buffer (0.2 M NaOH + 0.1%SDS)洗20min,2次;再用2×SSC洗5min)。
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